Name: Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer hoe je chromosoomafwijkingen in muizen B-lymfocyten analyseert met PNA-FISH. Deze methode kwantificeert genomische instabiliteit via fluorescentiemicroscopie en vergroot het inzicht in DNA-herstelroutes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​R00 CA160574 (SFB) en door een gemeenschap van de Rutgers Biotechnologie Training Program (naar SMM).

Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan Rutgers, de State University van New Jersey. Muizen werden behandeld in overeenstemming met de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Wetenschappers moeten hun nationale en institutionele dierlijke organisaties raadplegen voor gevestigde en erkende richtlijnen. Voordat u begint, voor te bereiden van de in tabel 1 vermelde oplossingen. 1 B Cell Isolatie en Activering Euthanaseren een muis met behulp van CO 2, gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats de muis, zodat de linkerkant van het lichaam is op en spuit de muis met 70% ethanol tot de vacht is vochtig. Ontleden de milt en in een 35 mm weefselkweekplaat met 2 ml wasbuffer. In een laminaire stroming kap voorzichtig breken de milt in de weefselkweek schaal met het vlakke uiteinde van een injectiespuit 5 ml. <ol><li> Plaats een 70 pm nylon mesh in een 50ml buisje en breng de milt monster in 2 ml wasbuffer in de nylon mesh. Voorzichtig verstoren de milt in het gaas met het platte uiteinde van de spuit. </li><li> Spoel de achterkant van de injectiespuit en de 35 mm plaat met 8 ml wasbuffer en filtreer door 70 urn nylon mesh. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig en gooi en resuspendeer de pellet in 3 ml ACK lysis buffer. Pipet op en neer kort om klonten te verstoren en incubeer gedurende 5 minuten. Voeg 10 ml wasbuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet door de bodem van de buis te tikken vervolgens pipetteren in 1 ml wasbuffer. Voeg 50 ul van anti-CD43 MACS micro-kralen en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Voeg 10 ml wasbuffer, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Voeg 10 ml wasbuffer, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Het opzetten van eenMini-MACS kolom door het plaatsen van een kolom aan de MACS magneet. Plaats een gelabelde 15 ml conische buis onder de kolom. Voeg 1 ml wasbuffer naar kolom en laat doorlopen tot de 15 ml buis. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer in 1 ml wasbuffer. Plaats het monster in de kolom na het wassen buffer is doorgelopen. </li><li> Nadat het monster door de kolom, 1 ml wasbuffer op de kolom te wassen. 7 ml wasbuffer direct naar opgevangen monster in de 15 ml buis. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer. Breng de gewenste hoeveelheid cellen die nodig zijn voor 5.000.000 cellen / putje in een 50 ml buis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Supplement B-celmedium met LPS 1: 500 en IL4 1: 1.000. </li><li> Zuig het supernatant en voeg de juiste hoeveelheid aangevuld B celmedium nodig voor eindconcentratie van 1.000.000 cellen / ml. </li><li> Plaat cellen in 6-well platen met 5 ml van cellen bij 1.000.000 cellen / ml en in een bevochtigered celkweek incubator bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 2 B Cell Fixation <ol><li> Voeg 50 ul van colcemide het putje met 5 ml van B-cellen (een eindconcentratie van 100 ng / ml) en incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voorverwarming 75 mM KCl oplossing in een 37 ° C waterbad. Breng de B-cellen een gelabeld 15 ml buis. Bedek het label met tape en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis en resuspendeer de pellet door pipetteren. Voeg 5 ml van de voorverwarmde KCl druppelsgewijs terwijl tikken of pulseren op een vortex. </li><li> Voeg 10 ml van KCl en meng door. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Voeg 5 druppels verse fixatief en meng door. