Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen
19 augustus 2014
Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.
Het algemene doel van deze procedure is om lymfeklierstromacellen te isoleren. Dit wordt bereikt door eerst de lymfeklierontlasting te verstoren. In de tweede stap worden de lymfeklinformstukken verteerd met collagenase vier en D nase één.
De enzymen worden vervolgens vervangen door collagenase D en D nase één, en de fragmenten worden mechanisch gedisaggregeerd met een geautomatiseerde multikanaals pipette. Uiteindelijk kan de expressie van het celoppervlaktemolecuul van de geïsoleerde lymfeklinformstukken worden gekarakteriseerd door middel van flowcytometrie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat met deze methode de lymfeklinformstukken SHR-cellen worden verteerd met behulp van een gestandaardiseerd enzymatisch proces, aangevuld met mechanische disaggregatie die de levensvatbaarheid en expressie van het oppervlaktemolecuul van de cellen behoudt.
Begin door de gedissecteerde lymfeklinformstukken in een steriele petrischaal met twee milliliter ijskoud medium te plaatsen. Gebruik vervolgens twee een milliliter spuiten voorzien van 25 gauge naalden om de lymfeklierontlasting te verstoren. Breng vervolgens het verbroken weefsel over naar een vijf milliliter kegelbuisje dat 750 microliter medium bevat, aangevuld met collagenase vier en DNA één en een magnetische roerder.
Plaats vervolgens de buis in een beker met voorverwarmd 37 graden Celsius water op een magnetische roerder en roer de celslurries gedurende 30 minuten met één omwenteling per seconde. Na het roeren, laat de lymfeklinformstukken bezinken en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant. Breng nu verrijkt voor niet-stromacellen 750 microliter vers medium aan de lymfeklinformstukken, aangevuld met collagenase D en D nase één, en roer het weefsel vervolgens nog eens vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Gebruik vervolgens een geautomatiseerde multi-kanaals pipette om de lymfeklinformstukken weefselfragmenten in een volume van 700 microliter gedurende 10 cycli met maximale snelheid te disaggregeren, en roer de weefselfragmenten vervolgens opnieuw na 10 minuten. Disaggregeer vervolgens de weefselklompjes met de geautomatiseerde multi-kanaals pipette gedurende 99 cycli met maximale snelheid. Voeg vervolgens 7,5 microliter 0,5 molaire EDTA toe aan de buis en meng de weefselsuspensie gedurende nog eens 99 cycli met de geautomatiseerde pipette.
Na de laatste disaggregatiecyclus, voeg 750 microliter medium toe aan de celoplossing en filter de cellen door een nylon gaas van 70 micrometer. Pel de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 1500 Gs en vier graden Celsius. Om lymfeklinformstukken stromacellen te visualiseren door middel van flowcytometrie, kleurt u de geschikte celmonsters met live dode tracker en de antilichamen van belang in 100 microliter HBSS bevattend 2%FCS gedurende ten minste 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker.
Was vervolgens de cellen in 500 microliter HBSS met FCS en resuspendeer. De pellets in 100 microliter HBSS en FCS laten de cellen lopen op een flowcytometer door de CD 45 positieve cellen uit te sluiten om de hematopoietische cellen uit te sluiten, vervolgens gericht op de levende singlet populatie. Plot tenslotte GP 38 tegen CD 31 om de T-zone reticulaire cellen, lymfatische endotheelcellen, bloedendotheelcellen en dubbel negatieve cellen te visualiseren.
Celpopulaties. Het totale aantal cellen dat werd hersteld na vertering van de lymfeklinformstukken stromacellen was iets hoger in het zojuist gedemonstreerde protocol in vergelijking met de link en Fletcher protocollen, wat aantoont dat de levensvatbaarheid van de lymfeklinformstukken stromacellen na isolatie volgens dit protocol vergelijkbaar is met die verkregen met behulp van gepubliceerde protocollen. T-zone reticulaire cellen en lymfatische endotheelcellen geïsoleerd via dit en de link en Fletcher protocollen werden vergeleken op IAB CD één 40 a CD 80, PD L één en CD 40 expressie.
De expressie van alle vijf oppervlaktemoleculen was hoger na vertering met het zojuist gedemonstreerde protocol en het link protocol voor beide stromacellen subsets, wat suggereert dat de degradatie van sommige oppervlaktemoleculen door collagenase vier en D minder robuust is dan met collagenase p en DYS ruimte. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de vier belangrijkste subpopulaties van lymfeklinformstukken stromacellen succesvol kunt isoleren terwijl u de expressie van verschillende oppervlaktemoleculen behoudt die nuttig zijn voor hun verdere karakterisering en analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze procedure beschrijft de isolatie van stromale cellen uit lymfeklieren via een combinatie van enzymatische digestie en mechanische disaggregatie. De methode is erop gericht de levensvatbaarheid en de expressie van oppervlaktemarkers van de geïsoleerde cellen te behouden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Immunologie
- Stromaalcelonderzoek
Achtergrond
- Stromale cellen van lymfeklieren spelen een cruciale rol bij immuunresponsen.
- Isolatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van deze cellen.
- Bestaande methoden kunnen de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van oppervlaktemarkers in gevaar brengen.
- Deze studie presenteert een verfijnde techniek om deze problemen aan te pakken.
Doel van de studie
- Om levensvatige stromale lymfeknoocellen effectief te isoleren.
- Om de expressie van oppervlaktemoleculen tijdens het isolatieproces te behouden.
- Om bestaande isolatiemethoden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Doorbreken van het kapsel van de lymfeklier.
- Vertering met collagenase- en DNase-enzymen.
- Mechanische disaggregatie met behulp van een geautomatiseerde multichannelpipet.
- Karakterisering van celoppervlaktemoleculen via flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- De methode isoleert met succes stromale cellen uit lymfeklieren.
- De celviabiliteit en de expressie van oppervlaktemarkers blijven behouden.
- Flowcytometrie bevestigt de integriteit van de geïsoleerde cellen.
- De techniek vertoont voordelen ten opzichte van traditionele methoden.
Conclusies
- Deze verfijnde isolatietechniek verbetert de studie naar stromale cellen van lymfeklieren.
- Het biedt een gestandaardiseerde aanpak voor celisolatie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen voor immunologische studies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het isoleren van levensvatbare stromale lymfekliercellen met behoud van de expressie van oppervlaktemarkers maakt mechanistische risicoanalyse mogelijk bij de validatie van immunomodulerende targets. Deze methode ondersteunt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door de getrouwheid van de crosstalk tussen stroma en immuunsysteem te behouden. Het pakt een cruciaal kantelpunt in de ontdekking aan, waarbij de integriteit van stromale cellen van invloed is op de afstemming van translationele biomarkers en beslissingen over portfolio-triage.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar stromale-immuuninteracties bij de regulatie van de cytotoxische T-celrespons mogelijk.
- Operationele waarde: Behoudt de expressie van oppervlaktemoleculen CD31 en gp38 voor een accurate identificatie van subpopulaties.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het biologisch de-risking van stromale targets in homeostatische pathways van lymfoïde weefsel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde single-cell suspensies voor reproduceerbare flowcytometrie-gebaseerde assays.
- Operationele waarde: Combineert enzymatische digestie met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de opbrengst en levensvatbaarheid te verhogen.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metrieken voor het herstel van stromale cellen voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de functionaliteit van stromale cellen voor downstream-analyse van lymfocytenactivatie en -differentiatie.
- Operationele waarde: Maakt consistente isolatie mogelijk van reticulaire cellen uit de T-zone, lymfatische endotheelcellen, bloedendotheelcellen en dubbel-negatieve subsets.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door oppervlaktemoleculen te behouden die relevant zijn voor de crosstalk tussen stroma en immuunsysteem.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows waarin de levensvatbaarheid van stromale cellen en het behoud van markers cruciaal zijn voor hypothese-testen en het verduidelijken van pathways in immunomodulatiestudies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de isolatie van stromale cellen voor functionele validatie van doelwitten in de micro-omgeving van lymfoïde weefsel.
- Screening: Levert reproduceerbare enkelcel-suspensies die gestandaardiseerde assays op basis van stromale cellen mogelijk maken.
- Analytica: Genereert monsters die geschikt zijn voor flowcytometrie voor kwantitatieve analyse van oppervlaktemarkers en discriminatie van subsets.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft de integriteit van de stromale-immuuninterface voor preklinische continuïteit in modellen van lymfoïde weefsel.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd enzymatisch-mechanisch protocol dat aanpasbaar is voor diverse workflows voor de isolatie van stromale cellen uit lymfoïde weefsel.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de validatie van stromale targets door behoud van de expressie van oppervlaktemoleculen.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd protocol vermindert de variabiliteit bij de isolatie van stromale cellen over verschillende experimenten heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in studies naar stromaal-immuuninteracties te verminderen.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van stromale targets mogelijk op basis van betrouwbare preklinische data van stromale cellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in enzymatische weefseldigestie en kleuringsprotocollen voor flowcytometrie.
- Afhankelijk van een geautomatiseerde multichannelpipet voor mechanische disaggregatie en de beschikbaarheid van collagenase/DNase-enzymen.
- Maakt standaardisatie van digestietijden en mechanische cycli tussen gebruikers en laboratoria noodzakelijk.
- Vereist aanpassing van enzymconcentraties voor verschillende lymfoïde weefselbronnen of stromale subsets.
- Beperkt door de gevoeligheid van stromale cellen voor langdurige enzymatische blootstelling, wat tijdgebonden disruptiestappen noodzakelijk maakt.
