Name: A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Leer een nieuwe gentransfertechniek voor osteoclastdifferentiatie in vivo en in vitro met muizen en humane cellen. Deze methode onderzoekt cytokine-effecten op botbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-onderzoekssubsidies R01 AR062173 en SHC 250862 aan IEA. ES is de ontvanger van NIH T32 CTSC-predoctorale beurs.

1. Hydrodynamische Levering van sRANKL MC DNA <ol><li> Hydrodynamische Levering via Muisstaartje Vein <ol><li> Weeg de muis voordat de staart ader injectie. Verdun sRANKL of groen fluorescerend eiwit (GFP) MC in Ringer&#39;s oplossing (voorverwarmen bij 37 ° C) in een totaal volume van ~ 10% van de muis lichaamsgewicht. </li><li> Warm de muis in een kooi voor 10 minuten voorafgaand aan de injectie om de bloedvaten verwijden en maak zijnerven (GW) zichtbaar. Bewaak de muis zorgvuldig om uitdroging en hyperthermie te voorkomen. </li><li> Zodra de LVs zijn verwijde en zichtbaar, de overdracht van de muis om de restrainer en steek de stekker ver genoeg in het vat om beweging te beperken. Monitor de muis voor normale activiteit zoals ademhaling. Pas de stekker van restrainer indien nodig. </li><li> Ontsmet de injectieplaats 3/4 van de punt van de staart met een alcoholdoekje. Gebruik een 27-30 G naald voor muis staartaderinjectie. Houd de staart stevig met een hand en steek de naald inde staartader. Oefen druk uit op de spuit en vul de injectie binnen 5-7 sec. </li><li> Haal de naald uit de staart ader en druk uit te oefenen met een watje op de injectieplaats te stoppen met bloeden. Monitor de muis voor 15-30 minuten, breng de muis terug naar vivarium zodra de ademhaling tarief wordt verlaagd tot het normale tarief. </li></ol></li><li> Bevestiging van Systemische Muis sRANKL Expressie en kwantificering van Muis Serum TRACP5b bericht Gene Transfer <ol><li> Warm de muis in een kooi gedurende 5-10 minuten om de bloedvaten verwijden en maak LVs zichtbaar. Bewaak de muis zorgvuldig om uitdroging en hyperthermie te voorkomen. </li><li> Maak een kleine incisie met een mes aan de staart van de muis op een site een kwart van de punt van de staart. </li><li> Verzamel ongeveer 100 pi bloed serum verdeelbuizen. </li><li> Incubeer serumafscheiding buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 5 minuten en verzamel het serum. Store serum -80 ° C voor verdere analyse. </li><li> Voer sRANKL ELISA en muisserum TRACP5b test op serum monsters met behulp van een commercieel verkrijgbare kit. </li></ol></li></ol> 2. In vitro Osteoclast Generatie van Mouse BMMs <ol><li> Isolatie en kweken van BMMs <ol><li> Isolatie van het scheenbeen en het dijbeen botten: Euthanaseren de donor muis met CO 2, en desinfecteer de benen met 70% ethanol. Ontleden van het schaambeen naar de calcaneus bot, aan het bovenbeen en onderbeen botten intact te verwijderen. </li><li> Verwijder de huid en spieren voorzichtig zonder beschadiging van het bot. Plaats verwerkt femur en tibia in een petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Verwijdering van het beenmerg: Snij het puntje aan de ene kant van het bovenbeen en onderbeen botten en spoel het beenmerg in een 50 ml buis met behulp van een 1 ml spuit met een 25 G naald, geladen met α-MEM bevattende 1% penicilline / streptomycine (Osteoclast Cultuur Medium / OCM). </li><li&gt; Proces beenmerg: Meng en breng beenmerg schorsing om een ​​nieuwe 50 ml tube door het door een 70 um nylon cel zeef. Centrifugeer de cellen op 300 xg en opnieuw te schorten in α-MEM dat 1% penicilline / streptomycine en 10% FBS (Osteoclast Cultuur medium / OCM (+)). </li></ol></li><li> Cultuur van macrofagen <ol><li> Tellen cellen met behulp van een hemocytometer of automatische cel teller. </li><li> Plaat 1 x 10 6 cellen per putje van een 6-well plaat of 3 x 10 5 cellen op glazen dekglaasjes (5 mm) of dentineplakjes geplaatst in 96-well plaat en incubeer bij 37 ° C. </li><li> Zuig alle media met niet-hechtende cellen en incubeer cellen bij 37 ° C met verse OCM (+) met 25 ng / ml muis M-CSF gedurende 48 uur. </li><li> Zuig alle media en incubeer cellen bij 37 ° C met verse OCM (+) medium dat 25 ng / ml muis M-CSF en 30 ng / ml muis sRANKL osteoclastogenese te initiëren. Vullen media om de 3 dagen, zoals vereist. </li><li> Groeien cellenongeveer 6-8 dagen tot reusachtige multinucleaire cellen kunnen resorbeerbare botvorming. Zodra meerkernige cellen blijken, voeren TRAP (tartraat resistente zure fosfatase) kleuring met behulp van een commercieel verkrijgbare kit, en wanneer deze volledig gerijpt, voert functionele testen. Visualiseer F-actine ringen op coverslips gebruik phalloidin vlek en het imago van de cellen die aan plakjes dentine door scanning elektronenmicroscopie (SEM), zoals eerder 19 beschreven. </li></ol></li></ol> 3. In vitro osteoclasten Generatie van Human PBMC <ol><li> Isolatie van menselijke PBMC <ol><li> Voeg 10 ml van de voorverwarmde Histopaque-1077 in een 50 ml buis. </li><li> Lege leukocyten filter verkregen uit bloedbank met steriele PBS in een 50 ml buis (1:1 verhouding van bloed met PBS). Het verdunde bloed over de histopaque oplossing heel langzaam in lagen, om ervoor te zorgen dat het bloed niet mengen met de Histopaque. </li><li> Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 20 minuten bij 18 ° C. Volgening centrifugatie voorzichtig isoleren witte buffy coat laag die de witte bloedcellen en naar een nieuwe buis van 50 ml. </li><li> Verdun cellen met PBS en centrifugeer opnieuw bij 650 xg gedurende 5 minuten om de cellen te verzamelen. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in OCM (-) media en tel cellen met behulp van cel teller. </li></ol></li><li> Plating en kweken van PBMCs <ol><li> Resuspendeer de cellen in OCM (+) media en plaat 8 x 10 6 cellen / ml per putje in een 6-well plaat of 1 x 10 6 cellen / ml per putje in 96-well plaat. Plaat cellen op dekglaasjes (5 mm) overeenkomstig immunofluorescentie beeldvorming en op botplakjes voor botresorptie assays zoals eerder beschreven 20. </li><li> Verandering kweekmedia, aanvulling van de cellen met humaan M-CSF elke 2-3 dagen of zoals vereist. Ga dan naar differentiatie stap op dag 5 door toevoeging van 30 ng / ml humaan sRANKL samen met 25 ng / ml humaan M-CSF in OCM (+) media om osteoclastogenes initiërenis. </li><li> Kweek cellen ongeveer 14 tot 21 dagen tot reusachtige multinucleaire cellen vormen. Zodra meerkernige cellen blijken, kunnen deze cellen vervolgens gelabeld voor TRAP, en wanneer volledig gerijpt, kunnen functionele testen worden uitgevoerd. F-actine ringen kunnen worden gevisualiseerd op dekglaasjes met phalloidin vlek. De morfologie van de cel kan worden onderzocht in cellen bevestigd aan plakjes dentine met SEM. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+musculoskeletal+diseases%3A+impact+of+work+disability+and+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+rheumatology.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li>
<li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast%2C+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+%28sODF%29+exhibit+severe+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li>
<li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li>
<li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+tissue+international%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li>
<li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+bone+turnover%2C+bone+marrow+cell+development%2C+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li>
<li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+medicine%22%5BJournal%5D)">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li>
<li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menopausal+transition%3A+analysis+of+LH%2C+FSH%2C+estradiol%2C+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li>
<li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li>
<li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenotropic%2C+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors%3A+dissociation+from+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li>
<li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li>
<li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li>
<li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+deficiency+and+bone+loss%3A+an+inflammatory+tale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li>
<li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li>
<li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li>
<li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+%28ODF%29+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+researc.%2C+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).</li>
<li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis%2C+osteoporosis%2C+cancer%2C+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li>
<li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+osteoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li>
<li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+design%2C+development+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li>
<li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b%3A+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis%2C+osteoclast+formation%2C+and+maintenance+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li>
<li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li>
<li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology%3A+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li>
<li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Musculoskeletale aandoeningen zijn belangrijkste oorzaken van morbiditeit en invaliditeit en zijn samengesteld uit meer dan 150 ziekten en syndromen; die ongeveer 90 miljoen Amerikanen vandaag. Gewrichtsontsteking en botafbraak zijn overheersende kenmerken van musculoskeletale aandoeningen, met inbegrip van artritis en osteoporose. Osteoporose is een aandoening die bot integriteit verzwakt, wat vaak leidt tot breuken van het bot. Artritis is een chronische, invaliderende ziekte die wordt gekenmerkt door een ontsteking v...