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis en resuspendeer pellet door en neer te pipetteren. </li><li> Voeg 5 ml vers fixatief er druppelsgewijs bij tikken of pulseren op een vortex. Een extra 10 ml fixeermiddel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in tube en resuspendeer door pipetteren. Voeg 14 ml vers fixeermiddel en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Herhaal stap 2.7 tweemaal. </li><li> Voeg 14 ml vers fixeermiddel. Sluit de doppen met Parafilm en bewaar overnacht bij -20 ° C. </li></ol> 3 Voorbereiding van de metafase chromosoom Spreads <ol><li> Stel een gereguleerd klimaatkamer tot 22,9 ° C en 52% luchtvochtigheid. </li><li> Centrifugeer de vaste B-cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig fixeermiddel verlaten 70 ul in de buis en resuspendeer door pipetteren. </li><li> Plaats het label dia&#39;s in de vochtige kamer bij een 35 ° hoek. Drop 35 ul van de geresuspendeerde B-cellen op een dia en drop twee glaasjes per monster. Laat de dia&#39;s te drogen in de vochtige kamer gedurende 30 minuten vervolgens de dia&#39;s op te slaanin een dia doos bij 37 ° C. </li></ol> 4 telomeren PNA FISH <ol><li> Bereiding van Probe <ol><li> Pre-warm gedeïoniseerd formamide bij 37 ° C. Meng 2 ui telomere PNA probe met 7 pl gedeioniseerd voorverwarmde formamide en incubeer bij 37 ° C onder schudden gedurende 1 uur. </li><li> Pre-warme FISH master mix tot 37 ° C. Voeg 7 ul voorverwarmde FISH master mix aan het mengsel van stap 4.1.1 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 uur. </li><li> Denatureren de sonde mengsel gedurende 8 minuten bij 80 ° C. Pre-de probe hybridiseren gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Voorbehandeling van chromosoom Slides <ol><li> Pre-warm een ​​glasplaatje-kleuring pot bevattende 50 ml 0,01 M HCl tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Plaats de glaasjes in een andere objectglaasje-kleuring pot met 2x SSC gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voeg 2 pl pepsine bouillon aan de voorverwarmde glasplaatje-kleuring pot en meng door. Breng de dia&#39;s aan dit glas slide-kleuring pot en incubeer 90 seconden bij 37 ° C. </li><li> Was de dia 2x in een andere objectglaasje-kleuring pot met 1x PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur schudden. Was daarna de objectglaasjes gedurende 5 min in 1x PBS / MgCl2 bij kamertemperatuur schudden. </li><li> Breng de dia een glasplaatje-kleuring pot die vers bereide 1% formaldehyde / 1x PBS / MgCl2 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was de dia&#39;s voor 5 min in een andere objectglaasje-kleuring pot met 1x PBS bij kamertemperatuur schudden. </li><li> Bereid een ethanol uitdroging serie van met verschillende glasplaatje-kleurbakjes bevattende 70%, 90% en 100% ethanol. </li><li> Breng de objectglaasjes elke pot gedurende 3 minuten, te beginnen met 70% ethanol, vervolgens 90% ethanol en vervolgens 100% ethanol. Plaats ethanol potten bij -20 ° C als u klaar bent. </li><li> Laat de dia&#39;s aan de lucht drogen door een teveel ethanol te tikken op een papieren handdoek en stutten dia&#39;s in een 35 ° hoek. Eenmaal droog, mark een 18 x 18 mm stippellijn voor hybridisatie op de achterkant van de objectglaasjes met een diamant pen. </li></ol></li><li> Denaturatie van Dia&#39;s voor FISH <ol><li> Solliciteer 120 ul 70% gedeïoniseerd formamide / 2X SSC tot een 24 x 60 mm dekglaasje. Tik op de schuif om het dekglaasje. Denatureren de glijbaan bij 80 ° C op een hete plaat gedurende 90 sec. </li><li> Snel en voorzichtig schuif het dekglaasje en plaats de dia in ijskoude 70% ethanol gedurende 3 min, gevolgd door 90% ethanol en 100% ethanol elk voor 3 minuten. Laat de glaasjes aan de lucht drogen. </li><li> Bereid een vochtige kamer door de voering van een plastic doos met een strakke deksel en nat vloeipapier. Het papier moet vochtig, maar niet verzadigd met water. </li><li> In een vochtige kamer, passen de pre-gehybridiseerde probe-mengsel uit stap 4.1.3 tot het gemarkeerde gebied op de dia, bedekken met een 18 x 18 mm dekglaasje en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> Post-incubatie Wast <ol><li> Voorverwarmen 50% formamide / 2 x SSC, 1 x SSC en 4x SSC / 0,1% Tween-20 in een 45 °, C waterbad. </li><li> Verwijder voorzichtig de dekglaasjes en het wassen van de objectglaasjes in de voorverwarmde 50% formamide / 2x SSC 3xfor 5 min elk in het donker en schudden. Was de dia&#39;s in de voorverwarmde 1x SSC 3xfor 5 minuten elk, schudden. Tot slot, was de dia&#39;s in voorverwarmde 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 min elk. </li><li> Vlekken op de dia&#39;s voor 3 min in DAPI in een licht beschermde glasplaatje kleuring pot. </li><li> Was de dia&#39;s voor 5 min in 2x SSC, schudden. Breng 35 pl Mowiol fixeermiddel, behandel met 24 x 60 mm dekglaasjes en de glijbanen bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5 Microscopische analyse van Chromosomen <ol><li> Analyseer de metafase dia&#39;s met behulp van een standaard epi-fluorescentie