Name: Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer C. elegans kweken in axenische vloeibare CeHR-media om bacteriële bijproducten te elimineren bij voedingsstudies. Deze methode synchroniseert wormpopulaties voor nauwkeurige onderzoeksresultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of HealthGrants DK85035 en DK074797 (IH).

1. Worm Stammen <ol><li> Verkrijgen C. elegans wildkleur Bristol N2 stammen uit de Caenorhabditis Genetics Center (CBC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) hen op NGM platen geënt met E. coli stam OP50 7. Opmerking: Transgene worm stammen IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) gebruikt werden gegenereerd zoals eerder beschreven 11. IQ6011 kan worden aangevraagd bij de betreffende auteur. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Modified C. elegans Habitation en Reproductie Medium (mCeHR) Bereid mCeHR vloeibare media zoals hieronder beschreven 12. Dit axenische vloeibare media laat de wormen te groeien zonder extra voedselbronnen. Voer alle manipulaties van axenische vloeibare media en axenische wormen gebruik strikt steriele omstandigheden zoals een laminaire stroming kap. <ol><li> Verkrijgen ultra gepasteuriseerde vetvrije melk uit een supermarkt. Gebruik de gekoelde product en niet de ruimtetemperatuur product. Voorafgaand aan het gebruik in mCeHR medium, streep de melk op Brain Heart Infusion (BHI) agar platen en incubeer gedurende 3 dagen bij 30 ° C en 37 ° C om te controleren op steriliteit. Breng de melk 50 ml steriele buizen en bewaar bij -80 ° C </li><li> Bereid een van de volgende componenten te combineren in de volgorde en hoeveelheden aan 1 liter mCeHR bereiden (Tabel 1A): 10 ml 2 mM choline dizuur citraat, 10 ml vitamine en groeifactor mix (zie recept in tabel 1B) 10 ml van 2,4 mM myo-inositol, 10 ml 2 mM hemine chloride, 250 ml gedeïoniseerd water. Afzuigen en filteren door een 0,22 urn filter unit. </li><li> Voeg 20 ml nucleïnezuur mengsel (recept in tabel 1C), 100 ml mineralenmix (recept in tabel 1D), 20 ml 170 mg / ml lactalbumine hydrolysaat, 20 ml essentiële aminozuren, 10 ml van niet-essentiële aminozuren zuren, 20 ml 450 mM KH 2PO 4,50 ml 1,45 M D-glucose, 10 ml 1 M HEPES, natriumzout, 250 ml gedeïoniseerd water. </li><li> Afzuigen te filteren steriliseren van de componenten. Verwijder het filter en voeg 1 ml van 5 mg / ml cholesterol. Zorg ervoor dat de pH van de media is ongeveer 6-6,5. Opmerking: Deze oplossing kan worden bewaard bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar. </li><li> Voeg 20% ​​(v / v) ultra gepasteuriseerde biologische afgeroomde melk aan de mCeHR medium vóór gebruik. Gebruik strikt steriele techniek (bijvoorbeeld in een laminaire stroming kap) bij het openen en aliquoting de melk. Bewaar de media bij 4 ° C. </li></ol> 3. Bereid C. elegans voor cultuur in Axenische mCeHR vloeibaar medium <ol><li> Kweek wormen tien 60 mm NGM platen tot er vele zwangere wormen en een minimale hoeveelheid OP50 E. coli op de platen. </li><li> Verwijder de wormen uit elke plaat gespoeld met 5 ml M9 buffer (recept in tabel 1F) en gecombineerd in een 50 ml conische buis. </li><li> Laat de wormen settle door uit de buis gedurende 5 tot 10 minuten staan ​​dan voorzichtig de supernatant dat de E. coli. </li><li> Herhaal de stappen 3.2 en 3.3 2x zoveel mogelijk van de resterende bacteriën mogelijk te verwijderen alvorens verder de procedure. </li><li> Resuspendeer de wormen in 0,1 N NaCl in een volume dat een veelvoud van drie, bijvoorbeeld 1,5 ml, 3 ml of 6 ml waarin afzonderlijke wormen zichtbaar in de buis. </li><li> Bleach de wormen door toevoeging van 5 N NaOH en 5% natriumhypochloriet (bleek) oplossing in een verhouding 01:02:06 naar de worm suspensie. Bijvoorbeeld, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% natriumhypochloriet: 6 ml van de worm suspensie. Meng de NaOH en bleekmiddel voor het toevoegen aan de worm schorsing. </li><li> Vortex de oplossing krachtig tot het zwangere wormen opgelost en uitsluitend eieren zijn zichtbaar in de suspensie (ongeveer 5 tot 10 min). Toezien op het proces met behulp van een fase-contrast microscoop met een 10x doelstelling. </li><li> Nadat de wormen volledig is