Musculoskeletale aandoeningen invloed op miljoenen mensen in de Verenigde Staten en de huidige ernstige gevolgen voor de nationale en lokale systemen gezondheid 1. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door het verlies van bot-en gewrichtsziekten functie die uitgebreide behandeling en lange periodes van herstel nodig hebben. Gewoonlijk, een relatieve toename van het aantal en / of activiteit van osteoclasten, cellen gespecialiseerd bot resorberen, bij osteoporose en artritis waargenomen 2. Onder fysiologische omstandigheden het aantal en de activiteit van osteoclasten wordt geregeld door receptor activator van nucleaire factor κ B-ligand (RANKL), die wordt geproduceerd door osteoblasten. Osteoprotegerine (OPG), is een decoy receptor voor RANKL ook geproduceerd door osteoblasten 3 In vivo diermodellen dat de systemische overexpressie van sRANKL, of verwijdering van OPG betrokken zijn zeer waardevol bij osteoporose onderzoek.; Deze werkwijzen vereisen het genereren van transgene muizen 4,5. Hier, een nieuw alternatiefWerkwijze overexpressie sRANKL voor de studie van spier-gerelateerde stoornissen beschreven. Specifiek minicircle (MC)-DNA-technologie en hydrodynamische levering methoden werden gebruikt om genoverdracht van sRANKL in vivo te bereiken en overexpressie muis sRANKL systemisch 6. Deze methode is ook een aanvulling op andere in vivo modellen van osteoporose, zoals hormonale modulatie van osteoclasten na ovariëctomie 7 en dieetinterventie door laag-calcium dieet 8. Deze modellen zijn zeer nuttig om de verschillende aspecten van het bewegingsapparaat gerelateerde stoornissen maar ze chirurgische procedures vereisen en kan tot enkele maanden, tegen aanzienlijke kosten 9 bestuderen. Ovariëctomie (OVX) knaagdier model is een proefdiermodel waar verwijdering van de eierstokken leidt tot een tekort aan oestrogeen waardoor de menselijke postmenopauzale osteoporose 10 nabootsen. Human postmenopauzale osteoporose, een aandoening waarbij oestrogeen Deficirantie leidt tot een verhoogd risico op botbreuken en osteoporose treft ongeveer acht miljoen vrouwen in de Verenigde Staten alleen. Hoewel de OVX model is handig voor postmenopauzale osteoporose biedt beperkte voordelen in het bestuderen van osteoporose in het algemeen. Oestrogeen onderdrukt botverlies, door het induceren van osteoclasten en osteoblasten remmen apoptose, derhalve in zijn afwezigheid een verhoogde activiteit van de osteoclasten wordt waargenomen 10-12. Een RANKL-OPG-ratio onbalans die botresorptie gunsten is ook waargenomen 13. Echter oestrogeendeficiëntie in vivo ook gepaard met verlaagde transformerende groeifactor β (TGF β), verhoogde interleukine-7 (IL-7) en TNF, IL-1 en IL-6 14,15. Aangezien deze cytokinen bekend botremodellering modulerende functies onafhankelijk van de RANKL-route, is het onmogelijk om eventuele osteoclast activering kenmerk uitsluitend de RANKL RANK-as. De in dit document beschreven model stelt onderzoekers in staat om te studeren in vivo RANKL-RANK as in osteoclastogenese en botverlies zonder pro-inflammatoire cytokines in vergelijking met OVX knaagdier modellen. Bovendien, in vitro osteoclastogenese technieken zijn essentiële instrumenten om osteoclasten activering studeren voor potentiële therapeutische behandelingen van musculoskeletale aandoeningen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat het kweken van muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs), muis-macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en muis sRANKL kan leiden tot differentiatie van osteoclasten 3,16,17. Hier, de protocollen meerkernige osteoclast-achtige cellen uit muizen beenmerg en uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in vitro 18 genereren beschreven. Het celgebaseerde proeven vereist een volwassen terminaal gedifferentieerd en volledig functionele osteoclasten bepalen worden ook kort beschreven. Deze in vitro technieken aanvulling op de roman in vivo benadering en samen dienen als powerful onderzoeksinstrumenten om de differentiatie van osteoclasten en activering te bestuderen. Met deze systemen kunnen wetenschappers osteoclasten in vivo en in vitro genereren en bepalen de prikkels en signalen nodig zijn voor de proliferatie en activering en test de effectiviteit van farmacologische en biologische remmers.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for mice</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&nbsp;</td><td>R&amp;D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&nbsp;</td><td>immunodiagnostic systems</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gene transfer techniek en in vitro cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiatie en activering van osteoclasten spelen een sleutelrol in de ontwikkeling van musculoskeletale ziekten, aangezien deze cellen voornamelijk betrokken zijn bij botresorptie. Osteoclasten kunnen in vitro worden gegenereerd uit monocyt/macrofaag-precursorcellen in aanwezigheid van bepaalde cytokinen, die overleven en differentiatie bevorderen. Hier worden zowel in vivo als in vitro technieken gedemonstreerd, die wetenschappers in staat stellen om verschillende cytokine-bijdragen aan osteoclast-differentiatie, signalering en activering te bestuderen. Het minicircle DNA-leveringsgenoverdrachtssysteem biedt een alternatieve methode om een osteoporose-gerelateerd model te vestigen, wat bijzonder nuttig is om de werkzaamheid van verschillende farmacologische remmers in vivo te bestuderen. Evenzo, in vitro kweekprotocollen voor het produceren van osteoclasten uit humane precursorcellen in aanwezigheid van specifieke cytokinen stellen wetenschappers in staat om osteoclastogenese in menselijke cellen te bestuderen voor translationele toepassingen. Gecombineerd hebben deze technieken het potentieel om de ontwikkeling van geneesmiddelen voor op osteoclasten gerichte therapieën te versnellen, wat miljoenen osteoporose- en artritispatiënten wereldwijd ten goede kan komen.

