3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

Het algemene doel van deze procedure is om te illustreren hoe snel bewegende organellen, zoals lysosomen, in 3D binnen een levende cel kunnen worden gevolgd. Dit wordt bereikt door eerst de lysosomen en de microtubuli te kleuren met behulp van specifieke commerciële kleurstoffen in gekweekte levende cellen. De tweede stap is het gebruik van een laserscanningmicroscoop en het gebruik van de orbitale trackingmethode om de lysosomebeweging met hoge snelheid te volgen, waarbij de grootte van de baan en andere parameters, zoals de frequentierespons van het systeem, worden geselecteerd om trackingexperimenten uit te voeren.

Uiteindelijk laten de resultaten zien dat het mogelijk is om snel bewegende lysosomen in drie dimensies te volgen en interacties te detecteren met andere fluorescent gekleurde organellen die tijdens het volgen langs de laserbaan worden aangetroffen. De belangrijkste voordelen van de 3D-trackingmethode boven andere bestaande methoden, die bijvoorbeeld zijn gebaseerd op astigmatische lenzen, is dat de 3D-trackingmethode ons in staat stelt om over een zeer groot bereik van de dementie te volgen. Deze methode kan helpen om een belangrijke vraag in het veld van vesiculaire transport te beantwoorden, zoals hoe blaasjes zich langs microbuizen bewegen.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om endosomale dynamica te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waar het mogelijk is om geïsoleerde deeltjes fluorescent te markeren, zoals go-nanodeeltjes, membraanreceptoren, geaggregeerde nucleaire poortcomplexen of genetische loci. Behouden Chinese hamster-ovariumcellen of CH K-ééncellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de cellen na het oogsten op een diameter van 14 millimeter.

Microput met een oppervlaktedikte van 0,16 millimeter. Zaai cellen voor optimale dichtheid voor beeldvorming rond 60 tot 70% cofluency. Incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius 5% CO2. De volgende dag was de cellen drie keer in Hank's gebufferde zoutoplossing of H-B-S-S-H-B-S-S om dode cellen of puin van de kweekplaat te verwijderen en de cellen voor te bereiden op de kleuringsstap. Bewerk de cellen vervolgens in een HBSS-oplossing met een uiteindelijke concentratie van 50 anomolair lyotracker en 150 anomolair tubulinetrackergroen gedurende één uur bij 37 graden Celsius na incubatie. Was de cellen drie keer in HBSS om eventueel vrijgekomen kleurstof te verwijderen.

Voeg vers DMEM-groeimedium toe voordat de cellen worden geïmageed. De microscoop voor de deeltjestracking die in het videoprotocol wordt beschreven, is gemonteerd op het frame van een commercieel verkrijgbare omgekeerde microscoop. Een coherente kameleon ultra twee titaniumsaffier femtoseconde laserexcitatilichtbron wordt gebruikt met een instelbare uitgangsgolflengtebereik tussen 690 nanometer en 1040 nanometer.

Zorg ervoor dat de laserstraal is uitgelijnd in de achterste poort van de microscoop. Gebruik infrarood gecoate spiegels, de laserstraal wordt gedimd met behulp van een roterende halfgolfplaat geplaatst voor een calcitepolarisator, dim de straal zodat het gemiddelde vermogen bij het monster tussen 0,5 en twee milliwatt is. Verzamel het fluorescentielicht van het monster door een objectief met hoge numerieke aperturen waterobjectief in de lichtbaan te plaatsen.

Plaats vervolgens het monster op een gemotoriseerde stage en pas de fijne beweging van het microscoopobjectief aan. Gebruik een objectief pizocontroller. Kies een fluorescentiefiltercube volgens de gewenste emissiegolflengten in een of twee kanaalsconfiguratie.

Gebruik emissiebaandpassende filters. Om het spectrale bereik van de uitgestraalde fluorescentie verder te selecteren, leidt u het licht van de filtercube naar fotomultiplierbuizen waar het signaal wordt versterkt en gediscrimineerd en naar een digitale invoer/uitvoer data-acquisitiekaart wordt gestuurd om de cellen te beeldvormen, ze op het podium te plaatsen en te focussen met behulp van doorgelaten lichtverlichting. Schakel over naar rasterscanbeeldvorming om de cellen te identificeren die de kleurstof hebben opgenomen en om de onderliggende microtubuli te visualiseren, identificeer het initiële gebied waar vesiculaire beweging aanwezig is.

Zodra een geïsoleerde vesicul is geïdentificeerd, stelt u de parameters in voor orbitaal volgen. Selecteer eerst de straal van de baan om de grootte van de cirkelvormige scan te definiëren volgens de grootte van het te volgen deeltje. Voor een puntemitter stelt u de straal van de baan gelijk aan de taille van de puntspreidingsfunctie of PSF van de excitatiebundel.

Om de gevoeligheid en respons te maximaliseren. Stel de axiale afstand in om de afstand tussen de twee banen die worden uitgevoerd om de positie van het deeltje langs de axiale richting te lokaliseren. Stel de axiale afstand in op 1,5 tot drie keer de PSF-afval.

Definieer de verblijftijd volgens de helderheid van het deeltje, om de tijd die op elk punt van de baan wordt besteed in te stellen, wat ook de fotobleekfrequentie zal bepalen. Gebruik een verblijftijd tussen 10 en 100 microseconden. Stel het aantal punten in elke baan in op 64 of 128 om baanperioden in de orde van vier tot 32 milliseconden op te leveren en een hoge tijdelijke resolutie te bieden voor het bepalen van de deeltjespositie.

Verander het DC-offsetsignaal dat naar de spiegels wordt gestuurd om de straal op het deeltje te centreren via de grafische gebruikersinterface via een cursorselectie in het rastergescande beeld. Begin met volgen door de microscoopmodus van rasterbeeldvorming over te schakelen naar orbitaal scannen. Activeer de feedback en gegevensverzameling voor trajectanalyse.

Gebruik de software om de fluorescentie weer te geven die op elk punt langs de baan en op elk tijdstip wordt verzameld in de vorm van een intensiteitenvloer. De intensiteit die langs de vloer wordt verzameld, geeft informatie over de interactie van het deeltje met andere heldere objecten. Geef zowel de trajectinformatie als de gedurende de tijd verzamelde fluorescentie-intensiteit van de fotomultiplierbuis weer in de vorm van tijdreeksen.

Gebruik de tijdreeksweergave en de intensiteit