opgelost, onmiddellijk pellet deeieren bij 800 xg gedurende 45 seconden bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en spoel de pellet twee keer met 10 ml steriel water door de pellet centrifugeren bij 800 g gedurende 45 seconden bij 4 ° C. </li><li> Na het bleken, breng de pellet ei een 25 cm2 weefselkweek kolf die 10 ml mCeHR medium aangevuld met 100 ug / ml tetracycline. Doe dit met behulp van steriele technieken. Indien gewenst, extra antibiotica, waaronder 250 ug / ml nalidixinezuur, om bacteriegroei in de axenic vloeibare kweken voorkomen. </li><li> Incubeer de vloeibare kweken bij 20 ° C op een schuddend incubator bij ongeveer 70 rpm. </li><li> Controleer de wormen dagelijks te merken het ontwikkelingsstadium en de snelheid van de groei. Opmerking: Worms zal aanvankelijk langzaam groeien en vereisen 7-10 dagen aan zwangere geworden. Aangezien de wormen acclimatiseren aan het vloeibare medium de generatietijd zal afnemen tot ongeveer 4 dagen wildtype (N2) wormen. </li><li> Na de wormen hebben ontkeld om de zwangere fase in vloeibare media, overdracht van de worm cultuur tot een conische buis en de pellet wormen bij 800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C met een swinging bucket rotor. </li><li> Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet worm in een gelijk volume van 0,1 M NaCl. Gebruik bijvoorbeeld 10 ml 0,1 M NaCl voor wormen gekweekt in 10 ml mCeHR. Laat de wormen rusten gedurende 5 minuten op ijs. </li><li> Voer het bleken procedure als hierboven beschreven in stappen 3.5-3.8, en laat de wormen groeien voor een tweede generatie de axenic vloeibare media. Indien nodig, voeg het antibioticum opnieuw om de groei van bacteriën te remmen. </li><li> Opnieuw laat de wormen te gravid worden dan pellet en resuspendeer de wormen in 0,1 M NaCl, zoals beschreven in de stappen 3.12 en 3.13, daarna bleken opnieuw zoals beschreven in de stappen 3,5-3,8, een gesynchroniseerde bevolking te produceren. Groeien de L1 larven wormen in vloeibare media zonder antibiotica vanaf nu. </li></ol> 4. Synchroniseren Worms van LiquidCultuur <ol><li> Pellet en resuspendeer de wormen in 0,1 M NaCl zoals hierboven beschreven in stappen 3.12 en 3.13. Bleach zoals hierboven beschreven in stappen 3.5-3.8. </li><li> Resuspendeer de pellet in ei 10 ml M9 buffer en laat de larven uitkomen O / N bij 20 ° C op een roterend platform shaker. Opmerking: De eieren uitkomen in L1 larven, maar niet verder ontwikkelen synchroniseren van de wormen in de fase L1. </li><li> Stand houden en subcultuur wormen, pellet L1 larven bij 800 xg gedurende 5 minuten, dan resuspendeer de larven in 10 ml mCeHR en overbrengen in een 25 cm2 kolf. Laat de wormen te groeien bij 20 ° C op een roterend platform. Handhaven van een maximale dichtheid van 3000 / wormen ml / cm 2 om adequate voeding te verzekeren voor de wormen. Opmerking: In dit stadium zijn antibiotica niet verplicht axenische omstandigheden te handhaven wanneer de procedures worden uitgevoerd onder toepassing van steriele technieken in een laminaire stroming kap. Wormen moet dagelijks worden gecontroleerd om de groei te volgen. </li></ol> 5. Gratiszing en ontdooien Worms voor Axenische Medium Culturen <ol><li> Freeze axenische asynchrone worm culturen of gesynchroniseerd L1 larven in vloeibare stikstof. Pellet wormen bij 800 xg gedurende 5 minuten daarna opnieuw in suspensie in S-buffer (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCl) met behulp van 0,5 ml per flacon. Voeg een gelijk volume S buffer met 30% v / v glycerol aan elk flesje en breng de wormen tot -80 ° C voor langdurige opslag in vloeibare N2. Freeze ongeveer 1 x 10 6 wormen per ml in elke flacon. </li><li> Ontdooi wormen door incuberen van de flesjes bij 37 ° C gedurende ongeveer 2 minuten totdat vrijwel al het ijs is gesmolten. In een laminaire stroming kap, breng de wormen een steriele kolf die mCeHR en plaats ze bij 20 ° C. </li></ol> 6. Bepaal het effect van Hemin concentratie op groei en voortplanting in mCeHR <ol><li> Gebruik axenische mCeHR media om voedingsstoffen afhankelijke groei van C. assay elegans. Om het effect te bepalen of hemine concentratie op groei en ontwikkeling worm, gebruik gesynchroniseerd axenische