Name: 3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Leer 3D-orbitaal volgen van lysosomen in levende cellen met een gemodificeerde twee-foton microscoop. Deze methode maakt hoge-snelheids tracking van organdynamica en interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door subsidies NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 en P50-GM076516

1 Monstervoorbereiding <ol><li> Aanvullen CHOK1 cellen in weefselkweek kolven met DMEM aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 100 IU / ml penicilline 50 ug / ml streptomycine. Incubeer de cellen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li><li> Oogst en plaat CHOK1 cellen op een 14 mm diameter micro-goed met een oppervlak dikte van 0,16 mm. Zaad cellen voor optimale dichtheid voor imaging, rond 60-70% samenvloeiing. </li><li> Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C, 5% CO2. Was de cellen drie keer in HBSS (Hank gebufferde zoutoplossing) en incubeer cellen in een oplossing die 50 nM Lysotracker DND26 groene en 150 nM van tubuline tracker green. Incubeer cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Optionele stap: Vóór incubatie uitvoeren tegen vlek met een mitochondriale matrix kleuring kleurstof (25 nM). </li><li> Was de cellen drie keer in HBSS aan een ongebonden kleurstof te verwijderen. Voeg verse DMEM groeimedium voorafgaand aan IMAGing van de cellen. </li></ol> 2 Microscoop configuraties De microscoop voor het deeltje volgen in de video protocol beschreven is gemonteerd op het frame van een commercieel beschikbare omgekeerde microscoop (figuur 4). Echter commerciële modules 3D orbitale deeltjes volgen zijn nu beschikbaar. <ol><li> Gebruik een Coherent Kameleon-Ultra II Ti: Sa femtosecondlaser excitatielichtbron, met een instelbare uitgang in het golflengtegebied tussen 690 nm-1040 nm. </li><li> Zorg ervoor dat de laserstraal wordt uitgelijnd in de achterkant haven van de microscoop met IR-gecoate spiegels. De laserstraal wordt verzwakt met draaibare halvegolflengteplaat gevolgd door een lineaire polarisator calciet. Dempen van de balk, zodat het gemiddelde vermogen van het monster tussen 0,5 en 2 mW. OPMERKING: De laserbundel wordt gereflecteerd door een paar galvanometer-motor aangedreven spiegels die de controle van de positie en de baan van de gefocusseerde bundel op het monstervlak mogelijk. In eentypische configuratie de gecollimeerde laserbundel verlaten van de galvanometer spiegels wordt geëxpandeerd (10X) die door een bundelexpander, voordat de achterzijde van het microscoopobjectief na reflectie voor kort door dichroïsche spiegel. </li><li> Verzamel het fluorescentielicht van het monster door een hoge numerieke apertuur water doelstelling (60x NA 1,2) in de lichtweg. Kies een fluorescentie-filter blok volgens de gewenste emissiegolflengte in een of twee kanaalconfiguratie. Tewerk emissie banddoorlaatfilters verder selecteren spectrale bereik van de uitgestraalde fluorescentie. </li><li> Plaats het monster op een gemotoriseerde podium, en de fijne bewegingen van de microscoop objectief met behulp van een objectieve piëzo-controller aan te passen. </li><li> Direct het licht van de filter kubus in fotomultiplicatorbuizen waar het signaal wordt onderscheiden en naar een digitale I / O data acquisitie kaart. OPMERKING: De computer produceerde golfvormen zijn de analoge uitgang van de I / O-kaart en zijn provided aan de scanners elektronica. De foton telingang van de fotomultipliers en het uitgangssignaal de scanners worden gemeten en bestuurd via de