Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH
19 augustus 2014
DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om genomische instabiliteit in muis B-lymfocyten te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de B-cellen te isoleren voor primaire celkweek. Vervolgens worden de cellen gefixeerd om de voorbereiding van de metafase-spreidingen te vergemakkelijken.
Ten slotte wordt telomere PNA vis uitgevoerd voor visualisatie van de fluorescentie gelabelde telomeren. Uiteindelijk kan het niveau van verschillende soorten chromosoomafwwijkingen worden gekwantificeerd door middel van fluorescentiemicroscopie. De implicaties van deze techniek kunnen ons begrip van de DNA-herstelroutes uitbreiden, omdat het kan helpen bij het identificeren van genen die genomische stabiliteit bevorderen in onze gerichte muismodellen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in chromosoombreuken en andere grote chromosomale herschikkingen, kan deze ook worden aangepast om andere vormen van genomische instabiliteit zoals translocaties te meten. Om de B-cellen te isoleren, begint u door een vers geïsoleerde milt in een 35 millimeter weefselkweekschaal te plaatsen met twee milliliters spoelbuffer in een laminaire stromingskast. Gebruik vervolgens de achterkant van de plunjer van een vijf milliliter spuit om de milt voorzichtig te macereren.
Filter vervolgens de weefselslurry door een 70 micrometer nylon gaasfilter in een 50 milliliter buis met behulp van de plunjer om de grotere stukken weefsel voorzichtig door het filter te drukken. Spoel de plaat en spuit af met acht milliliters spoelbuffer en filter de was door het zeef. Nadat de cellen zijn afgespint, pipet de pellet een paar keer op en neer in drie milliliters CK-lysebuffer.
Na vijf minuten, stop de reactie met 10 milliliters spoelbuffer. Na het opnieuw afspinnen van de cellen, tik op de bodem van de buis om de pellet te hersuspenderen en voeg een milliliter spoelbuffer toe aan de cellen. Vervolgens incubeert u de cellen met 50 microliters anti CD 43 max microkorrels op ijs.
Na 30 minuten, was de cellen voorzichtig in 10 milliliters spoelbuffer. Tijdens de centrifugatie plaatst u een minimax kolom op de magneet en een gelabelde 15 milliliter conische buis onder de kolom. Voeg vervolgens een milliliter spoelbuffer toe aan de kolom, en verzamel de EIT in de buis.
Hersuspendeer de celpellet in een milliliter spoelbuffer en laad vervolgens de cellen op de kolom. Nadat het monster door de kolom is gegaan, spoelt u de kolom af met een milliliter spoelbuffer en voegt u zeven milliliter spoelbuffer rechtstreeks toe aan het verzamelde monster. Na het tellen van de verzamelde cellen, brengt u ze over naar een 50 milliliter buis voor centrifugatie. Om de B-cellen te activeren, hersuspendeert u de pellet bij een maal 10 van de zes cellen per milliliter in aangevuld B-cel medium en incubeert u de cellen in zes welpjes op vijf milliliters cellen per welpje In een bevochtigde celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de B-cellen te fixeren.
Vervolgens bij 50 microliters smid in elk van de welpjes. Na een uur incubatie bij 37 graden Celsius, brengt u de B-cellen over naar een gelabelde 15 milliliter buis. Bedek de label met tape en spin de cellen naar beneden.
Zuig vervolgens alles op behalve ongeveer een milliliter supernatant en hersuspendeer de pellet door te pipetten. Voeg vijf milliliters 37 graden Celsius, kaliumchloride toe, druppel voor druppel terwijl u pulseert op een vortex. Voeg vervolgens een extra 10 milliliters kaliumchloride toe en meng de celoplossing door omkering.
Vervolgens incubeert u de cellen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens vijf druppels vers fixeermiddel toe en meng opnieuw door omkering. Spin vervolgens de cellen naar beneden na het hersuspenderen van de pellet in een milliliter supernatant, voeg vijf milliliters vers fixeermiddel toe, druppel voor druppel terwijl u pulseert op een vortex en incubeert u de cellen en een extra 10 milliliters fixeermiddel bij kamertemperatuur.
Na 30 minuten, pellet de cellen en verwijder alles behalve een milliliter van het fixeermiddel. Na het wassen van de cellen, twee keer meer in 15 milliliters fixeermiddel, hersuspendeer de pellet in de laatste 70 microliters van het supernatant. Plaats nu gelabelde dia's onder een hoek van 35 graden in een vochtigheidskamer ingesteld op 22,9 graden Celsius en 52%vochtigheid.
Laat 35 microliters van de hersuspendeerde B-cellen op elke dia vallen, waarbij u twee dia's per monster bereidt. Laat de dia's vervolgens 30 minuten drogen in de vochtigheidskamer en bewaar de dia's in een dia-box bij 37 graden Celsius tot ze helemaal droog zijn. Eenmaal droog, gebruikt u een diamantstift om een gebied van 18 bij 18 millimeter voor hybridisatie op de achterkant van elke dia te markeren om de dia's te denatureren voor vis.
Breng vervolgens 120 microliters van 70% gedeïoniseerd formamidaat aan op 24 millimeter bij 60 millimeter dekglasjes en breng vervolgens elke dia aan op een dekglas. Denatureer de dia's op een 80 graden Celsius hotplate gedurende 90 seconden en schuif vervolgens snel en voorzichtig de dekglazen af en achtereenvolgens. Plaats de dia's in ijskoud 70, 90 en 100%Ethanol gedurende drie minuten. Nadat de dia's zijn opgedroogd, plaatst u de dia's in een vochtige kamer en brengt u pre-need sondevloeistof aan op de gemarkeerde gebieden op de dia's.
