Name: Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer de dissectie en immunokleuring van imaginale schijven uit Drosophila melanogaster larven voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek. Deze methode maakt visualisatie van gen- en eiwitexpressie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Donald Ready en Kevin Mozes bedanken voor het onderwijzen van JPK de originele imaginale schijf dissectie procedure. We danken ook Bonnie Weasner voor de genitale schijf in Figuur 1B en het oog schijf in figuur 2A, Brandon Weasner voor Figuur 3, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly vlekken en de Developmental Studies Hybridoma Bank voor antilichamen. CMS is ondersteund door een toelage van de National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), de Frank W. Putnam Research Fellowship, en de Robert Briggs Research Fellowship. JPK wordt ondersteund door een subsidie ​​van de National Eye Institute (R01 EY014863)

1 Voorbereiding van Larven <ol><li> Vul een 35 mm petrischaal met dissectie buffer. </li><li> Plaats larven in petrischaal en hen in staat stellen om rond te zwemmen voor een paar minuten (zelfreinigende stap). </li><li> Transfer larven tot een pool van dissectie buffer op basis van siliconen dissectie plaat. Dit zwembad moet aan de ene rand van de plaat. De dissectie plaat bestaat uit een siliconen oplossing werd gegoten en gehard in een glazen petrischaal. </li><li> Met behulp van een pasteur-pipet, plaats een grotere groep dissectie buffer in het midden van de dissectie plaat. </li><li> Met behulp van # 5 tang, de overdracht van een enkel gereinigd larve uit het kleine zwembad op de grotere pool van dissectie buffer. </li></ol> 2 Grof Dissectie van Larven <ol><li> Terwijl de larve is nog steeds binnen het grote zwembad van dissectie buffer omklemmen de larve met de tang. Een pincet worden gebruikt om de mond haken grijpen terwijl de andere tang wordt gebruikt om de anim houdenal nog (pak de larve zachtjes op 1/3 lichaamslengte). </li><li> Houd stabiliseren de tang met de cuticula bij mondhaken snel trekken terwijl de rest van het lichaam veranderen met het tweede paar pincetten. </li><li> Als de larve begint te scheuren je een lichte versie van de spanning voelen. Laat de larve van de tang en laat voor het &quot;lef&quot; van de larve te morsen. Dit zorgt voor de imaginaire schijven in hun normale conformatie te blijven en voorkomt dat ze worden vervormd. </li><li> Met een pincet grijpen weer de mond haken aan het vooreinde van de larve plaats houden. De andere paar pincetten verwijder de onderste 2/3 van de larven onder de binnenste ingewanden. Let op: een complex met de mond haken, de eye-antennal schijven, hersenhelften, ventrale ganglion, de speekselklieren, wat been schijven, en de bovenliggende opperhuid zal blijven. </li><li> Met een pincet voorzichtig verwijderen bovenliggende opperhuid, speekselklieren, been schijven enander weefsel. Let op: alleen weefsel dat moet blijven is de mond haken, oog-antennale schijven, hersenhelften, en ventrale ganglion (Figuur 3). </li><li> Herhaal stappen 2.1-2.5 met extra larven gedurende 15-20 minuten. Opmerking: denkbeeldige schijven die blijven dissectie buffer voor langere tijd meestal afneemt en uiteindelijk zal als minder dan ideaal specimens worden gefotografeerd. Aldus, na maximaal 20 minuten alle ontlede weefsels worden overgedragen aan de PLP fixatief (zie hieronder). </li></ol> 3 door fixatie en kleuring van weefsel met antilichamen <ol><li> Met behulp van een P-200 pipetman, de overdracht van de ontleed weefsels om een ​​horloge glas met koud Paraformaldehyde-lysine-Periodaatoxidatie (PLP) fixatief. Beperk het volume van de overgedragen dissectie buffer om 50 pi tot verdunning van PLP minimaliseren. Zorg ervoor dat de punt snijden met een scheermesje zodat de tip opening is groot genoeg om de ontleed weefsels tegemoet. Met behulp van een pincet ofEen wolfraam naald toe dat de ontleed weefsel volledig ondergedompeld zodat goede fixatie optreedt. Incubeer ontleed weefsel in koude PLP fixatief 45 minuten. Deze incubatie kan plaatsvinden bij kamertemperatuur zonder roeren. </li><li> Met behulp van een P-200 pipetman, de overdracht van de ontleed weefsels aan buffer te wassen (RT) met een andere gesneden gele punt voor 45 min. Beperk het volume van de overgedragen PLP 50 pi tot verwatering van de wasbuffer minimaliseren. Let op: alle ontleed weefsels