Hier wordt een nieuwe genoverdracht techniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweek protocollen voor differentiëren voorlopercellen in osteoclasten in vitro als methode om de effecten van cytokines op osteoclastogenese studie beschreven. In figuur 1 zijn de representatieve resultaten van succesvolle genoverdracht van GFP en muis sRANKL MC bij muizen weergegeven. In figuur 2 zijn de representatieve beelden van muizen beenmerg of humane PBMC celdifferen...

De differentiatie van precursorcellen in osteoclasten wordt gereguleerd door cytokinen en groeifactoren. Hier worden een nieuwe genoverdrachtstechniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweekprotocollen voor het differentiëren van precursorcellen in osteoclasten in vitro beschreven als een methode om de effecten van cytokinen op osteoclastogenese te bestuderen.

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Het algemene doel is om een nieuwe genoverdrachtstechniek te rapporteren voor de differentiatie van osteoclasten in vivo. We beschrijven ook celkweekprotocollen voor het differentiëren van beenmergmacrofagen van muizen en humane PBMC's tot osteoclasten. Deze video is opgedeeld in drie delen.Eén, hydrodynamische levering van rank lichen mini cirkel, DNA, twee in vitro osteoclastgeneratie uit muis, beenmergmacrofagen, en drie in vitro osteoclastgeneratie uit humane PBMC's. Deel een, hydrodynamische levering van rank lichen mini cirkel, DNA. De volgende animatie toont een korte overzicht van hydrodynamische levering via injectie in de staartader van de muis.Plaats de muis eerst gedurende 10 minuten onder een warmte kaart voorafgaand aan de injectie. Dit verwijdt de bloedvaten en maakt de zijaderen zichtbaarder. Lokaliseer vervolgens de injectieplaats en voer de injectie uit, zorg ervoor dat de injectie binnen vijf tot zeven seconden voltooid is.Het volgende gedeelte van deze video zal een gedetailleerdere beschrijving geven van de procedures die betrokken zijn bij de hydrodynamische levering via de staartader van de muis. Verzamel de materialen voor een injectie. Warm de muis 10 minuten voorafgaand aan de injectie op in een kooi.Houd de muis zorgvuldig in de gaten om uitdroging en onderkoeling te voorkomen. Het opwarmen van de muis verwijdt de bloedvaten en maakt de zijaderen zichtbaarder. Zodra de aderen zichtbaar zijn, verplaats de muis naar een begrenzer en plaats een plunjer om de beweging van de muis te beperken.Desinfecteer de injectieplaats met een alcoholdoek. Gebruik een 27 tot 30 gauge naald voor de staartinjectie van de muis met verdund rank ligand of GFP mini cirkel in voorverwarmde ringer oplossing. Houd de staart stevig vast met één hand en steek de naald in de staarader.Oefen druk uit op de spuit en voltooi de injectie binnen vijf tot zeven seconden. Verwijder daarna de naald uit de staarader en oefen druk uit met de wattenbol op de injectieplaats om eventueel bloeden te stoppen. Verhoogde ademhalingssnelheid door verdund bloed dient waargenomen te worden en succesvolle injecties.Houd de muis 15 tot 30 minuten in de gaten, verplaats vervolgens terug naar de kooi. Zodra de muis een normale ademhalingssnelheid heeft, maakt hydrodynamische genoverdracht gebruik van hydrodynamische druk die wordt gegenereerd door een snelle injectie van een groot volume vloeistof in een bloedvat om de fysieke barrières van het endotheelcelmembraan te overwinnen die DNA verhindert om binnen te dringen in parenchymcellen. Parenchymcellen worden getransfecteerd omdat de nabijheid van het capillaire endotheel een