microscoop. Gebruik een imaging platform met een geautomatiseerd stadium zoals de MetaSystems Metafer platform om de beste resultaten te verkrijgen. Voor elke metafase spread, voor het fluorescerend signaal van de telomeren p eentje op te halen het ene beeld voor DAPI fluorescentie om chromosomen te visualiseren, engewaad. (Bijvoorbeeld Cy3- andere fluoren zijn en even goed werken.) </li><li> Overlay van de beelden met een beeldanalyse programma en analyseren. </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Dat geactiveerde B-lymfocyten zijn bijzonder geschikt voor bereiding van mitotische chromosomen smeersels kunnen andere celtypes worden gebruikt. T lymfocyten hebben veel van de voordelen van B-cellen, zoals ze kunnen worden gezuiverd uit de milt of lymfeknopen, en hebben een hoge mitotische index wanneer gestimuleerd door groei in medium dat adequate mitogenen 8. Embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn ook geschikt voor metafase chromosoom analyse 9. Indien deze niet beschikbaar zijn, kan fibroblas...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Kanker wordt veroorzaakt door de accumulatie van mutaties die genen die normale celgroei reguleren. Mutatie is een gevolg van veranderingen in de structuur en sequentie van het genoom veroorzaakt door beschadiging van DNA. DNA schade kan ontstaan ​​door een verscheidenheid van proces, waaronder exogene middelen zoals ioniserende straling, en als een bijproduct van normale cellulaire metabolisme zoals spontane deaminatie van nucleotide basen of schade ontstaat contact met reactieve zuurstof species 1. Hoewel zoogdiercellen een scala aan reparatie activiteiten die DNA-schade kan terugdraaien of herstellen van de volgorde bij breuk locaties bezitten, mutaties toch verzamelen gedurende de levensduur van een cel. DNA schade kan bovendien bijdragen tot senescentie en verlies van vermogen van stamcellen, twee processen die zijn geassocieerd met veroudering geassocieerde ziekte 2. Inzicht in de reparatie van DNA-schade is daarom van vitaal belang voor het aanpakken van twee tekenificant vraagstukken in volksgezondheid. Meer gegevens suggereren dat zoogdier-DNA herstelmechanismen kan bijdragen aan de evolutie van de kankercel genoom 3,4, waardoor het nog noodzakelijk om de bij het ​​onderdrukken mutatie op moleculair niveau processen te begrijpen. Directe visualisatie van chromosoomafwijkingen is een krachtige en kwantitatieve wijze bepalen van de mate van genomische instabiliteit in een bepaald celtype. Gecondenseerde chromosomen uit cellen in metafase kan worden geïsoleerd en geïnspecteerd door licht of fluorescentiemicroscopie. Dergelijke cytogenetische benaderingen in de praktijk al tientallen jaren en kan worden gebruikt om het uiterlijk van translocaties of specifieke types chromosoomafwijkingen aan een verminderde DNA reparatiewerkzaamheden tonen. Het protocol leent zich voor verschillende potentiële extensies: chromosomen kunnen met probes voor spectrale karyotypering (SKY) of meerkleurige fluorescerende in situ hybridisatie worden geëtiketteerd(MFISH) om translocaties 5,6 identificeren. Deze technieken de frequentie van chromosoom translocaties en de structuur van complexe chromosoom translocaties te bepalen, die aanvullende informatie biedt dan wat er mogelijk is met dit protocol in te schakelen ook. Alternatief kunnen sequentie-specifieke probes gegenereerd en gebruikt om de frequentie van DNA breuken testen geselecteerde genome locaties 7. In dit protocol beschrijven we bereiding van metafase chromosoom spreads van B lymfocyten. Een fluorescentie-gemerkt peptide nucleïnezuur (PNA) probe voor telomeer herhalingen gebruikt, die efficiënt merken telomeren in metafase chromosoom spreads Dit protocol heeft verschillende voordelen. B-cellen kunnen worden geïnduceerd te groeien bij hoge mitotische index zodat hoogwaardige spreads logischerwijze kan worden geproduceerd. B-cellen van genetisch gemodificeerde muizen zijn ook veel minder waarschijnlijk secundaire genetische mutaties die de analyse van de bijdrage kan verwarren bevattenspecifieke genen genomische integriteit. De PNA-FISH aanpak kan in een dag worden afgerond, en maakt het mogelijk nauwkeuriger scoring van chromosoom breekt. Door deze benadering, met name in combinatie met specifieke apparatuur beschreven in dit protocol is het mogelijk om zeer consistent hoge kwaliteit spreads produceren en snel analyseren de snelheid en aard van genomische instabiliteit.