I / O-kaart door het Laboratorium voor fluorescentie SimFCS Dynamics software. </li></ol> 3 Imaging <ol><li> Plaats de cellen op het podium en scherpstellen met doorvallende licht. </li><li> Schakel over naar rasterscan beeldvorming om de cellen die de kleurstof hebben opgenomen te identificeren en de onderliggende microtubuli visualiseren. Identificeer het eerste gebied waar blaasje beweging aanwezig is. </li><li> Zodra een geïsoleerde blaasje wordt geïdentificeerd, stelt u de volgende parameters voor orbitale volgen: <ol><li> Selecteer de straal van de baan om de grootte van de circulaire scan volgens de grootte van het deeltje wordt bijgehouden definiëren. Voor een punt emitter stelt de straal van de baan gelijk is aan de taille van de puntspreidingsfunctie (PSF) van de activeringsbundel gevoeligheid en respons te verhogen. </li><li> Stel de axialeom de afstand tussen de twee banen die zijn uitgevoerd om het deeltje positie langs de axiale richting lokaliseren definiëren. Stel de axiale afstand tot 1,5-3 maal de PSF taille. </li><li> Definieer de verblijftijd op basis van de helderheid van het deeltje naar de tijd besteed aan elk punt van de baan, die ook de foto-bleken rate zal bepalen stellen. Gebruik een verblijftijd tussen 10-100 msec. </li><li> Stel het aantal punten in elke baan tot 64 of 128 tot periodes baan op in de orde van 4-32 msec en bieden een hoge temporele resolutie voor het bepalen van het deeltje positie. </li></ol></li><li> Wijzig de DC offset signaal naar de spiegels om de bundel op het deeltje te centreren door de grafische user interface via een cursor selectie in beeld-raster gescand. </li><li> Begin het bijhouden door het schakelen van de microscoop modus van raster-imaging aan orbitale scannen. </li><li> Activeer de feedback en het verzamelen van gegevens. </li></ol> 4 Trajectheugen Analyse <ol><li> Gebruik de programmatuur aan die bij ieder punt langs de baan en op elk tijdstip in de vorm van een &quot;intensiteit carpet &#39;fluorescentie geven. De langs het tapijt verzameld intensiteit geeft informatie over de interactie van het deeltje met andere heldere objecten. Gebruik de software om zowel het traject gegevens (tijd van de x, y scanners en de z -piezo namelijk de DC-verschuiving) en de fluorescentie-intensiteit vanuit het fotovermenigvuldigingsbuis tijd in de vorm van tijdreeksen weergegeven. </li><li> Gebruik de tijdreeksen vertegenwoordiging en de &#39;intensiteit tapijt&#39; informatie om slechts een regio van belang in het traject te kiezen. </li><li> Gebruik de software om een ​​2D-projectie van de gekozen deel van het partikeltraject geven. Selecteer de juiste controles om de kleur-code het traject volgens het deeltje fluorescentie-intensiteit. </li><li> Selecteer de optie voor het weergeven partikel traject in 3D, en de kleur-code is volgens de fluorescentie-intensiteit. Draai het traject in 3D met behulp van de knoppen aan de kenmerken van het lysosoom beweging langs de microtubuli te visualiseren. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ondanks de enorme vooruitgang van fluorescentiemicroscopie technieken en instrumentatie in de afgelopen jaren, bereiken banen van fluorescerende deeltjes in drie dimensies met een hoge tijdsresolutie is een uitdaging in het veld blijft. Indien hoge tijdsresolutie is tracking-deeltjes bereikt in twee dimensies, verlenging van de axiale richting brengt typisch een drastische vermindering van de frequentierespons van het systeem 10. In deze video-protocol hebben we binnen de demonstr...

