Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Het algemene doel van deze procedure is om Olink Glycans te verzamelen. Dit wordt bereikt door eerst glycoproteïnen op te lossen door SDS-pagina. De tweede stap is om gel stukken te wassen die het glycoproteïne van belang bevatten.

Vervolgens worden de olink glycanen vrijgemaakt door reductieve bèta-eliminatie. De laatste stap is glycan permethylering met fasenscheiding. Uiteindelijk worden permethyleerde glycanen geanalyseerd door tandem massaspectrometrie om structuren te detecteren en abundanties te kwantificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals hoogprestatie vloeistofchromatografie, is dat onze methode neutrale en geladen permethyleerde glycanen scheidt in een snelle fasenscheiding. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het glycowetenschapsveld door een uitgebreide karakterisering van de gelinkte glycanen mogelijk te maken die vrijkomen van opgeloste glycoproteïnen. Voordat u met deze procedure begint, moet u glycoproteïnen oplossen met behulp van gelelektroforese.

Na elektroforese plaatst u de gel op een glazen plaat en snijdt u het gewenste gebied uit met een schone scalpel om de opbrengst van OG-glycanen te verhogen. Breng de gelband van belang over naar een andere glazen plaat en snijd het stuk in blokjes van ongeveer twee millimeter. Breng de kleine gel stukken over in een glazen buis met schroefdop van 13 bij 100 millimeter met een microspatelspatel van roestvrij staal.

Voeg vervolgens een milliliter 25 millimolair ammoniumbicarbonaat of ambi toe aan het monsterbuisje. Na het afdekken van het buisje met een schroefdop van Teflon, mengt u de inhoud voorzichtig door het buisje te schudden voordat u het 10 minuten laat staan. Verwijder vervolgens voorzichtig ambi uit het glazen buisje.

Voeg met behulp van een weide of glazen pipet een milliliter acetonitril toe aan het glazen buisje om de gel stukken volledig te bedekken. Na het afdekken van het buisje, mengt u de inhoud voorzichtig door het buisje te schudden voordat u het 10 minuten laat staan. Wanneer u klaar bent, verwijdert u het acetonitril uit het glazen buisje.

Nadat u de vorige stappen hebt herhaald totdat de helderblauwe kleur is verdwenen, voegt u twee milliliter ethylacetaat toe en dekt het buisje opnieuw af. Plaats het buisje gedurende een nacht op vier graden Celsius met einde-over-eind agiteren. Nadat de ethylacetaatwassing is verwijderd, voert u drie wasbeurten uit met twee milliliter gedeïoniseerd water.

Zodra de gel stukken zijn gedroogd, voegt u 500 microliter van een 100 millimolair natriumhydroxide-oplossing toe. Laat het drie tot vijf minuten op ijs staan om de gel in evenwicht te brengen met de basiscondities die de herstel van glycanen bevorderen. Voeg vervolgens 500 microliter van twee molar natriumborohydride toe in 100 millimolair natriumhydroxide, wat resulteert in uiteindelijke concentraties van één molar natriumborohydride in 100 millimolair natriumhydroxide.

Na voorzichtig te hebben gemengd, incubeert u het monster gedurende 18 uur bij 45 graden Celsius. Tijdens de eerste incubatie-uur, mengt u het buisje elke 15 minuten voorzichtig. Nadat de bèta-eliminatiereactie voltooid is en het buisje op ijs is geplaatst, voegt u langzaam 10%azijnzuur druppelsgewijs toe.

Om de basis te neutraliseren, draait u voorzichtig het monsterbuisje tussen toevoegingen van azijnzuur, centrifugeert u het buisje om bellen te elimineren en voorkomt u overloop indien nodig. Om een kleine glazen kolom te maken, krast u en breekt u het uiteinde van een weide of glazen pipet met een keramische snede, zodat de taps toelopende punt van de pipet ongeveer een centimeter lang is. Nadat u een prop glaswol uit elkaar hebt getrokken, duwt u deze naar de punt toe, waardoor een ondersteuning voor het harsbed wordt gevormd.

Bevestig de pipetkolom met een klemmen en plaats deze over een glazen testbuisje. Was vervolgens de lege pipet met glaswol met één milliliter methanol en drie milliliter 5%azijnzuur. Na het draaien van Dow X waterstof kationenuitwisselingsharsslurry in 5%Azijnzuur.

Breng genoeg van het materiaal over om een volume van één milliliter in de weide pipetkolom te produceren, spoel de kolom met vijf volumes 5%azijnzuur en controleer het doorstromen op het verschijnen van harsdeeltjes. Nadat u de kolom over een nieuwe glazen schroefdopbuis van 16 bij 125 millimeter hebt geplaatst, laadt u het monster op de kolom. Zodra het doorstromen is verzameld, eluteert u glycanen met minimaal drie volumes 5%azijnzuur in dezelfde buis.

Na lyofilisatie voegt u 300 microliter 10%azijnzuur in methanol toe aan het gedroogd monsterbuisje. Na het voorwerpen, verwijdert u het resulterende trimethylbaat door verdamping onder een stikstofstroom bij 37 graden Celsius. Na het herhalen van de resuspendatie- en droogstappen minstens vier keer, reconstitueert u het monster in 5%azijnzuur.

Zodra het monster is geladen op een geëquilibreerde C 18 kolom, verzamelt u de doorstroming in een glazen schroefdopbuis van 13 bij 100 millimeter. Eluteert u de OOG glycanen met drie milliliter 5%azijnzuur in dezelfde buis. Lyofiliseer vervolgens het monster om de basisreagentia voor permethylering voor te bereiden.

Voeg 400 microliter 50%natriumhydroxide toe aan een schone glazen schroefdopbuis van 13 bij 100 millimeter. Voeg vervolgens 800 microliter anhydrous methanol toe aan dezelfde buis. Voeg vier milliliter anhydrous dimethylsulfoxide toe en voorwerp om een witte neerslag te genereren.

Centrifugeer het monster gedurende één minuut bij 600 keer G om de neerslag te pellen. Na het weggooien van de supernatant en het toevoegen van vier milliliter anhydrous dimethylsulfoxide aan de pellet, voorwerpt u het reagens. Herhaal dit vier