<table><tbody><tr><td>50% Dextran sulfate</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu;g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomere Probe</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) micro-beads</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snelle analyse van chromosoomafwijkingen in muis b-lymfocyten door pna-fish

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defecte DNA herstel leidt tot genomische instabiliteit, wat de oorzaak van mutaties die leiden tot tumorvorming toegenomen. Analyse van de frequentie en de aard van de chromosoomafwijkingen in verschillende celtypes laat defecten in DNA-herstel trajecten worden opgehelderd. Inzicht zoogdieren DNA-reparatie biologie is enorm geholpen door de productie van muizen met uitstoters in specifieke genen. Het doel van dit protocol is om genomische instabiliteit in de muis B-lymfocyten te kwantificeren. Etikettering van de telomeren met PNA-FISH probes (peptide nucleïnezuur - fluorescerende in situ hybridisatie) vergemakkelijkt de snelle analyse van genomische instabiliteit in metafase chromosoom spreads. B-cellen hebben specifieke voordelen ten opzichte van fibroblasten, omdat ze normaal ploïdie en een hogere mitotische index. Korte termijn kweek van B-cellen kunnen dus nauwkeurige meting van genomische instabiliteit in een primaire celpopulatie die waarschijnlijk minder secundaire genetische mutaties dan is typisch in getransformeerde fibroblasten of patiënt cellijnen.

Metafase chromosomen afkomstig ve cel moet een discrete cluster met 40 chromosomen (bij gebruik muizencellen) (Figuur 1A) vormen. Elk chromosoom een ​​centromeer aan een einde, die zichtbaar als een lichtblauwe bol. In normale chromosomen, zijn twee telomeer signalen van eind van de chromatiden en twee signalen door elke centromeer. Interfase kernen zal aanwezig zijn op de foto ook. Deze zijn zichtbaar als blauwe bollen, rode telomere signalen, maar geen gecondenseerde chromosomen (zie bijvoorbeeld <str...

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om genomische instabiliteit in muis B-lymfocyten te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de B-cellen te isoleren voor primaire celkweek. Vervolgens worden de cellen gefixeerd om de voorbereiding van de metafase-spreidingen te vergemakkelijken.Ten slotte wordt telomere PNA vis uitgevoerd voor visualisatie van de fluorescentie gelabelde telomeren. Uiteindelijk kan het niveau van verschillende soorten chromosoomafwwijkingen worden gekwantificeerd door middel van fluorescentiemicroscopie. De implicaties van deze techniek kunnen ons begrip van de DNA-herstelroutes uitbreiden, omdat het kan helpen bij het identificeren van genen die genomische stabiliteit bevorderen in onze gerichte muismodellen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in chromosoombreuken en andere grote chromosomale herschikkingen, kan deze ook worden aangepast om andere vormen van genomische instabiliteit zoals translocaties te meten. Om de B-cellen te isoleren, begint u door een vers geïsoleerde milt in een 35 millimeter weefselkweekschaal te plaatsen met twee milliliters spoelbuffer in een laminaire stromingskast. Gebruik vervolgens de achterkant van de plunjer va

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit levende cellen zoals lymfocyten of huidfibroblasten en organismen, met inbegrip van mensen of muizen. Deze chromosoom preparaten kunnen verder worden gebruikt voor routinematige G-banding en moleculaire cytogenetische procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY).

Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Dit protocol beschrijft technieken voor de kwantificatie en karakterisatie van chromosomale afwijkingen in vitro in RAW264.7 muis macrofagen na behandeling met de lucht zwevende deeltjes.

Analyse van de Ambient Particulate Matter-geïnduceerde chromosomale afwijkingen met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Systeem

Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Hier wordt een test gepresenteerd om somatische hypermutatie binnen de immunoglobuline zware keten gen locus te kwantificeren met behulp van germinale centrum B cellen van muis Peyer's patches.

Analyse van somatische hypermutatie in de JH4-intron van Germinal Center B-cellen van Mouse Peyer's Patches

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Leer hoe je chromosoomafwijkingen in muizen B-lymfocyten analyseert met PNA-FISH. Deze methode kwantificeert genomische instabiliteit via fluorescentiemicroscopie en vergroot het inzicht in DNA-herstelroutes.

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Meer video's verkennen