Een groot aantal benaderingen ontwikkeld om datum fluorescerende deeltjes sporen in drie dimensies met behulp van een microscoop. De meeste benaderingen afhankelijk van het gebruik van snelle camera ideaal te sporen in twee dimensies, meestal in combinatie met aangepaste wijzigingen van de emissie optiek van de microscoop volgen verwezenlijking in de axiale richting. Laser scanning microscopen (hetzij confocale of twee fotonen) gewoonlijk een fluorescerend deeltje door het uitvoeren van een tijdsvolgorde van z-stacks volgen, hoewel dit proces typisch tijdrovend en levert redelijk tijdsresolutie (10 Hz) indien het deeltje wordt bijgehouden is in het centrum van een raster imaging gebied gehouden door actief terugkoppelingsmechanisme 2. Het idee van vast blijven zitten aan het deeltje is de basis van de orbitale volgmethode. In plaats van een raster scan een cirkelbaan wordt uitgevoerd rond de fluorescerende deeltjes. De intensiteit van de fluorescentie langsde baan nauwkeurig lokaliseert het deeltje positie 4. De gelokaliseerde positie van het deeltje kan dan worden gebruikt om de microscoop scanners en re-center de baan van het deeltje stand bedienen. De galvanometer scanners van de microscoop worden aangedreven door een analoge spanning. De AC component van deze spanning maakt het uitvoeren van een baan met de gefocusseerde laserbundel, bijvoorbeeld een sinus en cosinus golf toegepast op de X en Y aftastspiegels zal uitvoeren een cirkelbaan. De DC offset van het signaal vergemakkelijkt de positie van de baan centrum. Zodra een baan periode wordt vastgesteld en de golfvorm van het AC-signaal is geconfigureerd, het feedback systeem moet alleen de DC-component van het signaal werken. Een software kan het fluorescerende signaal vanuit het detectors lezen moet de scanners en de detectoren controleren, om de positie van het deeltje berekenen en actualiseren de DC offingesteld. Voor een succesvolle feedback afbeelden van een zorgvuldige keuze van de baan parameters (grootte en timing) vereist en deze parameters moeten worden aangepast op basis van de eigenschappen van de fluorescerende deeltjes die het noodzakelijk volgen is. De fysische en wiskundige fundamenten van de techniek werden in het verleden 4,5 beschreven voor zowel 2D-en 3D-toepassingen. In dit protocol beschrijven we kort de belangrijkste hardware componenten van de installatie, en in meer detail de keuze van de parameters en het monster voorbereiding die nodig is voor een typisch experiment waardoor we na de verplaatsing van een lysosoom bij een hoge temporele resolutie binnen een levende cel.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-motor mirror</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition card</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LFD</td><td>Global for images-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Het doel van deze video protocol te bespreken hoe uitvoeren en analyseren van een driedimensionaal fluorescerende orbitale particle tracking-experiment met een aangepaste twee-foton microscoop 1. In tegenstelling tot conventionele benaderingen (raster scan of brede veld op basis van een stapel van frames), de 3D-orbitale tracking kan lokaliseren en te volgen met een hoge ruimtelijke (10 nauwkeurigheid nm) en temporele resolutie (50 Hz frequentierespons) de 3D-verplaatsing van een bewegende fluorescerende deeltjes op lengteschalen van honderden micron 2. De methode is gebaseerd op een terugkoppelalgoritme dat de hardware van een twee-foton laser scanning microscoop om een ​​cirkelbaan uitvoeren rond het object besturingselementen worden gevolgd: het terugkoppelingsmechanisme de fluorescerende voorwerp in het midden te bewerkstelligen door de verplaatsing van de aftastbundel 3-5. Om de voordelen van deze techniek tonen, volgden wij een snel bewegende organel, het lysosoom, in aliving cel 6,7. Cellen werden volgens standaardprotocollen, en gekleurd met een commercieel lysosoom kleurstof. We bespreken kort de hardwareconfiguratie en gedetailleerder de besturingssoftware, een 3D orbitale tracking-experiment uitgevoerd in levende cellen. We bespreken in detail de parameters vereist om de scanning microscoop bedienen en kan de beweging van de bundel in een gesloten baan rond de deeltjes. We slot tonen hoe deze werkwijze effectief kan worden gebruikt om de snelle beweging van een gemerkt lysosoom langs microtubules in 3D spoor binnen een levende cel. Lysosomen kan bewegen met een snelheid in het bereik van 0,4-0,5 um / sec, kenmerkend weergeven van een gerichte beweging langs het microtubule netwerk 8.