N2 wormen of andere stammen van belang. Synchroniseer L1 larven, zoals hierboven beschreven in paragraaf 4. </li><li> Op de volgende dag, pellet en tel gesynchroniseerd L1 larven en vul aan tot 1 worm per pl axenische media. Voeg 10 mM hemine chloride in 0,3 M NH4OH en breng de pH 8 met geconcentreerde HCl. </li><li> Voeg 800 ul van mCeHR media om een ​​24-well plaat. Voeg 100 wormen aan elk putje in 100 pl medium. Voeg hemine chloride aan elk putje in concentraties variërend van 0 uM, 1,5 uM tot 1,000 uM in drievoud. Zorg ervoor dat alle putjes bevatten dezelfde concentratie van 0,3 M NH 4 OH. Voorzichtig geresuspendeerd de wormen voor pipetteren zodat 100 L1 larven worden toegevoegd aan elk putje. </li><li> Onderzoek de wormen per dag en let op de groei in elke concentratie in elk putje. Tel het aantal wormen na 9 dagen incubatie en plot het aantal wormen / ml overeenkomstig elke hemeconcentratie (Figuur 1). </li></ol> 7. Effect van Hemin concentratie op Heme Sensor Worms <ol><li> Incubeer gesynchroniseerd L1 heem sensor wormen (Phrg-1 :: GFP) in mCeHR met 4 uM, 8 uM, 10 uM en 20 uM hemine. </li><li> Afbeelding de wormen met behulp van fluorescentie confocale microscopie, 48 uur na incubatie (Figuur 2). </li></ol> 8. Gebruik makend mCeHR het genereren van transgene C. elegans gebruiken microdeeltjes bombardement Opmerking: De procedure voor het genereren en uitvoeren van microdeeltjes bombardement behulp unc-119 (ED3) wormen gekweekt in mCeHR is geschetst in figuur 3 13. <ol><li> Worm Voorbereiding <ol><li> Breng circa 1 x 10 6 asynchrone unc-119 (ED3) wormen in 90 ml mCeHR media in een 175 cm2 kolf een week voorafgaand aan beschieting. Laat de wormen te groeien bij 20 ° C ona schudden platform bij ~ 70 rpm (Figuur 3-1). Opmerking: Een week later, dient de worm dichtheid significant groter met veel volwassen zwangere wormen. Ongeveer 3 x 10 7 wormen is vereist voor bombardement met microdeeltjes. </li><li> Chill JM109 E. coli gezaaid 10 cm NGM platen op ijs. </li><li> Breng de axenic wormen twee 50 ml conische buizen en centrifugeer de wormen bij 800 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de wormen in elke buis 50 ml M9 buffer (Figuur 3-2). </li><li> Laat de volwassen wormen pellet door de zwaartekracht gedurende 10 tot 15 minuten op ijs. Opmerking: De pellet 2 ml moet bevatten nu&gt; 90% volwassen wormen. Deze 2 ml pellet moet ongeveer 5 x 10 6 wormen te hebben en is voldoende voor een bombardement met microdeeltjes. </li><li> Smeer het gehele oppervlak van de gekoelde JM109 gezaaid NGM plaat met de 2 ml pellet van wormen. Laat de vloeistof volledig geabsorbeerd dan Laat de plaatgedurende 30 minuten op ijs voordat u verder gaat (Figuur 3-3). </li></ol></li><li> Bereiding van gouddeeltjes <ol><li> Weeg 30 mg goud deeltjes in een gesiliconiseerde microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 70% ethanol en vortex de buis 5 minuten. </li><li> Laat de buis zitten gedurende 15 minuten en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 seconden aan de gouddeeltjes pellet. Verwijder het supernatant met een pipet tip door voorzichtig aanraken van de punt aan de zijkant van de buis tegenover de gouddeeltjes. </li><li> Was de gouddeeltjes met 1 ml steriel water, vortex gedurende 1 minuut en kort centrifugeer de buis bij 6.000 g gedurende 10 sec. Herhaal de wasstap maal, vervolgens resuspendeer de gouddeeltjes in 0,5 ml steriel 50% glycerol. Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de goud deeltjes 60 mg / ml en bewaard kan worden gedurende 1 tot 2 maanden bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid de DNA-goud deeltje mix <ol><li> Combineer 10 ug van het gewenste plasmide DNA met 10 &amp;# 956; g van de unc-119 redding plasmide in een gesiliconiseerde 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 50 ul van DI water en 100 ui en geresuspendeerd gouddeeltje oplossing vervolgens vortex gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 150 ul van 2,5 M CaCl2 en geschud oplossing opnieuw gedurende 1 minuut. Aan deze oplossing, voeg 60 ul van 0,1 M spermidine en vortex gedurende 3 tot 5 minuten. </li><li> Pulscentrifugeer de oplossing bij 6000 g gedurende 10 seconden, verwijder