Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster
20 september 2014
De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om imaginaire schijven uit drosophila-larven te dissecteren Voor immunohistologie wordt dit bereikt door eerst het hoofdcomplex, bestaande uit mond, haken, oog en tenal-schijven en hersenen, uit de larven te verwijderen. De tweede stap is om het hoofdcomplex te fixeren en het te incuberen met primaire en secundaire antilichamen. Vervolgens worden de oog- en tenal-schijven van het hoofdcomplex gescheiden.
De laatste stap is om de imaginaire schijven in een anti-bleekmiddel op een glasplaatje te monteren. Uiteindelijk kunnen fluorescente of LAC Z-reporters en antilichaamkleuring de ruimtelijke en temporele expressie van genen en eiwitten binnen de imaginaire weefsels onthullen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt om inzicht te geven in de lokalisatie van genen en eiwitten in de enten-imaginale schijf.
Het kan ook worden toegepast op andere imaginaire weefsels, zoals de vleugelpoot en halt.Hier. Om het experiment te beginnen, vult u een 35 millimeter Petri-schaal met dissectiebuffer. Plaats 10 tot 20 larven in de Petri-schaal en laat ze vijf minuten rondzwemmen.
Om zelf schoon te maken met een plaag, maak met je pipet één grote plas dissectiebuffer in het midden van een siliconen dissectieplaat. Plaats drie kleinere plassen rond de grote plas en gebruik een tang om de larven over te brengen naar de onderste plas. Vervolgens, met behulp van nummer vijf tang, brengt u een enkele schoongemaakte larve van de kleine plas over naar de grotere plas dissectiebuffer.
Om met grove dissectie te beginnen, gebruikt u een paar tangen om de mondhaken vast te pakken en het andere paar tangen om de larve voorzichtig vast te pakken. Bij een derde van zijn lichaamslengte houdt u de mondhaak vast. Trek snel met een tweede paar tangen de rest van het lichaam weg.
Laat de larve los van de tang en laat de ingewanden uitlekken, waardoor de imaginaire schijven in hun normale vorm blijven. Grijp vervolgens de mondhaken en gebruik het andere paar tangen om de onderste twee derden van de larve te verwijderen, inclusief de ingewanden. Verwijder vervolgens voorzichtig de speekselklieren, pootschijven en ander weefsel.
De enige weefsels die over moeten blijven zijn een kleine hoeveelheid overliggende cuticula. De mondhaken, oog en tenal-schijven, hersenhelften en ventraal ganglion. Na maximaal 20 minuten brengt u alle gedissekteerde weefsels over naar de paraform aldehyde lysine pariah.
Date fixatief of PLP. Laat de imaginaire schijven niet langer dan 20 minuten in het dissectiebuffer zitten, anders zullen ze na de dissectie degraderen. Breng de gedissekteerde weefsels in stapsgewijze hoeveelheden van 100 microliter over in een kijkglas met koud PLP.
Gebruik een tang om ervoor te zorgen dat de gedissekteerde weefsels volledig ondergedompeld zijn. Incubeer de gedissekteerde weefsels in koud PLP-fixatief gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur zonder roeren. Breng vervolgens 100 microliter van de gedissekteerde weefsels van PLP over naar wasbuffer.
Zorg ervoor dat de weefsels volledig ondergedompeld zijn en incubeer ze gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur zonder roeren. Breng vervolgens de gedissekteerde weefsels over naar een microfugebuisje van 1,5 milliliter. Verwijder de wasbuffer en vervang deze door 100 microliter blokkeeroplossing.
Incubeer de weefsels bij kamertemperatuur met zachte rotatie op een tafelbladrotator gedurende 10 minuten. Na het blokkeren verwijdert u de oplossing en vervangt u deze door 100 microliter primaire antilichaamoplossing in 10% normaal geitenserum. Incubeer de weefsels bij kamertemperatuur met zachte rotatie gedurende 16 uur, afhankelijk van de sterkte van het antilichaam.
