Name: Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Leer een ex vivo orgaan-cultuursysteem voor live-imaging van ontwikkelende villi in de foetale muisdarm. Deze methode maakt driedimensionale visualisatie van signaalwegmodulatie en darmontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken ons bij Dr. Deborah L. Gumucio voor haar advies en voor haar onschatbare steun bij het definiëren van de kweek- en beeldvormingsmethoden. We danken ook Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dr. Charlotte Mistretta en Dr. Ann Grosse voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van het gehele darmorgaankweeksysteem. Nuttige discussies over beeldvorming gaven uitstekende adviezen van Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski en Sasha Meshinchi. Alle beeldvorming werd uitgevoerd in het Microscopie en Beeldanalyse Laboratorium aan de Universiteit van Michigan. Financieringsondersteuning werd verstrekt door NIH R01 DK065850.

OPMERKING: Alle muizen werden humaan behandeld met behulp van protocollen door de Universiteit van Michigan Medical School Unit voor Proefdierkunde Geneeskunde goedgekeurd en volgens de richtlijnen van de Universitaire Commissie voor gebruik en verzorging van dieren. 1 Hele orgelcultuur System <ol><li> Voorbereiding van de media en de cultuur platen <ol><li> In een weefselkweek kap, verwijder 5 ml BGJb media uit het flesje, en voeg 5 ml van de Pen / Strep. Bereid een werkvoorraad van media in een 50 ml conische buis, door toevoeging van 1 ml van 5 mg / ml ascorbinezuur aan 49 ml van BGJb medium (met Pen / Strep). </li><li> Bereid een 6 putjes plaat door toevoeging van 1 ml onder elk van de transwells. OPMERKING: Als alle 6 transwells niet worden gebruikt, verplaatsen extra transwells in een verse steriele 6 wells plaat voor later gebruik. Voeg 3 ml werken BGJb medium aan elk van de drie 10 cm steriele petrischalen. </li></ol></li><li> Voorbereiding voor dissectie <ol><li> Soak ontleden gereedschappen in 70% Ethanol en zorg ervoor dat het gereedschap schoon te houden tijdens het werken. </li><li> Het opzetten van de dissectie met een grote ijsemmer en plaats de 6 en cultuur plaat en 10 cm petrischaaltjes met BGJb media op ijs. Werken op ijs zo veel mogelijk terwijl het ontleden en het voorbereiden van de darmen voor cultuur. </li><li> Verdoven volwassen vrouwelijke muizen in een kamer met isofluorane (100 ul) vóór euthanization door cervicale dislocatie voor het oogsten van foetale darmen. </li><li> Na het oogsten van de foetussen van hun moeder, het podium elke foetus zorgvuldig volgens de Theiler enscenering grafiek 13. Niet afhankelijk dagen na coïtus aan de leeftijd van elke foetus als variaties tot 24 uur in ontwikkelingsstadium routinematig waargenomen binnen een nest bepalen. </li></ol></li><li> Dissectie van foetale darmen <ol><li> Euthanaseren foetussen door onthoofding voorafgaand aan het verwijderen van de ingewanden. </li><li> Ontleden elke darm in 1x Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en dan place deze in een 10 cm petrischaal met werkende BGJb media. </li><li> Verwijder de milt van de maag en de pancreas van de maag en duodenum bovenste voorzichtig. </li><li> Voorzichtig scheiden omentum zorg het omentum verbonden zoveel mogelijk scheiden verbindingen alleen voldoende ruimte te houden de darm wordt rechtgetrokken. OPMERKING: Voor darmen ouder dan E14.5 of degenen die langer dan 24 uur gekweekt, voorzichtig scheiden de darm in 3 gelijke stukken om voor luminale inhoud te stromen door de darm en worden verbannen uit de afgesneden einden. Voor kweken begonnen vóór E13.5, wachten tot na 24 uur kweken voor het scheiden van de 3 segmenten van de darm om de serosa om goed te groeien over de lengte van de darm. </li><li> Gebruik een mond pipet om de intestinale stukken over te dragen op de transwells van de cultuur plaat (1.1.2). </li><li> Voorzichtig te herpositioneren de darmen als nodig, zodat ze dwars door de transwell. OPMERKING: Zodra de darmen begint te volgen luminale inhoud door de buis, zal knikken in de darm een ​​backup en darmbeschadiging veroorzaken. </li></ol></li><li> Cultuur en behandeling <ol><li> Verwijder het papier van onder de transwell, voeg 700 ul van de behandeling de media (het werken met media toegevoegd recombinante eiwitten of farmacologische remmers) onder de transwell. </li><li> Voeg 300 ul van behandelingsmedia druppelsgewijze bovenop de ingewanden en laat het inwerken door de transwell. Herpositioneren van de darmen als dat nodig is. </li><li> Wijzig behandelingsmedia ten minste eenmaal per dag of vaker, afhankelijk van de halfwaardetijd van de behandeling reagens. </li></ol></li><li> Bereiding van eiwit geweekt agarose parels voor een gelokaliseerde bron behandeling reagens <ol><li> Resuspendeer de agarose parels in de opslagcontainer en breng 100 ui agarose korrels in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Vul het resterende volume van de buis met steriele 1x Phosphate-gebufferde zoutoplossing (PBS) en meng de parels te wassen. Plaats de microcentrifugebuis in een rek voor een paar minuten totdat de kralen naar de bodem en pipet uit de PBS van de bovenkant van de bolletjes. Vul de microfugebuis met steriele 1x PBS en tweemaal meer herhaal het wasproces. </li><li> Bereid het eiwit van belang op twee maal de gewenste concentratie voor behandeling. </li><li> Meng 5 ul van gewassen agarosebolletjes met 5 pi van de 2x eiwit voorraad en schud er voorzichtig de kralen in het eiwit. Plaats de buis op ijs gedurende 1 uur, voorzichtig te mengen om de 10-15 minuten. </li><li> Spoel de kralen kort in steriele 1x PBS voor het plaatsen van de kralen op de darmen. </li></ol></li><li> Plaatsing van agarosekorrels <ol><li> Plaats voorzichtig het agarose korrels bovenop de darmen met een mond