Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Het algemene doel van deze procedure is om proliferatie en differentiatie van oligodendrocyte-lijncellen in een omgeving te onderzoeken die nauw aansluit bij wat in vivo wordt aangetroffen. Dit wordt bereikt door eerst plakculturen te bereiden van vier hersenen en cerebellum van vroeg postnataal transgene muizen. Enkele cellen in de plakken worden vervolgens gedurende perioden van uren tot dagen gefotografeerd om de cellulaire dynamica van hun proliferatie en differentiatie te visualiseren.

Na het beeldvormen wordt post hoc immunohistochemistry van de cellen gebruikt om verschillende cellulaire kenmerken te bepalen. Uiteindelijk kunnen de resultaten de dynamica van celproliferatie en -differentiatie onder normale omstandigheden en na farmacologische of genetische manipulatie tonen. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals gedissocieerde koolstof, culturen van neuronen en liga incyte lijncellen is dat plakculturen manipulatie van de acellulaire omgeving mogelijk maken met behoud van de weefselcyto architectuur.

Alle dierproeven volgen de richtlijnen en zijn goedgekeurd door het institutionele Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Connecticut ten minste twee uur voor de dissectie. Bereid weefselkweekinserts in zesputjesplaatjes voor ieder. We voegen een milliliter plakcultuurmedium toe, en brengen vervolgens de platen naar de cellencultuurincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolzuurgas minstens 15 minuten voorafgaand aan de dissectie.

Plaats de dissectiebuffer op ijs en begin het te laten borrelen met 95% zuurstof, 5% koolzuurgas. Zorg er ook voor dat alle gereedschappen en de weefselchopper gesteriliseerd zijn met 70% ethanol. Breng het weefsel over naar een steriele 35 millimeter schaal met ijskoud geoxygeneerd dissectiebuffer.

Gebruik vervolgens een scheermes om het cerebellum en voorhersenen te doorknippen met een snede door het voorhersenen en cerebellum die de hemisferen scheidt. Gebruik nu de handmatige chopper om 300 micron dikke coronale en sagittale secties van de vier hersenen en cerebellum te maken. Elk dier levert meestal zes vierhersenenplakken en zes cerebellumplakken op.

Idealiter worden plakken genomen die het voorste derde deel van het corpus callosum beslaan om zowel grijze als witte stofgebieden in dezelfde plak te bestuderen. Breng de gescheiden plakken over in vers geborrelde koude dissectiebuffer op ijs in de buffer, met behulp van een kleine dissectie- of weegspatels. Scheid de individuele secties en breng ze over naar voor incubatie.

Zesputjesplaatjes met kweekinserts. Twee tot drie plakken kunnen op één cultuur worden geplaatst. Gebruik een pipet om overtollig dissectiebuffer van het oppervlak van de cultuur te verwijderen.

Breng de plakken over naar de incubator totdat ze vastzitten. Het plakmedium moet een dag na plakbereiding worden vervangen en vervolgens om de andere dag tot plakfixatie zoals vermeld in het protocol. Afhankelijk van het experiment, gebruik de plakken na vijf tot zeven dagen.

In cultuur. Gebruik alleen de plakken die na de eerste paar dagen transparant worden en gooi degenen weg die ongelijkmatige ondoorzichtige gebieden hebben die met het blote oog zichtbaar zijn. Onder fasecontrast verschijnen deze ondoorzichtige gebieden als een klomp donkere cellen.

Als het correct wordt uitgevoerd, treden dode ondoorzichtige gebieden voor niet meer dan één tot 5% van de plakken op. Om time-lapse beeldvorming van NG twee celproliferatie en -differentiatie uit te voeren, gebruik drie tot vijf dagen oude plakken van muizen die EGFP in NG twee cellen tot expressie brengen. Laat de slides niet langer dan 15 minuten onder 37 graden Celsius komen.

Per beeldsessie, houd de plaat gesloten, gebruik de 10 x objectief van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om beelden vast te leggen op het eerste tijdstip van de cultuur. Beeld vier tot acht locaties op elke plak afkomstig van zowel grijze als witte stofgebieden van de plak.

Beeld ook nuttige herkenningspunten zoals de randen van de plakken, specifieke cellen of oriëntatie van witte stofbanen af voor herplaatsing. Het vorige tijdstipbeeld kan worden gebruikt als referentiebeeld tijdens herplaatsing voor NG twee celdeling en oligodendrocytedifferentiatie. Leg elke vier tot zes uur beelden vast gedurende idealiter vijf tot zeven dagen.

Als de induceerbare marker NG twee cre, ER YFP wordt gebruikt, induceer reporterexpressie met behulp van kweekmedium met 100 nanomolair. Vier hydroxy tamoxifen opgelost in ethanol. Reporteractiviteit zou binnen één tot twee dagen moeten verschijnen. Voor fixatie, voeg een milliliter fixeermiddel toe aan de bodem van de cultuur.

Breng het binnen en voeg nog een milliliter toe bovenop de plakken. Spuit het fixeermiddel niet direct op de plakken of ze kunnen losraken. Fixeer het weefsel gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en gebruik vervolgens een scalpel.

Snij de membranen met de plakken eraan los. Gebruik pincetten om de plakken voorzichtig over te brengen naar afzonderlijke putjes van een 24-putjesplaat beladen met PBS. Breng vervolgens de plakken over naar een tweede 24-putjesplaat beladen met blokkeeroplossing bevattende 5% normaal geitenserum en 0,1% tritton X 100 in PBS.

Laat ze een uur in de blokkeeroplossing incuberen bij kamertemperatuur. Zodra geblokkeerd, verplaats de plakken naar een plaat beladen met primaire antilichamen in PBS met 5% NGS. Laat ze een nacht incuberen bij vier graden Celsius de volgende dag.

Was de plakken in PBS. Bewerk vervolgens de plakken met secundaire antilichamen in PBS met 5% NGS. Laat de incubatie een uur op kamertemperatuur duren.

Volg dit met nog drie wasbeurten in PBS zoals eerder en monteer de plakken met de membraan naar de schuif toe, zodat deze niet tussen het objectief en het weefsel komt. Om de temporele dynamica van oligodendrocytedifferentiatie te analyseren, werden beelden van NG twee celdeling verkregen uit plakculturen van het voorhersenen van P acht NG twee creeg transgene muizen gedurende meerdere dagen, werden tijdsreeksen genomen gedurende 122 uur. Het fenotype van de gedeelde cellen werd bepaald met NG twee en CC één antilichamen.

Celproliferatie werd