onmiddellijke toegang tot DNA mogelijk maakt.Zodra de endotheelbarrière is verbroken. Deel twee, in vitro osteoclastgeneratie uit beenmergmacrofagen van muizen, de eerste stap is het opofferen van de muis en het isoleren van de tibia en femur botten. Spoel het beenmerg uit met een spuit geladen met PBS, tel vervolgens de cellen en zet ze kortstondig neer.Na het euthanaseren van de donormuis en het verwijderen van de femur en tibia botten, wordt het beenmerg in een 50 milliliter buis gespoeld. Gebruik een ene milliliter spuit met een 25 gauge naald geladen met PBS mix en plaats vervolgens de beenmerg suspensie in een nieuwe 50 milliliter buis door het door een nylon celzeef te laten lopen. Nadat de beenmerg suspensie door een nylon celzeef is gelopen, centrifugeer de cellen en suspendeer opnieuw in osteoclast kweekmedium, bereid een 96 welplaat voor met vijf millimeter dentine stukken.Op dezelfde manier kunt u een 96 welplaat bereiden met vijf millimeter glazen deksels. Let op de plaats van het dentine stuk aan de linkerkant en het glazen deksel aan de rechterkant met behulp van een hemo, cytometer of geautomatiseerde celteller tel de cellen en zet vervolgens 300.000 cellen op glazen deksels of dentine stukken geplaatst in de 96 welplaat en incubeer in een incubator van 37 graden Celsius. Verwijder alle media met alle niet-aangehechte cellen en voeg nieuw media toe ook klasse medium aangevuld met MCSF gedurende 48 uur.Na 48 uur verwijdert u al het media en voegt u osteoclast media toe met muis MCSF en muis rank lain om osteoclastogenese te starten, verwijder en vul het media om de drie dagen aan zoals vereist. Volwassen osteoklasse gedefinieerd door de vorming van multinucleaire trap positieve cellen. F actine formatie en resorptie op dentine deel drie.In vitro ook klassegeneratie uit humane PBMC's. Voeg 10 milliliters voorverwarmde histo pack toe aan een 50 milliliter buis am de leukocyte filter verkregen van een bloedbank, spoel met PBS in een 50 milliliter buis. Plaats vervolgens het bloed heel langzaam over de histo pack oplossing, zorg ervoor dat het bloed niet vermengt met de histo pack oplossing.Let op hoe het bloed wordt geplaatst bovenop de histo pack oplossing centrifugeer monsters bij 2.250 RPM gedurende 20 minuten bij 18 graden Celsius. Let op de Buffy coat laag in het midden van de drie lagen. Na centrifugatie, isoleer de witte buffy coat laag die de witte bloedcellen bevat en breng over naar een nieuwe 50 milliliter buis.Na de voltooiing van de stap, verdun de cellen met PBS en centrifugeer opnieuw bij 1800 RPM gedurende vijf minuten om de cellen te verzamelen. Na centrifugatie, verwijder de supernaat. Suspendeer de cellen opnieuw in osteoclast kweekmedium en schud de cellen en het medium samen.Tel cellen met hemo, cytometer of celteller. Bereid een 96 welplaat voor met dentine stukken of glazen deksels zoals eerder gedemonstreerd in deze video. Zet vervolgens 1 miljoen cellen per put op glazen deksels of dentine stukken 24 uur na het zetten. Voeg humane MCSF toe aan het kweekmedium.Ververs het kweekmedium, vul de cellen aan met humane MCSF om de twee tot drie dagen zoals vereist. Ga vervolgens verder met de differentiatiestap door humane rank ligand toe te voegen, aangevuld met humane MCSF en osteoclast media om osteoclastogenese te starten, volwassen osteoclast gedefinieerd door de vorming van multinucleaire trap positieve cellen, F actine ring formatie en resorptie op dentine resultaten. Hier beschrijven we ons in vivo osteoclastogenese muismodel met behulp van hydrodynamische lever

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een longitudinaal onderzoek van botverlies in het dijbeen en de tibiae van volwassen muizen werd uitgevoerd na een dwarslaesie met behulp van sequentiële lage dosis X-ray scans. Tibia botverlies werd ontdekt gedurende de studie, terwijl het botverlies in het dijbeen werd pas ontdekt 40 dagen na letsel.

Longitudinale Evaluatie van de muis Hind Limb botverlies na ruggenmergletsel met behulp van nieuwe, In vivo Methodologie

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Modellen van bot metastase

Kwantitatieve meting van botvoorlopercellen functie de genezing van breuken vereist hoge resolutie seriële imaging technologie. Hier zijn protocollen voorzien met intravitale microscopie en osteo-lijn volgen sequentieel beeld en kwantificeren van de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam / voorlopercellen in het proces van het herstellen botbreuken.

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Gecombineerde optische en μCT beeldvorming in een muismodel van orthopedische implantaten infectie, gebruik van een bioluminescent gemanipuleerde stam van Staphylococcus aureus, die het vermogen om de dynamiek van de bacteriële infectie, evenals de overeenkomstige ontstekingsreactie en anatomische veranderingen in de noninvasively longitudinaal bewaken bone.

Gecombineerd<em&gt; In vivo</em&gt; Optisch en μCT Imaging aan Infectie, Ontsteking, en Bone Anatomie Monitor in een orthopedisch implantaat Infectie in Muizen

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

We beschrijven een in vivo protocol om dorsiflexie van de voet te meten na stimulatie van de peroneale zenuw en contractie van het anterieure crurale compartiment van de achterpoot van de rat. Dergelijke metingen zijn een onmisbaar translationeel hulpmiddel voor het evalueren van skeletspierpathologie en weefselengineeringbenaderingen voor spierreparatie en -regeneratie.

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Kleine laboratoriumvissen zijn populaire modellen geworden voor botonderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke botaandoeningen en voor het screenen van botmodulerende geneesmiddelen. In dit rapport beschrijven we een protocol om het effect van alendronaat op botcellen bij medaka-larven met osteoporose-laesies te beoordelen.

Drug Treatment en<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van Osteoblast osteoclasten Interacties in een Medaka Fish Osteoporosis Model

Het doel van dit protocol is het genereren van een naakte rat Vertebrale compressie osteoporose bedrijfsgerelateerde fractuur model dat kan worden beoordeeld op overlangs in vivo met behulp van een semiautomated microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse.

Semiautomated longitudinale Microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van een naakt-Rat Vertebrale fractuur osteoporose-gerelateerde Model

Het voorgestelde protocol behelst een globale aanpak om botvorming in het kader van botregeneratie te beoordelen met behulp van multimodale analyses. Het heeft tot doel kwalitatieve en kwantitatieve informatie te verstrekken over de vorming van nieuw bot, waardoor de nauwkeurigheid en validiteit van basis- en preklinisch onderzoek wordt verbeterd.

Uitgebreide karakterisering van weefselmineralisatie in een ex vivo model

Het beenmergletselmodel bij muizen is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van postnatale osteogenese door middel van intramembraneuze ossificatie. Dit vereenvoudigde chirurgische protocol beschrijft de beenmergablatieprocedure voor stroomafwaartse beoordeling van nieuwe botvorming en cellulaire reacties na verwonding.

Verbeterde methodologie voor het bestuderen van postnatale osteogenese via intramembraneuze ossificatie in een beenmergletselmodel bij muizen

Hier presenteren we een gentherapiebenadering die ABE-gecoate chitosan rechtstreeks in het beenmerg toedient door middel van intraossale injectie.

Verbeterde genafgifte en -expressie met behulp van intraossale injectie van chitosan-nanodeeltjes ingekapselde adeninebase-editorplasmiden

Leer een nieuwe gentransfertechniek voor osteoclastdifferentiatie in vivo en in vitro met muizen en humane cellen. Deze methode onderzoekt cytokine-effecten op botbiologie.

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen (Video) | JoVE Journal

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Meer video's verkennen