Gladde blaasspier Strip Contractiliteit als een methode om te evalueren Lower Urinary Tract Farmacologie
18 augustus 2014
Dit handschrift bevat een eenvoudige, maar krachtige, in vitro methode voor het evalueren van de gladde spieren contractiliteit in reactie op farmacologische middelen of zenuwstimulatie. Belangrijkste toepassingen zijn het testen van geneesmiddelen en begrip weefsel fysiologie, farmacologie en pathologie.
Het algemene doel van deze procedure is om de fysiologische en farmacologische eigenschappen van gladde spierweefsel van de blaas te evalueren. Dit wordt bereikt door de rattenblaas te disseceren, deze open te snijden tot een platte plaat en strips te snijden die het urotheel, gladde spieren en zenuwen bevatten. In de tweede stap wordt het weefsel bevestigd aan een krachttransducer verbonden met versterkers en stimulators voor het meten van de spiercontractiliteit.
In de volgende stap worden de baseline tonus en weefselviabiliteit vastgesteld en vervolgens worden de strips blootgesteld aan farmacologische en/of elektrische stimulatie. Uiteindelijk kunnen de effecten van de stimuli op de contractiliteit van het gladde spierweefsel van de blaas worden gemeten. Deze methode wordt gebruikt om de effecten van pathologische en farmacologische verbindingen op de hele blaas te karakteriseren, evenals specifieke blaasweefselcomponenten zoals de gladde spierzenuwen in het urotheel, bij zowel mensen als dieren.
Deze techniek is uitgebreid gebruikt tijdens de ontwikkeling van therapieën voor verschillende blaasfunctiestoornissen omdat het een snelle, eenvoudige en reproduceerbare screeningmethode voor farmacologische middelen is in een goed gedefinieerde en gecontroleerde omgeving. Na bevestiging van anesthesie door verlies van reflex van de achterpoten, scheer het buikgedeelte van het dier en bloot stel vervolgens de bekkenorganen via een abdominale middenlijnsnede. Identificeer vervolgens de blaas en urethra en snijd vervolgens bij de blaashals dicht bij de proximale urethra.
Om de blaas te verwijderen, plaats het weefsel onmiddellijk in een met geaëreerd Creb-oplossing gecoate schaal. Na het doden van het dier, steek vervolgens weefseldissectiepennen door de hals en urineleider van de blaas om het weefsel te stabiliseren voor verdere dissectie zonder het weefsel uit te rekken. Snijd het overtollige weefsel van de blaas en open vervolgens het weefsel van de basis tot de koepel om een platte cirrosezijde naar beneden en luminaalzijde naar boven te creëren.
Plaats dissectiepennen op elke hoek van het weefsel en verwijder vervolgens het blaas-, hals- en koepelweefsel. Snijd vervolgens het weefsel in de lengterichting van de basis tot de koepel in ongeveer twee bij acht millimeter stroken, en bevestig een weefselklem aan beide uiteinden van elke strook. Breng de stroken over naar de experimentele kamers en bevestig één uiteinde van elke strook aan een krachttransducer en de andere aan een vaste staaf.
Rek nu voorzichtig de weefsels uit totdat de baseline spanning een gram bereikt. Aanvankelijk heeft het weefsel de neiging te ontspannen, wat wordt geregistreerd als een afname van de baseline spanning. Was de stroken ongeveer elke 15 minuten met warm geaëreerd crebs en pas de baseline spanning aan tot één gram.
Na elke wassing, laat de weefsels ongeveer één tot twee uur gelijkmaken totdat ze niet langer ontspannen. Zodra de baseline spanning stabiel is, voeg direct kaliumchloride toe aan het bad gedurende vijf minuten of totdat een plateaurespons wordt bereikt om de weefselviabiliteit te testen. Was vervolgens de weefsels drie tot vijf keer met warm geaëreerd crebs om het weefsel toe te laten keren naar hun pre-behandelingscondities.