Verwijder vervolgens het primaire antilichaam en vervang het door 750 microliter wasbuffer. Plaats de buis op een mutator bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verwijder de buis uit de mutator en laat de koppen naar de bodem van de buis zakken.
Verwijder vervolgens de wasbuffer en voeg 100 microliter secundaire antilichaamoplossing toe in 10% normaal serum. Incubeer de buis bij kamertemperatuur met zachte rotatie gedurende ten minste twee uur, afhankelijk van de sterkte van het antilichaam. Na incubatie verwijdert u de secundaire antilichaamoplossing uit het weefsel.
Vervang het door 500 microliter wasbuffer en laat het weefsel naar de bodem van de buis zakken. Plaats drie pools wasbuffer op een siliconen dissectieplaat. Breng alle gedissekteerde weefsels over naar de grote pool wasbuffer die op de dissectiedisch is geplaatst.
Dit helpt om overtollige secundaire antilichamen te verwijderen. Om met fijne dissectie te beginnen, plaatst u het hoofdcomplex met de ventrale kant naar beneden en klemt u de cuticula vast met de mondhaken. Plaats een tweede paar tangen in de ruimte tussen de hersenen en oogschijven en trekt snel de hersenen weg van de mondhaken om de twee hersenkwabben te verwijderen terwijl u de mondhaken vasthoudt. Knijp het weefsel zo dicht mogelijk bij de verbinding tussen het antennegedeelte van de ogenantenne-schijf en de mondhaak af.
Ga door totdat al het gewenste weefsel is gedissecteerd. Voeg vervolgens twee kleine stukjes tissuepapier van de grootte van dekglasjes toe, drie centimeter uit elkaar op de dissectiedisch. Plaats een glasplaatje op deze stukjes papier om te voorkomen dat het plaatje aan de siliconenbasis van de dissectiedisch kleeft.
Gebruik een P 20 pipetteermen om negen microliter anti-bleekmiddel toe te voegen aan het midden van het glasmicroscoopglaasje om fluorescente lichtbleking van het weefsel te voorkomen. Met dezelfde ongesneden punt verzamelt u alle I en tenal-schijven en voegt u ze toe aan de druppel anti-bleekreagens. Gebruik vervolgens een tang om de oog- en tenal-schijven binnen de druppel anti-bleekreagens te scheiden en uit te spreiden totdat geen enkele imaginaire schijf elkaar raakt. Gebruik een fijne ver
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de dissectie van imaginale schijven uit Drosophila-larven voor immunohistochemie. Het benadrukt het belang van imaginale schijven voor het begrijpen van ontwikkelingsprocessen en genexpressie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
Achtergrond
- Imaginale schijven zijn zakvormige structuren in Drosophila die de basis vormen voor volwassen structuren.
- Ze zijn cruciaal voor het bestuderen van weefseldeterminatie en celnoodbepaling.
- Het begrijpen van deze processen kan inzicht bieden in bredere biologische mechanismen.
- Fluorescentiemicroscopie is een sleuteltechniek die wordt gebruikt om gen- en eiwitexpressie te visualiseren.
Doel van de studie
- Om imaginale schijven te dissekeren voor analyse van gen- en eiwitlokalisatie.
- Om immunohistochemie te gebruiken voor het bestuderen van ruimtelijke en temporele expressiepatronen.
- Om het begrip van ontwikkelingsprocessen bij Drosophila te verdiepen.
Gebruikte methoden
- Dissectie van Drosophila-larven om het hoofdcomplex te verwijderen.
- Fixatie van het hoofdcomplex en incubatie met antilichamen.
- Scheiding van de oog- en antennediscs van het hoofdcomplex.
- Montage van imaginale discs op objectglazen voor microscopie.
Belangrijkste Resultaten
- Fluorescerende reporters maken gen- en eiwitexpressie in imaginale weefsels zichtbaar.