het supernatant en voeg 300 pl 70% ethanol. Vortex goed voor 1 min, pols centrifuge bij 6000 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer in 170 pi van 100% ethanol. Krachtdadig vortex de oplossing gedurende 5 tot 10 minuten puls dan centrifuge en verwijder het supernatant. </li></ol></li><li> Bombardement (Figuur 3-3) Opmerking: Dit protocol wordt uitgevoerd met het deeltje levering systeem aangegeven in de tabel van Materialen / Equipment uitgevoerd. Volg de instructies voor het deeltje levering instrument beschikbaar. <ol> &lt;li&gt; Leg een vel vloeipapier in een 15 cm plaat. Met een pincet, dip zeven macrocarriers individueel in 100% ethanol en leg ze op het weefsel te drogen. </li><li> Grondig reinigen van de biolistische kamer, macrodrager houder, en target plaat met 70% ethanol. Schoon en autoclaaf het stoppen van schermen voor elk bombardement procedure. </li><li> Laad de macrocarrriers in de houder met een pincet en druk in de houder met behulp van de zitplaatsen tool. </li><li> Verdeel 20 ul van de met DNA beklede gouddeeltjes in het midden van elke macrodrager en laat de oplossing volledig drogen. </li><li> Maak de twee delen van de druk verdeler met ethanol en monteren met ethanol gereinigd breekplaten. Schroef de gemonteerde druk divider en breekplaten in het bombardement kamer. </li><li> Monteer een autoclaaf stopscherm met de macrodrager houder en plaats het apparaat op de metalen rek nodig is en vast te zetten. </li><li> Plaats de geassembleerde macrocarrier apparaat in de biolistische kamer in de toegewezen sleuf onder de druk verdeler en lijn met de druk divider. </li><li> Tape de open NGM plaat met de wormen op het doel plaat plank en sluit de deur van de kamer. </li><li> Om wormen bombarderen, pas de druk aan die nodig is om de breuk schijven breken. Schakel het vacuüm tot 28 inch Hg druk, druk op de vuurknop totdat de schijven scheuren. </li><li> Laat het vacuüm en verwijder de NGM plaat uit het apparaat. Was de wormen van de plaat en herverdelen op de twintig 10 cm NGM platen geënt met JM109 E. coli (Afbeelding 3-4). </li><li> Laat de wormen te groeien gedurende 10 tot 14 dagen bij 25 ° C en verhongeren de platen. Wormen gered van de unc-119 defect zal de normale beweging te hebben en kunnen worden geïdentificeerd op dit moment. Kies ten minste 10 &quot;wild-type&quot; wormen uit afzonderlijke platen voor verdere analyse als deze vertegenwoordigen onafhankelijke transgene lijnen (Figure 3-5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system%3A+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pharmacology+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li>
<li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism+TEM%22%5BJournal%5D)">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li>
<li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li>
<li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109(2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+disease%22%5BJournal%5D)">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li>
<li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).</li>
<li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044(2010).</li>
<li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li>
<li>Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNass%2C+R+%22The+nematode+C.+elegans+as+an+animal+model+to+explore+toxicology+in+vivo%3A+solid+and+axenic+growth+culture+conditions+and+compound+exposure+parameters.+Current+protocols+in+toxicology+editorial+board%2C+Mahin+D.+Maines%22">The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines</a>. , (2007).</li>
<li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans+biology%22%5BJournal%5D)">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li>
<li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li>
<li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19(2003).</li>
<li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li>
<li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li>
<li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40(2004).</li>
<li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren er geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.