Bedek de sondevloeistof met een 18 bij 18 millimeter dekglas en incubeer de dia's bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Was vervolgens de dia's in voorwaarschuwd twee XSSC met schudden. Na vijf minuten, breng 35 microliters moyal montagemedium aan op de dia's.
Bedek het medium met 24 millimeter bij 60 millimeter dekglasjes en bewaar de dia's bij vier graden Celsius. Analyseer ten slotte de metafase dia's met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop. Metafase chromosomen afkomstig van één muiscel zouden een discreet cluster moeten vormen dat 40 chromosomen bevat.
Elk chromosoom heeft een centromeer aan één uiteinde, dicht bij twee telomere signalen, evenals
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol heeft tot doel genomische instabiliteit in B-lymfocyten van muizen te kwantificeren door chromosoomaberraties te observeren. De methode omvat het isoleren van B-cellen, het prepareren van metafase-spreads en het gebruik van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om telomere DNA-herhalingen te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Genomica
- Celbiologie
- DNA-reparatiemechanismen
Achtergrond
- DNA-reparatiepaden zijn essentieel voor het behoud van de genomische integriteit.
- Chromosoomaberraties kunnen leiden tot mutaties en kanker.
- Het begrijpen van deze paden kan helpen bij het identificeren van genen die de genomische stabiliteit bevorderen.
- Deze studie maakt gebruik van muismodellen om deze mechanismen te onderzoeken.
Doel van de studie
- Om genomische instabiliteit in muizen B-lymfocyten te kwantificeren.
- Om chromosoomaberraties waar te nemen en te analyseren.
- Om het begrip van DNA-reparatiepaden te vergroten.
Gebruikte methoden
- Isolatie van B-cellen voor primaire celkweek.
- Fixatie van cellen ter voorbereiding van metafase-spreads.
- Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) voor visualisatie van telomeren.
- Kwantificering van chromosomaal aberrantie met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van fluorescentielabelled telomeren.
- Kwantificering van diverse typen chromosoomaberraties.
- Inzicht in de rol van DNA-reparatiepaden bij genomische stabiliteit.
- Potentiële identificatie van genen die betrokken zijn bij het behoud van genomische integriteit.
Conclusies
- Het protocol kwantificeert op effectieve wijze genomische instabiliteit in B-lymfocyten.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van kankermechanismen.
- Deze methode kan worden toegepast in andere studies naar genomische stabiliteit.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het kwantificeren van genomische instabiliteit in primaire B-lymfocyten van muizen met behulp van PNA-FISH maakt een nauwkeurige analyse van DNA-reparatiemechanismen mogelijk in vroege discovery-fasen. Deze aanpak ondersteunt mechanistische risicoreductie en targetvalidatie door chromosomale aberraties direct te visualiseren, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen over de modulatie van DNA-reparatiepaden. De snelle, kwantitatieve resultaten van deze methode faciliteren de translationele continuïteit van genetische modelvalidatie naar preklinisch onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Directe visualisatie van chromosoomaberraties maakt functionele beoordeling van knock-outs van DNA-reparatiegenen mogelijk.
- Kwantitatieve analyse van genomische instabiliteit ondersteunt mechanische risicoanalyse voor targetvalidatie.
- Het gebruik van primaire B-lymfocyten vermindert storende secundaire mutaties, wat het voorspellend vertrouwen vergroot.
- Ondersteunt de triage van DNA-reparatietargets op basis van waargenomen chromosomale uitkomsten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- PNA-FISH-labeling standaardiseert de detectie van telomeer-geassocieerde aberraties voor reproduceerbare resultaten.
- De bereiding van metafase-spreidingen uit primaire cellen maakt schaalbare assay-ontwikkeling voor genomische instabiliteit mogelijk.
- Kwantitatieve microscopie-outputs faciliteren een betrouwbare vergelijking tussen verschillende genetische achtergronden.
- De gereedheid van de assay wordt verbeterd door de hoge mitotische index en normale ploidie van B-lymfocyten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Afstemming met ziekte-relevante DNA-reparatiepaden ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Continuïteit van genetische modelvalidatie naar preklinische beoordeling van interventies voor genomische stabiliteit.
- Kwantitatieve resultaten informeren de risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van DNA-reparatiemodulatoren.
- Ondersteunt de mechanistische koppeling tussen genomische instabiliteit en tumorigenisch risico in preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert het proces vanaf de vroege ontdekking tot en met de identificatie van lead-verbindingen en de preklinische validatie voor targets van DNA-herstel.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetesten van de functie van DNA-reparatiegenen mogelijk via directe chromosomale read-outs.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve assay-outputs voor genomische instabiliteit in verschillende modellen.
- Analytica: Levert meetbare eindpunten—chromosoombreuken, fusies en translocaties—voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers door chromosomale aberraties te koppelen aan ziekte mechanismen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Aanpasbaar aan andere primaire celtypen en genetische achtergronden voor breed nut binnen R&D.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van DNA-reparatietargets en het mechanistisch verminderen van risico's.
- Operationele waarde: Standaardiseert de kwantificering van genomische instabiliteit met reproduceerbare, schaalbare workflows.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen voor de modulatie van DNA-reparatiepaden, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van DNA-reparatietargets en preklinische kandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celisolatie, de bereiding van metafase-spreidingen en fluorescentiemicroscopie.
- Toegang tot PNA-FISH-probes, hoogwaardige beeldsystemen en analytische infrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie van de metafase-bereiding en probe-hybridisatie is cruciaal voor de reproduceerbaarheid.
- Aanpassing aan andere celtypen kan protocoloptimalisatie vereisen voor de mitotische index en ploidie.
- Potentiële technische beperkingen omvatten fouten bij de probe-bereiding en hybridisatie-artefacten die de signaaldetectie beïnvloeden.