- Immunohistochemie maakt gedetailleerde visualisatie van ontwikkelingsprocessen mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen studies naar weefselontwikkeling en -organisatie informeren.
- De methodologie kan worden toegepast op diverse imaginale schijven voor comparatieve analyse.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van imaginale schijven.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de ontwikkelingsbiologie bij Drosophila.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze technieken om andere aspecten van de ontwikkeling te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol maakt hoogwaardige visualisatie van gen- en eiwitexpressie in imaginale schijven van Drosophila mogelijk, wat doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door reproduceerbare weefselpreparatie voor immunohistochemie te bieden, vergroot het het voorspellend vertrouwen in ontwikkelingsbiologische studies die relevant zijn voor menselijke ziektemodellering. De compatibiliteit van de methode met een breed scala aan antilichamen en de aanpasbaarheid aan dikkere weefsels, zoals het larvale brein, vergroot de bruikbaarheid binnen diverse R&D-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via ruimtelijke en temporele eiwitlokalisatie in ontwikkelende weefsels.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door de weefselintegriteit te behouden voor antilichaamgebaseerde detectie van ziekterelateerde pathways.
- Predictieve waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door visualisatie van genexpressiedynamiek die cruciaal is voor de beoordeling van de target-betrouwbaarheid.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door consistente weefselfixatie en antigeenbehoud te waarborgen.
- Operationele waarde: Bevordert assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door geoptimaliseerde dissectie- en fixatieprotocollen.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk via hoogwaardige immunokleuring die compatibel is met fluorescentiemicroscopie-uitlezingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt ziekterelateerde systeemmodellering door analyse mogelijk te maken van geconserveerde ontwikkelingspaden in Drosophila.
- Mechanistisch inzicht: Biedt voorspellende waarde voor risicoreductie door clonale expressieanalyse en visualisatie van reportergenen in imaginale weefsels.
- Preklinische afstemming: Verbindt bevindingen uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via gestandaardiseerde immunohistochemische workflows.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses tot de identificatie van leads, ter ondersteuning van biologische risicoreductie en pathway-verduidelijking voorafgaand aan compound-screening.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking mogelijk door middel van precieze lokalisatie van genen en eiwitten in ontwikkelende weefsels.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en kwantitatieve output via gestandaardiseerde weefselpreparatie die compatibel is met antilichaam- en reporterdetectie.
- Analytica: Genereert spatiale en temporele expressiemetingen die vergelijkende analyse mogelijk maken tussen genetische of experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door visualisatie mogelijk te maken van geconserveerde ontwikkelingsprocessen die relevant zijn voor menselijke ziektegezorgmodellen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor projecten die hoge-resolutie weefselbeeldvorming vereisen voor targetvalidatie.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in ontwikkelingspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van immunohistochemische workflows over verschillende modelsystemen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare ruimtelijke expressiedata te leveren die het biologische risico in een laat stadium verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk via een objectieve, op visualisatie gebaseerde beoordeling van target-engagement en padmodulatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, dissectietechnieken en immunohistochemie-protocollen.
- Afhankelijk van instrumentarium, waaronder dissectiemicroscopen, fluorescentiemicroscopen en temperatuurgecontroleerde incubatieapparatuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams van fixatie-, blokkerings- en antilichaamincubatiecondities voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpasbaar voor dikkere weefsels, zoals het larvale brein en de volwassen ovaria, met protocolwijzigingen zoals vermeld in de bron.
- Beperkt door de gevoeligheid van antilichamen voor fixatiecondities, waarbij alternatieve fixatiecocktails worden aanbevolen voor gevoelige antilichamen.
Biofarmaceutische veelgestelde vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Preparation of Larvae
2:08
Coarse Dissection of Larvae
3:30
Fixation and Staining of Tissue with Antibodies
6:17
Fine Dissection of Eye-Antennal Disc Complexes and Mounting
8:11
Results: Dynamic Images Produced for In-depth Analysis
9:39
Conclusion