Voor farmacologische stimulatie van gladde spieren, voeg geneesmiddelen van geconcentreerde oplossingen direct toe aan het bad. Voeg bijvoorbeeld voor carbachol stimulatie 10 microliter van elke concentratie van het stimulans toe aan elke 10 milliliter weefselbad. Zodra het antwoord van de vorige concentratie een plateau bereikt.
Voeg in parallelle stroken gelijke hoeveelheden van het voertuig voor neurale stimulatie van de gladde spier of elektrische veldstimulatie toe. Stel de treinduur in op drie tot 10 seconden en het interval tussen de treinen op minimaal één minuut. Na het vaststellen van de frequentie van de treinstimulatie, voer een frequentieresponscurve uit van 0,5 tot 50 hertz om de intensiteit van de stimulus vast te stellen.
Verhoog systematisch de spanning totdat de amplitude van de contracties een plateau bereikt, terwijl de frequentie constant blijft. Zodra de stimulatieparameters zijn vastgesteld, laat ongeveer 20 tot 30 minuten voor de elektrische veldstimulatie, geëvoqueerde contracties stabiliseren voordat geneesmiddelen worden getest. Om vervolgens de effecten van alfa-bèta-methyleen a TP en atropine op de elektrische veldstimulatie te testen, voer bijvoorbeeld twee controlefrequentieresponscurven uit en voeg vervolgens 10 microliter alfa-bèta-methyleen a TP toe aan de teststrook en 10 microliter voertuig aan de controlestrookjes.
Alfa-bèta-methyleen A TP stimuleert direct de purinereceptoren in de gladde spier en desensibiliseert deze receptoren waardoor een initiële baselinecontractie ontstaat. Nadat het antwoord is teruggekeerd naar de baseline, herhaal de frequentieresponscurven in alle stroken. Voeg 10 microliter atropine toe aan de teststrook en 10 microliter voertuig aan de controlestrookjes en herhaal de frequentieresponscurven aan het einde van de elektrische veldstimulatie.
Verifieer de selectiviteit van de elektrische veldstimulatie door de neurale transmissie te blokkeren met de natriumkanaalblokker tetra to toxin. Ontkoppel vervolgens de stroken. Blokkeer ze voorzichtig op een stuk weefselpapier om eventuele extra vloeistof te elimineren en meet het gewicht van elke strook op een weegschaal om de effecten op de gladde spierspanning te bepalen.
Gebruik de geschikte gegevensanalysesoftware om een venster van minimaal 10 tot 30 seconden vóór en op het hoogtepunt van de geneesmiddelgeïnduceerde respons te selecteren en meet de amplitude van de contractie om de effecten van de experimentele behandelingen op neurale geëvoqueerde contracties te bepalen. Meet de amplitude, duur en oppervlakte onder de curve van minimaal drie contracties vóór en op het hoogtepunt van de geneesmiddelgeïnduceerde respons. Normaliseer ten slotte de gegevens om de resultaten over de stroken en farmacologische behandelingen te vergelijken.
Spontane myogene activiteit is een eigenschap van gladde spieren die verandert tijdens postnatale ontwikkeling en pathologie. In dit representatieve experiment vertonen strips van neonatale ratten grote amplitude, lage frequentie ritmische contracties,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript presenteert een methode voor het evalueren van de fysiologische en farmacologische eigenschappen van glad spierweefsel van de blaas. De techniek omvat het dissekeren van de rattenblaas en het meten van de spiercontractiliteit als reactie op farmacologische agentia of zenuwstimulatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Farmacologie
- Fysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de contractiliteit van glad spierweefsel is cruciaal voor het screenen van geneesmiddelen.
- De methode biedt inzicht in de fysiologie en pathologie van weefsels.
- Glad spierweefsel van de blaas is essentieel voor de urinairfunctie.
- Het evalueren van de contractiliteit kan helpen bij het begrijpen van diverse blaasaandoeningen.
Doel van de studie
- Om de effecten van farmacologische en elektrische stimuli op de gladde spieren van de blaas te karakteriseren.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het beoordelen van de weefsellevensvatbaarheid en contractiliteit.