moeten volledig worden ondergedompeld. </li><li> Overdracht 20-30 sets van ontleed weefsel tot 1,5 ml microcentrifugebuis. Opmerking: Als grotere aantallen eye-antennaal disc complexen worden gecombineerd in de buis, is er een mogelijkheid dat het weefsel op de bodem van de buis niet correct worden blootgesteld aan de antilichamen. Voor optimale resultaten niet meer dan 20-30 eye-antennaal disc complexen moeten aanwezig zijn binnen een enkele buis. De ontleed weefsel naar de bodem van de microcentrifugebuis. Daarom, in opeenvolgende stappen use een pipetman te verwijderen en te vervangen wasbuffer, het blokkeren van oplossing, en antilichamen. </li><li> Verwijder wasbuffer en vervangen door 100 pl blokkeeroplossing: 10% normaal geit serum in wasbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur met zachte rotatie op een tafelblad rotator gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder het blokkeren oplossing en te vervangen door 100 ul van primaire antilichamen die adequaat werd verdund in 10% normaal geit serum. Incubeer bij kamertemperatuur onder zacht rotatie gedurende 16 uur. </li><li> Verwijder primaire antilichamen en te vervangen door 750 ul wasbuffer. Plaats buisjes op een nutator en laat nutate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Opmerking: Het primaire antilichaam kan worden opgeslagen (opslag bij 4 ° C) en later hergebruikt. Hergebruik antilichamen meerdere keren kan helpen bij het verminderen van niet-specifieke binding. </li><li> Laat hoofden naar de bodem van de buis, verwijder wasbuffer en voeg 100 pl secundaire antilichamen die adequaat werd verdund in 10% normaal serum. Incubeer bij RT met zachte rotatie voor 2̵1, 4 uur. </li><li> Verwijder secundair antilichaam oplossingen van weefsel en vervangen door 500 ui wasbuffer. Laat weefsel naar de bodem van de buis. </li><li> Met behulp van een P-200 en een cut gele tip breng dan ontleed weefsels in een pool wasbuffer die aan de dissectie schotel geplaatst. Terwijl gaan met de volgende stap van fijne dissectie zal het weefsel incuberen in de wasbuffer. Dit helpt om overmaat secundaire antilichamen te verwijderen. </li></ol> 4 Fine Dissectie van Eye-Antennaal Disc Complexen en montage op Slides <ol><li> Gebruik een pincet om de cuticula gesp door de mond haken met de ventrale zijde van het complex naar beneden. Met een tweede tang verwijder de twee hersenkwabben het sluiten van de tweede tang in de ruimte tussen de hersenen en de ogen discs (figuur 3, rode pijl) en snel trekken de hersenen verwijderd uit de mond haken. </li><li> En tegelijkertijd vast te houden aan de mond haken, knijpenhet weefsel zo dicht mogelijk bij de verbinding tussen de antennaal gedeelte van de eye-antennaal disc en de mond haken (figuur 3, blauwe pijl). Let op: de eye-antennal disc complexen moet vrij zijn van alle weefsels (figuur 1A) zijn. Ga door tot alle gewenste weefsel gewenst dat op dia&#39;s kunnen worden geplaatst is ontleed. Dit protocol kan worden aangepast aan de vleugel, haltere, been en genitale verbeelding discs (Figuur 1B-E) isoleren. </li><li> Voeg twee kleine stukjes vloeipapier (grootte van dekglaasjes) ongeveer 3 in. Elkaar op het ontleden schotel. Plaats een glasplaatje op de schotel - de twee stukken vloeipapier moet onder de uiteinden van de schuif. Dit voorkomt dat de glijbaan van het vasthouden aan de siliconen basis van het ontleden schotel. </li><li> Met behulp van een P-20 met een geslepen punt, voeg 9 ul van een anti-bleekmiddel naar het midden van het microscoopglaasje. Dit voorkomt bleken van het weefsel wanneer bekeken met fluorescentelicht. </li><li> Met behulp van dezelfde ongesneden tip, verzamel alle eye-antennal schijven en voeg ze toe aan de daling van de anti-blekingsreagens. Het minimaliseren van de hoeveelheid wasbuffer dat dan wordt uitgevoerd. Probeer de hoeveelheid wasbuffer beperken tot 10 gl of minder. </li><li> Gebruik een pincet om te scheiden en spreiden de eye-antennal schijven binnen de druppel anti-blekingsreagens. Laat discs incuberen in anti-blekingsreagens enkele minuten. NB: Geen duidelijk zal blijken als het weefsel absorbeert de anti-blekingsreagens. </li><li> Met een fijn penseel voorzichtig zakken een dekglaasje op het monster. Dit voorkomt de vorming van luchtbellen. </li><li> WINKEL glijdt bij -20 ° C tot klaar voor het oog-antennaal of andere imaginaire discs met licht of fluorescentiemicroscopie bekijken. </li></ol>