Volgens dit protocol snel 3D deeltje volgen kan worden uitgevoerd in levende cellen met een gemodificeerd twee-foton microscoop om de verplaatsing van fluorescent gelabelde lysosomen volgen. Het experiment uitgevoerd bestaat uit het volgen een geïsoleerde lysosoom verplaatsen in de cel na het endosoom rijpingsproces 9. De lysosomen werden gekleurd met een fluorescerende groene kleurstof en opgewonden bij 930 nm benutten 2-foton excitatie. Onze gegevens tonen aan dat het mogelijk is om x, y, z verplaa...

In dit videoprotocol volgen we - met hoge snelheid en in drie dimensies - fluorescent gelabelde lysosomen in levende cellen, met behulp van de orbitale volgmethode in een aangepaste twee-foton microscoop.

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Het algemene doel van deze procedure is om te illustreren hoe snel bewegende organellen, zoals lysosomen, in 3D binnen een levende cel kunnen worden gevolgd. Dit wordt bereikt door eerst de lysosomen en de microtubuli te kleuren met behulp van specifieke commerciële kleurstoffen in gekweekte levende cellen. De tweede stap is het gebruik van een laserscanningmicroscoop en het gebruik van de orbitale trackingmethode om de lysosomebeweging met hoge snelheid te volgen, waarbij de grootte van de baan en andere parameters, zoals de frequentierespons van het systeem, worden geselecteerd om trackingexperimenten uit te voeren.Uiteindelijk laten de resultaten zien dat het mogelijk is om snel bewegende lysosomen in drie dimensies te volgen en interacties te detecteren met andere fluorescent gekleurde organellen die tijdens het volgen langs de laserbaan worden aangetroffen. De belangrijkste voordelen van de 3D-trackingmethode boven andere bestaande methoden, die bijvoorbeeld zijn gebaseerd op astigmatische lenzen, is dat de 3D-trackingmethode ons in staat stelt om over een zeer groot bereik van de dementie te volgen. Deze methode kan helpen om een belangrijke vraag in het veld van vesiculaire transport te beantwoorden, zoals hoe blaasjes zich langs microbuizen bewegen.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om endosomale dynamica te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waar het mogelijk is om geïsoleerde deeltjes fluorescent te markeren, zoals go-nanodeeltjes, membraanreceptoren, geaggregeerde nucleaire poortcomplexen of genetische loci. Behouden Chinese hamster-ovariumcellen of CH K-ééncellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de cellen na het oogsten op een diameter van 14 millimeter.Microput met een oppervlaktedikte van 0,16 millimeter. Zaai cellen voor optimale dichtheid voor beeldvorming rond 60 tot 70% cofluency. Incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius 5% CO2. De volgende dag was de cellen drie keer in Hank's gebufferde zoutoplossing of H-B-S-S-H-B-S-S om dode cellen of puin van de kweekplaat te verwijderen en de cellen voor te bereiden op de kleuringsstap. Bewerk de cellen vervolgens in een HBSS-oplossing met een uiteindelijke concentratie van 50 anomolair lyotracker en 150 anomolair tubulinetrackergroen gedurende één uur bij 37 graden Celsius na incubatie. Was de cellen drie keer in HBSS om eventueel vrijgekomen kleurstof te verwijderen.Voeg vers DMEM-groeimedium toe voordat de cellen worden geïmageed. De microscoop voor de deeltjestracking die in het videoprotocol wordt beschreven, is gemonteerd op het frame van een commercieel verkrijgbare omgekeerde microscoop. Een coherente kameleon ultra twee titaniumsaffier femtoseconde laserexcitatilichtbron wordt gebruikt met een instelbare uitgangsgolflengtebereik tussen 690 nanometer en 1040 nanometer.Zorg ervoor dat de laserstraal is uitgelijnd in de achterste poort van de microscoop. Gebruik infrarood gecoate spiegels, de laserstraal wordt gedimd met behulp van een roterende halfgolfplaat geplaatst voor een calcitepolarisator, dim de straal zodat het gemiddelde vermogen bij het monster tussen 