- Om screeningprocessen voor geneesmiddelen bij blaasgerelateerde aandoeningen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de rattenblaas tot een plat vel.
- Uitsnijden van stroken met urotheel, gladde spieren en zenuwen.
- Bevestiging van het weefsel aan een krachttransducer voor het meten van de contractiliteit.
- Blootstelling van de stroken aan farmacologische en elektrische stimulatie.
Belangrijkste resultaten
- De basistonus en de weefsellevensvatbaarheid zijn succesvol vastgesteld.
- De contractiliteitsresponsen op stimuli zijn nauwkeurig gemeten.
- De methode heeft de effecten van verschillende verbindingen effectief gekarakteriseerd.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstige farmacologische studies informeren.
Conclusies
- Deze methode is een krachtig instrument voor het evalueren van de contractiliteit van glad spierweefsel in de blaas.
- Het kan helpen bij het begrijpen van de blaasfysiologie en -farmacologie.
- De aanpak is toepasbaar op zowel menselijke als dierlijke studies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Contractiliteitsmetingen van gladspierstrips uit de blaas bieden een robuust in vitro platform voor het evalueren van farmacologische en fysiologische reacties die relevant zijn voor aandoeningen van de lagere urinewegen. Deze methode maakt een nauwkeurige analyse van drugeffecten, neurotransmissie en weefselspecifieke mechanismen mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van urologische geneesmiddelen. De reproduceerbaarheid en aanpasbaarheid over verschillende soorten en pathologische toestanden maken het tot een essentieel instrument voor portfoliotriage en de continuïteit van translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe beoordeling mogelijk van drugseffecten op de contractiliteit van de gladde spiercellen van de blaas en de neurotransmissie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door responsen van glad spierweefsel, mucosa en zenuwen te isoleren.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via kwantitatieve contractiliteitsmetingen.
- Maakt evaluatie mogelijk van ziekterelateerde veranderingen, zoals wijzigingen na letsel of tijdens de ontwikkeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar, gecontroleerd systeem voor het screenen van farmacologische middelen die de blaasfunctie beïnvloeden.
- Standaardiseert assay-condities voor kruisvergelijking van verbindingen en weefseltypen.
- Genereert kwantitatieve resultaten (amplitude, duur, oppervlakte onder de curve) voor een robuuste evaluatie van verbindingen.
- Maakt schaalbaarheid en hergebruik van het platform mogelijk over verschillende soorten en experimentele condities heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt preklinische bevindingen met ziekte-relevante mechanismen die zijn waargenomen in menselijke en dierlijke weefsels.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het modelleren van pathologische en ontwikkelingsstadia.
- Faciliteert beslissingen over risicogecorrigeerde voortgang op basis van functionele weefselresponsen.
- Maakt beoordeling van soort- en orgaanverschillen in de farmacologische respons mogelijk.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze contractiliteitsanalyse vormt de brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinische validatie door een gestandaardiseerde, kwantitatieve weergave van de functie van blaasweefsel te bieden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van neurotransmitterpaden en receptorfuncties in blaasweefsel.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve contractiliteitsgegevens voor de triage en optimalisatie van verbindingen.
- Analytiek: Maakt meting van amplitude, duur en oppervlak onder de curve mogelijk voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Modelleert ziekte- en ontwikkelingsstadia om de afstemming van biomarkers en therapeutische strategieën te informeren.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een gevalideerd, aanpasbaar platform voor doorlopende farmacologische en mechanistische studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van farmacologische assays voor de blaas.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste functionele gegevens.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van urologische geneesmiddelkandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, contractiliteitsmeting en data-analyse.
- Vereist instrumentatie zoals krachttransducers, versterkers en datas acquisitiesystemen.
- Vereist standaardisatie van assayprotocollen en analytische methoden over teams heen.
- Aanpasbaar aan diverse soorten, ontwikkelingsstadia en pathologische modellen.
- Aandacht voor drugconcentratie, timing en stimulatieparameters is cruciaal voor de dataintegriteit.