<ol><li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria%5BTitle%5D)+AND+%22Zeit.+Wiss.+Zool%22%5BJournal%5D)">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.</li>
<li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22Imaginal+disc+development%22">Imaginal disc development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).</li>
<li>Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LI+%22Developmental+and+Cell+Biology+Series%22">Developmental and Cell Biology Series</a>. 39, Cambridge Press. 460(2002).</li>
<li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Linn.+Soc.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.</li>
<li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li>
<li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Entomol.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li>
<li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage%2C+growth%2C+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).</li>
<li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster%3A+morphogenesis%2C+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).</li>
<li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+polyclones+in+insect+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li>
<li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li>
<li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archive%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My+what+big+eyes+you+have%3A+how+the+Drosophila+retina+grows%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li>
<li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li>
<li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li>
<li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3%27+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li>
<li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li>
<li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li>
<li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li>
<li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless%2FPax6+to+control+eye+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hoewel deze procedure is grotendeels gericht op de isolatie en daaropvolgende behandeling van oog-antennaal discs, het gemakkelijk kan worden gebruikt voor het isoleren en analyseren van de vleugel, haltere, been en genitale discs (figuur 4). De enige vereiste wijziging van het protocol voor het isoleren van deze schijven (in tegenstelling tot de eye-antennal disc) is de methode van grove dissectie (deel 2 van het protocol). De eerste thoracale been (T1) pair is te vinden op de voorste van de larve en k...