In dit protocol presenteren we een gemodificeerde axenische vloeibare media mCeHR dat zorgt voor een snelle C. elegans generatie met productie van een groot aantal wormen. Deze media toont een aantal voordelen zoals de wormen worden geteeld zonder vervuilen E. coli of bacteriële bijproducten en kan in voedings-en toxicologisch onderzoek worden benut. Het gebruik van E. coli of andere bacteriën in deze studies heeft verschillende nadelen. Bijvoorbeeld kan de groei van de bacteriën onder verschi...

De bodem nematode Caenorhabditis elegans, is een krachtige modelorganisme gebruikt in tal van studies van de genetica tot toxicologie. Door de 1 mm grootte, korte generatietijd vier dagen kweekgemak en grote aantallen nakomelingen zijn deze nematoden is gebruikt in een aantal genetische en farmacologische screens 1, 2. Onderzoekers profiteren van deze worm aan moleculen en wegen bewaard in gewervelde systemen te identificeren. Deze routes omvatten celdood signalen, paden van het ouder worden en het metabolisme en het zenuwstelsel 3-6. Bovendien, de transparantie van C. elegans maakt het genereren van transgene lijnen met fluorescerende proteïne reporters, die direct gevisualiseerd kunnen worden om genexpressiepatronen en eiwit lokalisatie analyseren. In veel studies deze nematode wordt gekweekt op een stevige agar oppervlak met behulp van nematode groeimedium (NGM) platen of in liquid culturen bezaaid met Escherichia coli als voedselbron 7,8. Deze bacteriële voedselbronnen kunnen biochemische en toxicologische studies verwarren met interferentie van bacteriële bijproducten die de interpretatie van de resultaten. Om deze effecten te voorkomen compounding, C. elegans kan worden gekweekt in een axenische vloeibare media die verstoken is van bacteriën als voedselbron. Met behulp van deze media, hebben we met succes gekweekt miljoenen hoogst gesynchroniseerde wormen voor vele standaard C. elegans protocollen waaronder microarray analyse van differentieel gereguleerde genen in C. elegans blootgesteld aan verschillende concentraties heem en productie van transgene wormen middels gen bombardement. Deze media is chemisch gedefinieerd en gewijzigd van een origineel recept van Dr Eric Clegg 9 geformuleerd. Met deze mCeHR media, hebben we met succes geïdentificeerde genen betrokken bij homeostase heem, genoemd heem responsieve genen (HRG s) 10, die zouniet mogelijk geweest in de reguliere groei omstandigheden die NGM agar platen geënt met E. benutten coli. In dit protocol beschrijven we de procedure voor het invoeren en bijhouden van C. elegans gekweekt op E. coli de axenic mCeHR en gebruik deze methode om een groot aantal wormen te vinden voor het produceren van transgene C. elegans lijnen met behulp van microdeeltjes bombardement. We aanwezig studies die het nut van het gebruik axenic media voor het bepalen van de nutritionele behoefte C. tonen elegans gebruik heem als voorbeeld. Deze studies tonen aan dat het gebruik mCeHR media maakt snelle groei van een groot aantal C. elegans voor vele downstream toepassingen gebruikt door worm onderzoekers.