0,5 en twee milliwatt is. Verzamel het fluorescentielicht van het monster door een objectief met hoge numerieke aperturen waterobjectief in de lichtbaan te plaatsen.Plaats vervolgens het monster op een gemotoriseerde stage en pas de fijne beweging van het microscoopobjectief aan. Gebruik een objectief pizocontroller. Kies een fluorescentiefiltercube volgens de gewenste emissiegolflengten in een of twee kanaalsconfiguratie.Gebruik emissiebaandpassende filters. Om het spectrale bereik van de uitgestraalde fluorescentie verder te selecteren, leidt u het licht van de filtercube naar fotomultiplierbuizen waar het signaal wordt versterkt en gediscrimineerd en naar een digitale invoer/uitvoer data-acquisitiekaart wordt gestuurd om de cellen te beeldvormen, ze op het podium te plaatsen en te focussen met behulp van doorgelaten lichtverlichting. Schakel over naar rasterscanbeeldvorming om de cellen te identificeren die de kleurstof hebben opgenomen en om de onderliggende microtubuli te visualiseren, identificeer het initiële gebied waar vesiculaire beweging aanwezig is.Zodra een geïsoleerde vesicul is geïdentificeerd, stelt u de parameters in voor orbitaal volgen. Selecteer eerst de straal van de baan om de grootte van de cirkelvormige scan te definiëren volgens de grootte van het te volgen deeltje. Voor een puntemitter stelt u de straal van de baan gelijk aan de taille van de puntspreidingsfunctie of PSF van de excitatiebundel.Om de gevoeligheid en respons te maximaliseren. Stel de axiale afstand in om de afstand tussen de twee banen die worden uitgevoerd om de positie van het deeltje langs de axiale richting te lokaliseren. Stel de axiale afstand in op 1,5 tot drie keer de PSF-afval.Definieer de verblijftijd volgens de helderheid van het deeltje, om de tijd die op elk punt van de baan wordt besteed in te stellen, wat ook de fotobleekfrequentie zal bepalen. Gebruik een verblijftijd tussen 10 en 100 microseconden. Stel het aantal punten in elke baan in op 64 of 128 om baanperioden in de orde van vier tot 32 milliseconden op te leveren en een hoge tijdelijke resolutie te bieden voor het bepalen van de deeltjespositie.Verander het DC-offsetsignaal dat naar de spiegels wordt gestuurd om de straal op het deeltje te centreren via de grafische gebruikersinterface via een cursorselectie in het rastergescande beeld. Begin met volgen door de microscoopmodus van rasterbeeldvorming over te schakelen naar orbitaal scannen. Activeer de feedback en gegevensverzameling voor trajectanalyse.Gebruik de software om de fluorescentie weer te geven die op elk punt langs de baan en op elk tijdstip wordt verzameld in de vorm van een intensiteitenvloer. De intensiteit die langs de vloer wordt verzameld, geeft informatie over de interactie van het deeltje met andere heldere objecten. Geef zowel de trajectinformatie als de gedurende de tijd verzamelde fluorescentie-intensiteit van de fotomultiplierbuis weer in de vorm van tijdreeksen.Gebruik de tijdreeksweergave en de intensiteit

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles' movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analyse wordt toegepast op macropinosomen om hun intrinsieke tijd-evoluerende aard in termen van structurele en dynamische eigenschappen te benadrukken. Macropinosomen worden vervolgens vergeleken met insulinesecretiekorrels (ISG's) als referentie voor subcellulaire structuren met tijdinvariante gemiddelde structurele/dynamische eigenschappen.

Onderzoek naar structurele en dynamische eigenschappen van handel subcellulaire nanostructuren door spatiotemporale fluctuatiespectroscopie

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Leer 3D-orbitaal volgen van lysosomen in levende cellen met een gemodificeerde twee-foton microscoop. Deze methode maakt hoge-snelheids tracking van organdynamica en interacties mogelijk.

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

Meer video's verkennen