Al meer dan een eeuw de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een van de beste systeem om de ontwikkeling, het gedrag en de fysiologie te bestuderen geweest. Ontwikkeling in de vlieg kan worden onderverdeeld in twee grote fasen: de embryonale en post-embryonale met veel van deze laatste hebben binnen monolaag epithelia genoemd imaginaire schijven 1-3. Tekeningen van imaginaire schijven werden voor het eerst gepubliceerd in 1864 door August Weismann, als onderdeel van zijn brede monografie over insecten ontwikkeling 1. Deze schijven beginnen hun ontwikkeling tijdens de embryogenese, worden gevormd tijdens de larvale stadia, overleef de massale histolysis van de vroege stadia popstadium en uiteindelijk leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die binnen de volwassen vliegen 1-14. Tijdens de ontwikkeling van de larven elke schijf maakt een aantal belangrijke beslissingen met betrekking tot het lot, vorm en grootte. Binnen de eerste en tweede larvale stadia, worden de schijven belast met de vaststelling van een primaire lot, establishing compartiment grenzen, de vaststelling van de juiste vorm en het genereren van de benodigde aantal cellen 15-16. Tijdens het derde larvale instar en vroege pre-popstadium, de imaginaire schijven blijven delen en zijn patroon als cellen hun terminal lot 16 vast te stellen. Tijdens de vroege geschiedenis van Drosophila ontwikkelingsbiologie, werden imaginal schijven vrijwel uitsluitend onderzocht in het kader van de normale ontwikkeling en in de beperkte gevallen waarin een verlies of winst-of-function mutant levensvatbaar was. Het gebruik van X-stralen induceren mitotische recombinatie toegestaan ​​letale mutaties in celklonen binnen de larven en volwassen weefsels te analyseren. Deze werkwijze is verbeterd door de introductie van transgene methoden verlies analyseren en gain-of-function mutaties in zowel larven en volwassen weefsels. Het aantal antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit vallen voor het beschrijven van de moleculaire landschap van wild-type en mutante weefsels is ook constantly groeien. Met deze moleculaire merkers verlies analyseren en gain-of-function mutante celklonen is het steeds mogelijk om een ​​real-time begrijpen hoe mutantcellen afwijken van hun wildtype neven tijdens ontwikkeling krijgen. Om goed gebruik maken van deze instrumenten en reagentia is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit van de voorbereidingen imaginal schijven die kunnen worden bekeken, gefotografeerd en geanalyseerd hebben. Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en de voorbereiding van de eye-antennaal schijf complex (Figuur 1A) te verstrekken. Het kan ook met succes worden gebruikt om een groot aantal extra schijven zoals die welke tot de vleugels, halters, T1-T3 benen en genitaliën (Figuur 1B-E) te isoleren. Deze procedure, met kleine aanpassingen is gebruikt om imaginal discs isoleren van Drosophila bijna tachtig jaren. Zoals hierboven beschreven, aangezien de meeste genen die tijdens multiple ontwikkelingsstadia en in een veelheid van weefsels, is het vaak onmogelijk om de effecten te onderzoeken die null-mutanten op het hele oog als het dier sterft ruim voor het derde instar larvale stadium. Vier methoden hebben de studie van de meer ontwikkelde weefsels gemaakt, zoals het netvlies significant meer handelbaar. De eerste is de methode flippase (FLP) / flippase Recombinatie Target (FRT) genereren mutante cel klonen in een overigens wildtype weefsel 17-19. In dit geval de mutant weefsel wordt geïdentificeerd door de afwezigheid van een markering zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en kan worden vergeleken met de omringende wildtype weefsel waarin GFP aanwezig is (figuur 2D). De tweede is de &quot;FLP-out&quot; werkwijze waarbij een transgen tot expressie wordt gebracht in een populatie van cellen 20. In dit geval de cel klonen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP reporter mist (figuur2E). De derde is de Mosaic-analyse met een onderdrukbare Cell Marker (MARCM) techniek, die elementen van de FLP / FRT mutant kloon en FLP-out expressie systemen 21 combineert. Met deze methode een transgen kan worden uitgedrukt in een populatie van cellen die tegelijkertijd mutant voor individuele genetische locus. Like flp-out klonen worden MARCM klonen geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP merker (figuur 2F) mist. Tenslotte, de genen en RNAi constructen kunnen worden die binnen imaginaire weefsels onder controle van promotor-GAL4 constructen. Deze vier methoden hebben de belangstelling voor het bestuderen denkbeeldige schijven toegenomen sinds mutant en overexpressie klonen of direct kunnen worden vergeleken met aangrenzende wildtype weefsel. Werkwijze in deze procedure wordt beschreven is ontwikkeld om onderzoekers die de post-embryonale ontwikkeling van volwassen weefsels in Drosophila bestuderenname afkomstig uit de oog-antennaal disc, kunnen hoge kwaliteit weefsel te verkrijgen voor analyse. Hoewel individuele onderzoekers lichte wijzigingen hebben gemaakt, heeft de kern van deze procedure (die we hier beschrijven) grotendeels onveranderd gebleven. Na het behalen van hoge kwaliteit weefsel is van cruciaal belang voor de studie van de imaginaire schijven we hopen dat dit schriftelijk protocol en de bijbehorende video zal dienen als een waardevol leermiddel.

```html
<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 KG</td><td>Wordt gebruikt om de basis voor de dissectieplaat te maken</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Gebruik de deksel voor de dissectieplaat</td></tr><tr><td>#5 Dissecting Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>De pincetten moeten erg scherp worden gehouden</td></tr><tr><td>9 well watch glass</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>Wordt gebruikt voor het fixeren van imaginaire schijfcomplexen</td></tr><tr><td>50 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Stir Bar</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Klein genoeg om in de Erlenmeyer Flask te passen</td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Duidelijk of donker, afhankelijk van de toepassing</td></tr><tr><td>Microfuge Rack</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Rotator</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>100 &#956;l volume mag niet spatten op lage instelling</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Dient als fixeermiddel</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Wordt gebruikt om dissectie- en spoelbuffers te maken</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Wordt gebruikt om dissectie- en spoelbuffers te maken</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Wordt gebruikt in de fixeeroplossing</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Wordt gebruikt in de fixeeroplossing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Wordt gebruikt om imaginaire schijven te perforeren</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Wordt gebruikt om paraformaldehyde op te lossen</td></tr><tr><td>100% Normal Goat Serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Dient als blokkeringsoplossing</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Verdun in 10% geitenserum zoals aangegeven door de fabrikant</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Verdun in 10% geitenserum zoals aangegeven door de fabrikant</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molecular Probes</td><td>H-1000</td><td>Voorkomt verbleken van monsters</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glass Cover Slips 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Voorkomt dat glazen platen aan de siliconen basis blijven plakken</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Gebruik om de dekglas voorzichtig op de monsters te leggen</td></tr></tbody></table>
```