<table><tbody><tr><td>MgCl2&#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcitraat monohydraat</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&#8226;2H2O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226;4H2O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226;2H2O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5 -monofosfaat, natriumzout</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5 -fosfaat</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 2' - en 3' -monofosfaat</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 -fosfaat, dinatriumzout</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymine</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanine</td><td>Fisher</td><td>S25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoëzuur</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamine (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinaat (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacine</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacineamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantetheïne</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenaat (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutaminzuur (Foliumzuur)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5'-fosfaat</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamine 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavine 5-PO4(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Tioctic Acid</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Choline di-zuurcitraat</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumine enzymatisch hydrolysaat</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Heminechloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, natriumzout</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niet-Essentiële Aminozuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminozuren Oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixinezuur natriumzout</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Leveringssysteem</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gouddeeltjes (Au Poeder)&nbsp;</td><td>&nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>of</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gouddeeltjes 1.0 &mu;m</td><td>BioRad</td><td>&nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

kweken caenorhabditis elegans in axenische liquid media en creatie van transgene worms door bombardement met microdeeltjes

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In dit protocol, presenteren we de benodigde materialen, en de procedure voor het maken van aangepaste C. E legans Gewenning en Reproductie media (mCeHR). Bovendien, de stappen voor het blootstellen en acclimatiseren C. elegans gekweekt op E. coli om vloeibare media axenische worden beschreven. Tenslotte downstream experimenten die axenic C. gebruiken elegans illustreren de voordelen van deze procedure. Kunnen analyseren en bepalen C. elegans voedingsstoffen eis werd geïllustreerd door de groeiende N2 wild type wormen in axenische vloeibare media met verschillende concentraties heem. Deze procedure kan worden herhaald met andere voedingsstoffen om de optimale concentratie voor groei en ontwikkeling worm bepalen of de toxische effecten van behandeling met geneesmiddelen te bepalen. De effecten van verschillende concentraties heem op de groei van wildtype wormen werden bepaald door kwalitatieve microscopische waarneming en kwantificeren tHij aantal wormen die groeide in elk heem concentratie. Bovendien kan het effect van verschillende concentraties nutriënten worden getest door gebruik te maken van wormen die fluorescerende sensoren die reageren op veranderingen in de voedingsoplossing van belang uit te drukken. Bovendien werden een groot aantal wormen gemakkelijk geproduceerd voor het genereren van transgene C. elegans met bombardement met microdeeltjes.

Het kweken van C. elegans axenic vloeibaar medium helpt bij het ​​bepalen van de voedingsstoffen die nodig zijn door wormen zonder interferentie van secundaire metabolieten die door E. coli. Wildkleur N2 wormen acclimatiseren aan mCeHR media binnen drie generaties en groei vertonen vergelijkbaar met wormen gegroeid op NGM bacteriële platen. Inderdaad, deze wormen worden gravid binnen 4 dagen vergeleken met 3,5 dagen wormen gekweekt op OP50 bacteriën. Een voordeel van het ge...

C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Het algemene doel van deze procedure is om zee-elegantie te introduceren en te laten groeien in CENIC vloeibare media voor talrijke downstream toepassingen. Dit wordt bereikt door eerst grave wormen te bleken van uitgehongerde agar platen. De tweede stap van de procedure is om de vrijgekomen eieren over te brengen naar M-C-E-H-R met antibiotica en ze te laten ontwikkelen tot de grave fase, wat zeven tot 10 dagen kan duren.De derde stap is om de graven te bleken en ze een tweede keer te laten ontwikkelen tot de grave fase zonder extra antibiotica. De laatste stap is om de Axe wormen te synchroniseren en ze te gebruiken voor nutritionele studies die wormgroei en ontwikkeling onderzoeken. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat wild type C elegantie goed groeien in Axe vloeibare media en dat M-C-E-H-R media kan worden gebruikt om de nutritionele behoeften van de wormen te onderzoeken zonder bacteriële bijproducten.Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals het kweken van wormen op agar platen of in vloeibare media met bacteriën, is dat de effecten van voedingselementen of toxines kunnen worden getest zonder verwarrende bacteriële bijproducten. Over het algem

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video demonstreert de techniek van micro-injectie in de gonaden van C. elegans om transgene dieren te creëren.

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

Deze video beschrijft de principes achter de RNAi-behandeling bij C. elegans en demonstreert een protocol om lin-35 in een transgene wormstam neer te slaan.

RNAi Plating voor C. elegans Feeding: Een techniek om doel dsRNA expressie te induceren in E. coli

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

Dit protocol wordt beschreven hoe cellulaire om processen te bestuderen tijdens de cel lot conversie in Caenorhabditis elegans in vivo. Met behulp van transgene dieren, waardoor warmte-schok promotor gestuurde overexpressie van het neuron lot-inducerende transcriptiefactor CHE-1 en RNAi-gemedieerde uitputting van de regulering van de chromatine factor LIN-53 kiem naar neuron herprogrammering waarneembaar in vivo.<br...

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

De genetisch trekbare nematode Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een eenvoudig en goedkoop model voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hier wordt een protocol beschreven om antikankertherapieën te identificeren die de downstream signalering van RAS- en EGFR-eiwitten remmen.

Identificatie van EGFR- en RAS-remmers met Caenorhabditis elegans

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Leer C. elegans kweken in axenische vloeibare CeHR-media om bacteriële bijproducten te elimineren bij voedingsstudies. Deze methode synchroniseert wormpopulaties voor nauwkeurige onderzoeksresultaten.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

Meer video's verkennen