Multimodale optische microscopie methoden Reveal Poliep Tissue morfologie en structuur in het Caribisch gebied Reef Building Koralen

Het algemene doel van het volgende experiment is om koraalpoliepen van één tot twee millimeter dik in 3D te beeldhouwen om de fijne structuur en de koraalpigmenten en hun lokalisatie te begrijpen. Dit wordt bereikt door eerst het monster in was in te bedden, vervolgens het monster in secties van één micrometer te snijden met behulp van een microtoom. Vervolgens wordt een op maat ontworpen seriële blokface-techniek gebruikt om de koraalpoliepen te beeldhouwen en het 3D-beeld te reconstrueren.

Met behulp van meerdere 2D-beelden worden resultaten verkregen die de mogelijkheid van de techniek laten zien om fijne structurele details van het koraalweefsel op te lossen zonder de structurele integriteit ervan aan te tasten. Het demonstreren van de procedure. Vandaag zal Dr.Maunde Siva guru, een medewerker van mijn onderzoeksgroep, aanwezig zijn.

Om de voorverwarmde wassmelt voor te bereiden, smelt 3,6 gram steer in schilfers in een glazen beker op een hotplate. Voeg vervolgens 400 milligram Sudan Four toe om de achtergrondfluorescentie van de was te minimaliseren, meng goed en wacht tot een rode doorschijnende oplossing is verkregen.

Voeg vervolgens 81 gram paraffine toe en meng goed. Voeg vervolgens 15 gram witte korrelige VI-bar toe en smelt deze volledig in dezelfde beker. Eenmaal gesmolten, meng het opnieuw om een volledig gemengde wasoplossing te verkrijgen.

Voeg nu het mengsel toe aan een glazen fles en sluit deze losjes met een deksel. Plaats de glazen fles in een convectieoven van 60 graden Celsius om de ingrediënten in een vloeibare staat te houden en om alle infiltraties te laten plaatsvinden. Deze oplossing kan worden gemaakt tot 200 milliliter en worden verdeeld in twee flessen van 100 milliliter.

Een voor de infiltratie en een voor het definitieve inbedden Caribische rifbouw koraalmonsters werden verzameld van AU en gefixeerd in para formaldehyde in het veld. Om de koraalweefsels voor SBFI in te bedden, was eerst de koraalpoliepen die in het veld zijn verzameld en bewaar ze op vier graden Celsius in para formaldehyde. Was ze daarna in PB S3 keer gedurende vijf minuten elke keer wanneer ze klaar zijn om te worden afgebeeld.

Decalcificeer de poliepen in ex Cal twee oplossing gedurende 24 uur of totdat de poliepen volledig verstoken zijn van calciumcarbonaat. Incubeer verschillende gedecalcificeerde koraalpoliepen als een enkele blok in een 25, 50, 75 en 100% ethanol serie gevolgd door één x xyleen. Vervang voor 30 minuten elke sessie om de monsters te dehydrateren.

Plaats vervolgens de verwerkte poliepen in 100% xyleen. Vervang in een oven van 65 graden Celsius gedurende 30 minuten. Vervang vervolgens met een verse oplossing en incubeer gedurende nog eens 30 minuten.

Orienteer de poliepen met de toppen naar beneden en het oppervlak zo vlak mogelijk. Maak oplossingen van twee op één, één op één en één op twee. Xyleenvervanger en voorverwarmde wassmelt.

In 50 milliliter Falcon buizen incubeer de koraalpoliepen met deze drie toenemende concentraties voorverwarmde wassmelt, gevolgd door drie incubaties in 100% voorverwarmde wassmelt gedurende 30 minuten tot een uur per keer. Breng nu het monster over naar de inbedden was. Verwijder de inbedden was na 30 minuten, vervang vervolgens door verse inbedden was en zet de incubatie voor minimaal vier uur voort bij 65 graden Celsius.

Fotograaf daarna de blok. Dit is noodzakelijk omdat eenmaal ingebed in de was, de locatie van het monster onzichtbaar zal worden omdat de inbeddende rode was ondoorzichtig is. Plaats vervolgens kleine druppels was met een hoog smeltpunt rond de nieuwe voorverwarmde roestvrijstalen inbeddingsvorm en laat het afkoelen.

Pour een klein volume vers gesmolten en bedding was van de tweede aliquot en positioneer de koraalpoliep met de zijde naar beneden over het witte wasstip snel. Plaats vervolgens een plastic monsterhouder op de roestvrijstalen lade en giet meer inbedding was zodat de was tot aan het oppervlak van de plastic mal komt. Neem nu de volledige opstelling uit de oven van 65 graden Celsius en laat het afkoelen op een werkbank of een koele oppervlakte totdat de was volledig is uitgehard.

Plaats daarna de uitgedroogde blok in een koelkast op vier graden Celsius, beschermd tegen licht voor langdurige opslag om de blok te snijden. Trim het eerst en snijd secties van één micrometer. Gebruik een microtoom om het beeld van het gladde blokoppervlak vast te leggen, dat het monster bevat.

Elke keer. Wanneer een sectie wordt verwijderd, verschijnt het monster wanneer de witte was begint te verdwijnen. Leg vervolgens de beelden vast met een monochrome camera met behulp van een fitzy fluorescerende filter om de autofluorescentie van de chromatoforen of het koraalpoliepbeeld op te vangen, drie tot vier gedecalcificeerde kernen van elk monster.

Om tweefotonfluorescentiebeeldvorming uit te voeren, plaats de gewassen koraalpoliepkernen in 4% para formaldehyde op de kop in een afgedekte glazen bodemschaal met behulp van een tweede fotonlaser bij 780 nanometer opwinding, beeld drie tot vier poliepen af bij twee verschillende vergrotingsniveaus met behulp van een 10 x objectief. Gebruik vervolgens de tegelscanmodus om ongeveer 25 tot 100 beelden per brandpuntsvlak in XY op 10 of 20 micron intervallen te verzamelen. Verzamel vervolgens 50 tot 100 beelden door de Z-as met intervallen van 10 of 20 micron, wat in totaal ongeveer 5.000 tot 10.000 beelden per koraalpoliep zal zijn.

Na dat beeld, drie tot vier poliepgebieden om een kern en koraalsoort te vertegenwoordigen. Bewaar vervolgens alle beelden in ruwe gegevensformaat op de harde schijf van het systeem. In deze procedure, knipt u de 2D-gegevens bij om de bestandsgrootte te verkleinen door u te concentreren op een enkele poliep met behulp van het vierkante bijsnijdingsgereed