pipet met getrokken capillaire naalden. Plaats de kralen met uiterste voorzichtigheid als ruwe behandeling de darm beschadigen en voorkomen villus ontwikkeling in het gewonde gebied. </li><li> Plaats tweemaal zoveel kralen als nodig zijn voor analyse omdat de darmen peristaltische bewegingen en ongeveer de helft van de korrels geplaatst zal rollen van de darmen via kweken tijd ondergaan. </li></ol></li><li> Fixatie van gekweekte darm <ol><li> Verwijder voorzichtig de behandeling media van onder de transwell en laat de darmen aan de lucht drogen voor 3 minuten. </li><li> Voeg 1 ml fixeermiddel volgens de transwell gedurende 2 min, dek de bovenkant van de darm met 2 ml fixeermiddel voor de rest van de fixatie tijd. Bevestig met 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C of gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol> 2 Beeldvorming van Vaste Darmen <ol><li> Wholemount beeldvorming <ol><li> Leg de hele darmen (met endogene fluorescentie) op een dia met 100 ul van 1x DPBS. Gebruik een tang om voorzichtig te regelen de darmen. </li><li> Gebruik een lab weefsel om de DPBS voorzichtig verwijderd en direct daarna 100 pi 70% glycerol toevoegen weefsel mo makenre transparante en verhoging van de diepte die van beeldvorming. Opmerking: Als verdere penetratie van de darm gewenst, in plaats van montage van de darm in 70% glycerol, genieten de darm in een paar druppels Focus Heldere oplossing gedurende 10-30 minuten. Pipet uit de Focus Heldere oplossing en monteer de darm met Mount Clear. </li><li> Dompel elk van de vier hoeken van een dekglaasje in boetseerklei en ophalen van een kleine hoeveelheid klei als afstandhouders tussen de glijbaan en dekglaasje het dekglaasje te houden van afvlakking van de darm. </li><li> Dicht de dekglaasje op de glijbaan met gesmolten valap aangebracht met een wattenstaafje. </li><li> Afbeelding van de darmen aan beide een rechtopstaande of omgekeerde confocale microscoop. Verwijzen we naar de bespreking voor verdere details. </li></ol></li><li> Vibratome snijden van vaste darmen (voor dwarsdoorsnede van intestinale structuren) <ol><li> Insluiten darmen in 7% agarose in kleine plastic mallen (10 x 10 x 15 mm) en laat de agarose blokkenafkoelen en stollen. </li><li> Verwijder agarose blokken van de plastic mallen en lijm agarose blokken aan de vibratome collectie podium met secondenlijm. </li><li> Vul de collectie podium met ijskoud 1x DPBS. </li><li> Snijd secties met een dikte van 100-150 um. Voor dikkere secties gebruiken clearing-oplossingen (in paragraaf 2.1.2 beschreven) om dieper in de doorsnede te visualiseren. </li><li> Giet vibratoomcoupes van de gegevensverzameling verschillende in een putje van een 6-well plaat voor opslag bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Immunofluorescentie kleuring van vaste, vibratome coupes weefsels <ol><li> Plaats 5-12 vibratoomcoupes per well in een 24-wells plaat met 1x DPBS. </li><li> Verwijder 1x DPBS en voeg 500 ul permeabilisatie oplossing per well. Schud de monsters gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na permeabilisatie, was de monsters 3 keer met 1x PBS. </li><li> Blokkeer de monsters gedurende ten minste 30 minuten in 500 pl Blocking Solution. </li><li> Na blokkering exchange de blockingbuffer 500 ui primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing en houdt de monsters bij 4 ° CO / N. OPMERKING: De primaire antilichaam verdunningen die goed werken voor bevroren en paraffine secties algemeen goed werken vibratoomcoupes echter ook antilichamen die nucleaire antigen retrieval algemeen niet goed met dit protocol (bijvoorbeeld BrdU). </li><li> De volgende dag was de monsters 3 keer gedurende 15 minuten telkens met blokkeeroplossing. </li><li> Na wassen brengt 500 ui van het secundaire antilichaam verdund in blokkerende oplossing. Wikkel de 24-well plaat in aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming tegen licht en rock de monsters gedurende 45 minuten tot 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was de monsters 3 keer met 1x PBS gedurende 15 minuten elk en monteer de vibratoomcoupes op dia&#39;s, zoals beschreven in paragraaf 2.4. </li></ol></li><li> Montage vibratoomcoupes <ol><li> Bereid je dia&#39;s voor vibratome montage door het snijden van dunne plakjes van de dubbele-stick tape en door ze langs de lange zijden van de schuiven. </li><li> Plaats voorzichtig 5-10 vibratoomcoupes tussen de dubbele plakband op de dia&#39;s in een daling van 100 ul 1x PBS. </li><li> Vouw alle secties en spreid ze uit in een enkele laag over de glijbaan. </li><li> Verwijder overtollig agarose of ongelijke bits die zou voorkomen dat een dekglaasje van het zitten plat. </li><li> Zorgvuldig gebruik van een lab weefsel om te genieten van meer dan 1x PBS uit de hele vibratoomcoupes. </li><li> Voeg een druppel waterig fixeermiddel bovenop de vibratoomcoupes en dekglaasje. </li><li> Dicht de dekglaasjes op de dia&#39;s met gesmolten valap aangebracht met een wattenstaafje. </li><li> Afbeelding de vibratoomcoupes aan beide een rechtopstaande of omgekeerde confocale microscoop. Verwijzen wij u naar de discussie voor meer informatie over de selectie van een imaging systeem. </li></ol></li></ol> 3 Live-Imaging van Whole Darmen Darmen geoogst uit fetuses na E12.5, met de aangesloten omentum intact gelaten, met succes te ontwikkelen villi in de cultuur met behulp van het bovenstaande systeem. Daarom is deze ex vivo systeem maakt het vangen van levende z-gedeelte afbeeldingen van de ontwikkeling darmen die kan worden gereconstrueerd voor een driedimensionaal aanzicht morfogenese tijd. <ol><li> Het opzetten van live-imaging <ol><li> Gebruik secondenlijm aan een individu polycarbonaat membraan houden aan een fijne gaas. Dit verschaft een drager scaffold de darm op zijn plaats onder het dompelen lens van de rechtopstaande confocale microscoop. Verwijzen wij u naar de discussie sectie voor meer informatie over de selectie van de live imaging microscopen. </li><li> Plaats het gaas in het midden putje van een kweekplaat. </li><li> Plaats de ontleed darm op het polycarbonaat membraan en voeg een druppel secondenlijm aan beide uiteinden. Gebruik net genoeg lijm om de darm aan te brengen, maar niet vacht! </li><li> Voeg voedingsbodems vrije fenol rood onder het polycarbonaatmembraan in het midden putje van de kweekplaat. </li><li> Water Aan de buitenrand van de kweekplaat aan vochtigheid te verschaffen. </li><li> Aangezien de foetale darm ondergaat peristaltische-als golven krimp in kweek, voeg 100 ul van een 1: 5 oplossing van xylazine in 1 x PBS tot 3 ml medium om beweging van de darm tijdens beeldvorming controleren. Deze dosering zal darmbewegingen voor ongeveer 8-10 uur onder controle, zonder afbreuk te villus ontwikkeling. </li><li> Voor een transversale uitzicht van de darm, Sluit de live darmen in een 3-4% agarose-oplossing en snijd dikke secties (150-500 micrometer) op een vibratome. Pas de stijfheid van de agarose met de stijfheid van de darm wordt gesneden en empirisch bepaald het ontwikkelingsstadium. Algemeen een 3% agarose oplossing werkt goed voor darmen jonger dan E14.5 en een 4% oplossing werkt goed voor darmen E15-E16. </li><li> Lijm de vibratoomcoupes een polycarbonaat membraan aangebracht op een mesh scherm (zoals in paragraaf 3.1.1) encultuur zoals beschreven in paragraaf 3.1.2-3.1.6. </li><li> Het gedrag van de live-beeldvorming met behulp van een twee-foton confocale fluorescentiemicroscoop (excitatie laser tussen 690-1,040 nm) op een rechtopstaande stand met een instelbare tafel. </li><li> Twee-foton laser afgesteld om 900 nm diepe penetratie met de beste resolutie voor GFP signalen geeft. Het vermindert schade aan weefsel tijdens beeldvorming. Bovendien houdt de kracht van de laser om een ​​minimale emissie vermindert weefselschade. Meestal om een ​​goede excitatie van GFP te verkrijgen, gebruiken 12% vermogen op de twee-foton laser. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Grosse, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+fetal+intestinal+epithelium%3A+implications+for+intestinal+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis.</a> Development. 138, 4423-4432 (2011).</li>
<li>Walton, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+mesenchymal+clusters+direct+patterning+and+emergence+of+intestinal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).</li>
<li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+endoderm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Vertebrate endoderm development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).</li>
<li>Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vascular+networks+during+the+morphogenesis+of+intestinal+villi+in+the+fetal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Kaibogaku+zasshi+Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse.</a> Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).</li>
<li>Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+fetal+rat+duodenal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of fetal rat duodenal villi.</a> Am J Anat. 146, 73-92 (1976).</li>
<li>Burns, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+fibroblast+growth+factor+10+or+fibroblast+growth+factor+receptor+2-IIIb+signaling+for+cecal+development+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse.</a> Dev Biol. 265, 61-74 (2004).</li>
<li>Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Nkx2-3+homeodomain+gene+is+expressed+in+gut+mesenchyme+during+pre-+and+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development.</a> Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).</li>
<li>Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+homeobox+transcription+factor+Nkx2-3+in+mice+results+in+postnatal+lethality+and+abnormal+development+of+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine.</a> Development. 126, 2215-2225 (1999).</li>
<li>Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesenchymal+winged+helix+transcription+factor+Fkh6+is+required+for+the+control+of+gastrointestinal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation.</a> Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).</li>
<li>Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxF1+and+FoxL1+link+hedgehog+signaling+and+the+control+of+epithelial+proliferation+in+the+developing+stomach+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine.</a> J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).</li>
<li>Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+gastrointestinal+development+in+PDGF-A+and+PDGFR-%28alpha%29+deficient+mice+implicates+a+novel+mesenchymal+structure+with+putative+instructive+properties+in+villus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis.</a> Development. 127, 3457-3466 (2000).</li>
<li>Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+controls+mesenchymal+growth+in+the+developing+mammalian+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract.</a> Development. 137, 1721-1729 (2010).</li>
<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+house+mouse.+Development+and+normal+stages+from+fertilization+to+4+weeks+of+age%22">The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age</a>. , 2, Springer-Verlag. (1989).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Fu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtome-free+3-dimensional+confocal+imaging+method+for+visualization+of+mouse+intestine+with+subcellular-level+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution.</a> Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangensconflicten te melden.

Het dynamische karakter en complexe weefsel interacties van de ontwikkelende darm vereist 3D-visualisatie van een volledige waardering van deze morfogenetische gebeurtenissen hebben. Met evoluerende imaging technologie, de mogelijkheid om villus morfogenese in detail is het ontwikkelen / verbeteren en daarmee is het begrip van de ruimtelijke communicatie en interactie tijdens de organogenese sterk verbeterd onderzoeken. Alternatieve methoden voor het kweken gehele darmen zijn ook getest, maa...

Elke darmvilluus bestaat uit twee hoofdweefselcompartimenten: een epitheellaag en een mesenchymaal kern. De dunne darm van de muis wordt gevormd op embryonale dag 10 wanneer een laag endoderm zich sluit en verzegelt om een buis van epitheel te vormen die wordt omgeven door mesenchymale cellen3. Deze platte buis van epitheel ondergaat een snelle proliferatie, groeit zowel in lengte als omtrek en ondergaat dramatische herschikkingen met dynamische veranderingen in celvorm1. Tegelijkertijd ondergaat het omringende mesenchym ook veel ontwikkelingsprocessen, waaronder de vorming van het vasculaire plexus, differentiatie van gladde spieren en werving van enterische neuronen4. In de proximale dunne darm op embryonale dag 14,5 beginnen condensaties (clusters) van Hedgehog- en PDGF-responsieve cellen zich te vormen naast het epitheel2,5. De vorming van mesenchymale clusters blijft zich verspreiden over de lengte van de darm, zodat ze de hele dunne darm bedekken tegen embryonale dag 16,52. Terwijl mesenchymale clusters zich vormen, trekken de epitheelcellen die het dichtst bij de clusters staan zich terug uit de celcyclus, terwijl de andere epitheelcellen blijven prolifereren. Die cellen direct boven de mesenchymale cluster die zich terug hebben getrokken uit de celcyclus beginnen van vorm te veranderen terwijl de opkomende villuus zich omhoog buigt in het lumen. Verdere groei van de villuus wordt gedeeltelijk aangedreven door de aanhoudende proliferatie van het epitheel tussen de opkomende villi. De mesenchymale clusters blijven stevig gehecht aan het epitheel van de groeiende villuus en blijven een verscheidenheid aan signaalmoleculen tot expressie brengen. De golf van villuusontwikkeling verspreidt zich langs de lengte van de dunne darm na de vorming van mesenchymale clusters. Terwijl de darm blijft groeien en het intervilluusgebied zich uitstrekt tussen opkomende villi, vormen nieuwe mesenchymale clusters zich naast het intervilluusepitheel en er volgen verdere rondes van villuusontwikkeling en groei6.
Gesynchroniseerde ontwikkeling van het epitheel en mesenchym is essentieel voor de morfogenese van de villi. Signaalmoleculen worden uitgescheiden van de ene laag naar de andere, waar receptoren het signaalbericht ontvangen en doorsturen om de ontwikkeling tussen het epitheel en mesenchym te coördineren. Mesenchymale clusters fungeren als signaalcentra en tot expressie brengen een verscheidenheid aan ontwikkelingsmorfologen7-10. Verstoring van clustervorming of patroonresulteert in verlies van villuusontwikkeling en patroon. Remming van PDGF-signalering resulteert in minder clusters en minder villi en die villi die zich wel vormen, zijn misvormd na de abnormale clusters11. Verlies van Hedgehog-signalering resulteert in volledig verlies van clustervorming en falen van villuusontwikkeling2,12. Samen tonen deze gegevens aan dat clusters de ontwikkeling van het villuusepitheel coördineren met zijn mesenchymale kern.
Met behulp van dit gehele orgaancultuursysteem zijn we in staat om de signalering te veranderen die betrokken is bij epitheliale-mesenchymale clustercommunicatie om de rol van die signalen in villuusmorfogenese te bepalen. Twee-foton confocale optische secties en reconstructie bieden de mogelijkheid om clustervorming en villuusontwikkeling in drie dimensies te visualiseren en de ruimtelijke relaties tussen de mesenchymale clusters en hun overliggende epitheel beter te begrijpen. Door het cultuursysteem uit te breiden naar vier dimensies, kunnen we z-stacks van zich ontwikkelende clusters en villi over tijd vastleggen en deze interacties observeren. Uiteindelijk zal het vermogen om de villuusontwikkeling op deze manier te volgen en veranderingen waar te nemen die optreden met gewijzigde signalering, de begrip van epitheliale mesenchymale interacties in villuusmorfogenese revolutioneren.

<table><tbody><tr><td>Fine dissecting forceps&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>&nbsp;11254-20</td><td>2 paar</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x steriele Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 wells platen</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 wells platen</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm petrischalen</td><td>Falcon</td><td>&nbsp;451007</td><td></td></tr><tr><td>Transwell platen, 24 mm inzetstukken, 8,0 mm polycarbonaatmembranen</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>6 inzetstukken per plaat</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000U/ml Penicillin; 10.000 mg/ml Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp;15140</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A0278</td><td>maak 5 mg/ml stock, filter, verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Mondpijp (Drummond 1-15 inch aspiratorbuisassemblage)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp;21-180-10</td><td>verwijder de aspiratorassemblage en vervang deze door een 1.000 &micro;l pipettip die fungeert als adapter om een 6 inch glazen Pasteur pipet aan te sluiten.</td></tr><tr><td>6 inch glazen pasteur pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaire buizen</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>trek naar naalden</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td>gemaakt in 1 x PBS, pH tot 7,3</td></tr><tr><td>Kweekplaten</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Fijnmazige roestvrijstalen zeef</td><td>koop bij hardwarewinkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaatmembranen</td><td>Thomas scientific&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternatief, knip Corning Costar 3428 membranen van transwell-ondersteuningen</td></tr><tr><td>Onmiddellijke lijm</td><td>koop bij hardwarewinkel</td><td>gel-gebaseerd bij voorkeur</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm platen</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>7% agarose</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;A9414</td><td>bereid w/v in 1x DPBS, verwarmen om op te lossen in een waterbad</td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fenolroodles media (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>basale membraanmatrix, groeifactor gereduceerd, fenolrood-vrij</td></tr><tr><td>3-4% agarose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414</td><td>bereid w/v in 1x DPBS, verwarmen om op te lossen in een waterbad</td></tr><tr><td>Beeldvorming van gefixeerde darmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam van Materiaal/Uitrusting</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>vaseline</td><td>koop bij apotheek</td><td></td><td>gebruikt om VALAP te maken: gelijke delen vaseline, lanoline, paraffine</td></tr><tr><td>lanoline</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L7387</td><td>gebruikt om VALAP te maken: gelijke delen vaseline, lanoline, paraffine</td></tr><tr><td>paraffine</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>gebruikt om VALAP te maken: gelijke delen vaseline, lanoline, paraffine</td></tr><tr><td>70% glycerol in 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear en Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp;F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Modelleerklei</td><td>koop bij kunstbenodigdhedenwinkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dubbelzijdig plakband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wattenstaafjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastische mallen, 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>Tissue Tek&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>schuifjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dekglasjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>labdoek</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>lintvrij delicaat taakdoekje</td></tr><tr><td>Theiler-stadiumkaart&nbsp;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Leica SP5X confocale microscoop&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Gebruikt voor het uitvoeren van de live beeldvorming&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMI 6000 stand&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Gebruikt voor het uitvoeren van de live beeldvorming&nbsp;</td></tr><tr><td>Waterige montage medium (Prolong Gold)</td><td>Molecular Probes&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Naam van Materiaal/Uitrusting</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>24 wells plaat</td><td>Costar</td><td>&nbsp;3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T-8787</td><td>gebruikt om Permeabilisatie-oplossing te maken: 0,5% Triton X-100 in 1 x PBS</td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td></td><td></td><td>gebruikt om Blocking Solution te maken: 4% Geitenserum, 0,1% Tween20 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

muis foetale hele darm cultuur system voor ex vivo manipulatie van signaalwegen en driedimensionale live-imaging van villus development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Meest morfogenetische processen in de foetale darm zijn afgeleid uit dunne lagen van gefixeerde weefsels, die snapshots van veranderingen tijdens ontwikkelingsstadia. Drie-dimensionale informatie van dunne seriële secties kunnen worden uitdaging te interpreteren omdat het moeilijk reconstrueren seriecoupes perfect en handhaven van de juiste oriëntatie van het weefsel via seriële secties. Recente bevindingen van Grosse et al. 2011 benadrukken het belang van driedimensionale informatie in het begrijpen van de morfogenese van het ontwikkelen van villi van de darm 1. Drie-dimensionale reconstructie van enkelvoudig gelabelde darmcellen aangetoond dat de meerderheid van de darmepitheelcellen contact zowel de apicale en basale oppervlakken. Bovendien driedimensionale reconstructie van het actine cytoskelet in het apicale oppervlak van het epitheel dat de darmlumen continu is en dat secundaire lumen zijn de invloed van sectioning. Deze twee punten, naast het aantonen van interkinetic nucleaire migratie in het darmepitheel, gedefinieerd ontwikkelingslanden darmepitheel als een pseudo-epitheel en niet gestratificeerd zoals eerder gedacht 1. De mogelijkheid om het epitheel driedimensionaal waarnemen was rudimentaire te demonstreren dit punt en het herdefiniëren van epitheliale morfogenese in de foetale darm. Met de ontwikkeling van multi-foton imaging technologie en driedimensionale reconstructie software, het vermogen om intact te visualiseren, ontwikkelende organen snel verbeteren. Twee-foton excitatie maakt minder schadelijk penetratie dieper in weefsels met een hoge resolutie. Twee-foton imaging en 3D reconstructie van het gehele foetale darmen in Walton et al., 2012 bijgedragen tot het patroon van villus uitgroei 2 definiëren. Hier beschrijven we een heel orgaan kweeksysteem dat ex vivo ontwikkeling van villi en uitbreidingen van dit kweeksysteem maakt omde darmen driedimensionaal afgebeeld tijdens hun ontwikkeling.

Cultuur van hele explantaten van foetale darm maakt de analyse van de locatie, de distributie en de duur van de signalerende moleculen die intestinale ontwikkeling coördineren, omdat dit systeem de manipulatie van de signalering met farmacologische reagentia of recombinante eiwitten. De transwell kweeksysteem (figuur 1A, gereproduceerd van Walton et al., 2012) 2 verschaft een lucht-vloeistof-grensvlak, waardoor het mogelijk geneesmiddel-eiwit of geweekte agarose korrels plaatsen op h...

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Het algemene doel van deze procedure is om ex vivo volledige organculturen van embryonale muizendarmen te kweken, waardoor de modulatie van cel-signaleringspaden mogelijk wordt. Dit wordt bereikt door eerst muizendarmen te oogsten van foetussen tussen embryonale dag 12.5 en 18.5. De tweede stap is om de darmen in een transwell-cultuur of een plaat voor live-imaging te plaatsen.Behandel vervolgens de darmen met medium dat is bereid met farmacologische inhibitoren van cel-signaleringspaden, of plaats met recombinante eiwitten gedrenkte hydrogels op de darmen om de cel-signalering te beïnvloeden. De laatste stap is het afbeelden van de gekweekte darmen, hetzij in dikke weefselcoupes of via hole mount.Uiteindelijk wordt confocale beeldvorming, gevolgd door driedimensionale reconstructie, gebruikt om te visualiseren hoe de modulatie van cel-signaleringsroutes de ontwikkeling van de weefsellagen tijdens de vorming van de villi heeft beïnvloed. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het embryonale weefsel zeer delicate is en grote zorgvuldigheid vereist tijdens de dissectie en hantering. Om de dissectie voor te bereiden, worden de dissectie-instrumenten geweekt i

mouse-fetal-whole-intestine-culture-system-for-ex-vivo-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een werkwijze voor isolatie, cultuur en manipulatie van muis embryonale pancreas. Dit is een...

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen. Deze primaire kweken intestinale maken het onderzoek signaalroutes onderliggende darm peptidesecretie behulp van een aantal technieken.

Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells

Dit protocol beschrijft hoe de overgang van de speen-naar-spening in vitro met behulp van de muis late foetale intestinale organoïden gecultiveerde voor 30 dagen.

Recapituleren van de overgang van de suckling-to-Spening in vitro met foetale intestinale Organoïden

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Leer een ex vivo orgaan-cultuursysteem voor live-imaging van ontwikkelende villi in de foetale muisdarm. Deze methode maakt driedimensionale visualisatie van signaalwegmodulatie en darmontwikkeling mogelijk.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development (Video) | JoVE Journal

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Meer video's verkennen