dissectie en immunokleuring van imaginal schijven uit drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Een aanzienlijk deel van de post-embryonale ontwikkeling in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, plaatsvindt binnen een set van sac-achtige structuren, genaamd imaginaire schijven. Deze schijven leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die worden gevonden in de volwassen vlieg. Hier een protocol dat is geoptimaliseerd om deze schijven te herstellen en hen voor te bereiden voor analyse met antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit valkuilen beschrijven we. Deze procedure is vooral geschikt voor dunne weefsels zoals imaginal schijven, maar kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de hersenen larven en volwassen eierstok. Het schriftelijk protocol en bijbehorende video zal de lezer / kijker te begeleiden bij de dissectie van derde instar larven, fixatie van het weefsel, en de behandeling van imaginaire schijven met antilichamen. Het protocol kan worden gebruikt om imaginal discs ontleden van larven jonger eerste en tweede instar ook. Het voordeel van dit protocol is dat het relatief kort en heeft zijnen geoptimaliseerd voor de hoge kwaliteit behoud van ontleed weefsel. Een ander voordeel is dat de fixatie procedure die wordt toegepast werkt goed met het overgrote aantal antilichamen dat Drosophila eiwitten herkennen. In onze ervaring, is er een zeer klein aantal gevoelige antilichamen die niet goed werken met deze procedure. In deze situaties, lijkt de oplossing te zijn om een ​​alternatieve fixatie cocktail te gebruiken terwijl u de richtlijnen die wij hebben toegelicht voor de dissectie stappen en antilichaam incubatie volgen.

De methode die hiervoor betrouwbaar wordt beschreven produceert hoogwaardige materiaal voor analyse met in situ sondes, transcriptie verslaggevers, eiwit vallen en antilichamen. In figuur 1 geven we oog-antenne, genitale, vleugel, haltere en been schijven die routinematig worden hersteld met deze methode. Deze schijven werden behandeld met een falloïdine-geconjugeerd fluorofoor, dat bindt aan F-actine en derhalve schetst elke cel. Wanneer het weefsel is goed dan vastgestelde morfogenetische gro...

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Het algemene doel van deze procedure is om imaginaire schijven uit drosophila-larven te dissecteren Voor immunohistologie wordt dit bereikt door eerst het hoofdcomplex, bestaande uit mond, haken, oog en tenal-schijven en hersenen, uit de larven te verwijderen. De tweede stap is om het hoofdcomplex te fixeren en het te incuberen met primaire en secundaire antilichamen. Vervolgens worden de oog- en tenal-schijven van het hoofdcomplex gescheiden.De laatste stap is om de imaginaire schijven in een anti-bleekmiddel op een glasplaatje te monteren. Uiteindelijk kunnen fluorescente of LAC Z-reporters en antilichaamkleuring de ruimtelijke en temporele expressie van genen en eiwitten binnen de imaginaire weefsels onthullen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt om inzicht te geven in de lokalisatie van genen en eiwitten in de enten-imaginale schijf.Het kan ook worden toegepast op andere imaginaire weefsels, zoals de vleugelpoot en halt.Hier. Om het experiment te beginnen, vult u een 35 millimeter Petri-schaal met dissectiebuffer. Plaats 10 tot 20 larven in de Petri-schaal en laat ze vijf minuten rondzwemmen.Om zelf schoon te maken met een plaag, maa

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol laat de dissectie techniek die wordt gebruikt voor het isoleren van verbeelding schijven van Drosophila larven in de 3e instar stadium. Methoden voor de vaststelling van het weefsel na het zeggen en het verwijderen van de vleugel, poot, en ogen schijven worden gedemonstreerd direct op een objectglaasje voor verdere visualisatie.

Dissectie van de imaginaire Discs uit 3e Instar Drosophila Larven

Beschrijven we een nieuw rood fluorescerend eiwit (RFP) reporter dat specifiek wordt uitgedrukt in...

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netvliezen

Bij het kleuren van Drosophila imaginal schijven, vaak een ruwe dissectie wordt uitgevoerd waar de schijven worden blootgesteld, maar blijven bevestigd aan het lichaam. Eenmaal bevlekt, worden de schijven van belang geïsoleerd en gemonteerd. Het voorbeeldprotocol demonstreert een procedure voor vleugel imaginaire schijfdissectie en montage.

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissectie: Een methode om de ontwikkeling van Epithelia te observeren

Het doel van deze techniek is om onderzoekers in staat te stellen dissectie, immunokleuring en montage van poppenoogschijfjes uit Drosophila melanogaster van elke leeftijd uit te voeren.

Dissectie en Plaatsing van<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer de dissectie en immunokleuring van imaginale schijven uit Drosophila melanogaster larven voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek. Deze methode maakt visualisatie van gen- en eiwitexpressie mogelijk.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen