Name: Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Leer hoe je plantaardige weefsels bewaart met hogedruk invriezen en quick freeze substitutie voor transmissie-elektronenmicroscopie. Deze methode minimaliseert artefactvorming en behoudt de ultrastructuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De vriendelijkheid en vrijgevigheid van Dr Kent McDonald van UC Berkeley worden zeer gewaardeerd. Wij danken een anonieme reviewer voor zeer nuttige tips. De Burch-Smith lab wordt ondersteund door het opstarten van fondsen van de universiteit van Tennessee.

OPMERKING: De QFS procedure vereist uiterste zorgvuldigheid en voorzichtigheid door de gebruiker en wij deze veiligheidsmaatregelen benadrukken hier als voorzorgsmaatregelen en opmerkingen, indien van toepassing. 1.Voorbereiding voor HPF Run <ol><li> Vóór het begin van monstervoorbereiding, zet de hoge druk vriezer volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: De HPF eenheid die wordt gebruikt in dit protocol is een Wohlwend Compact 02-eenheid (Figuur 1A), en het duurt ongeveer 1-1-en-een-half uur van de start-up procedure voor HPF loopt kan beginnen. <ol><li> Het inschakelen van de Wohlwend Compact 02 High Pressure Vriezer. <ol><li> Schakel het instrument door de hoofdschakelaar van &quot;0&quot; naar &quot;1&quot;. </li><li> Laat perslucht de machine. </li><li> Laat vloeibare stikstof om de machine. </li><li> Druk op de &quot;SYSTEM opdrogen&quot; knop. </li><li> Na 30 min, druk op de &quot;SYSTEM opdrogen &quot;nogmaals op de knop. </li><li> Druk op de &quot;ON / OFF&quot;-toets om over te schakelen op het instrument. </li><li> Druk op de &quot;nitrogen&quot; knop. </li><li> Laat de machine afkoelen voor 20 minuten, zelfs als de &quot;DRIVE IN&quot; knop al heeft verlicht. </li><li> De &quot;DRIVE IN&quot; toets licht op. </li><li> Druk op de &quot;DRIVE IN&quot; knop. </li><li> Drukt u op de knop &quot;AUTO&quot;. </li><li> De &quot;SYSTEM READY&quot;-knop gaat branden. </li><li> Plaats de temperatuur-en-druk-sonde in de drukkamer en vergrendel deze met de pin. </li><li> Druk op de &quot;JET AUTO&quot; knop. Deze stap controleert of de drukverhoging en temperatuurdaling wens zijn; in wezen een proefvaart. Scherpe dalingen van de temperatuur en de scherpe stijging van de druk wordt verwacht (Figuur 1B). </li><li> Voeren twee JET cycli. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 Voorbereiding voor Receiving Frozen Monsters <ol><li> Vul een isolatiebox met cryovial houders met vloeibare stikstof (zie Veiligheidsmaatregelen), waardoor de houders volledig bedekt (figuur 1C). OPMERKING: Gebruik PBM inclusief cryogloves en een veiligheidsbril bij het werken met vloeibare stikstof. </li><li> Plaats het juiste aantal flesjes die de FS medium in de aluminiumbuis houders in de vloeibare stikstof (figuur 1C). Met dit protocol maximaal vier schijven die elk een enkel monster in een cryovial kan worden geplaatst. OPMERKING: De flacons moeten met een scherp instrument zoals een gediamanteerde schrijver, en zeer zacht potlood worden geëtiketteerd. <ol><li> Voor fixatief tijdens QFS gebruiken 1% OsO 4 en 0,1% uranylacetaat in aceton 9. Bereid de oplossing grote hoeveelheden afzien aliquots van 1,5 ml in cryoflesjes en opslag in vloeibare stikstof ingevroren. OPMERKING: Volg de veiligheidswaarschuwingen voor het omgaan OsO 4 en uranylacetaat. OPMERKING: OsO 4 </sub&gt; en uranylacetaat zijn gevaarlijke chemische stoffen en moet in de zuurkast worden behandeld tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van gesloten-toed schoenen, laboratoriumjas en handschoenen. OPMERKING: De cryovials gebruikt om monsters te QFS houden moet harde O-ring zodat de buizen verzegeld blijven tijdens QFS lekkage van OsO 4 te vermijden. </li></ol></li><li> Bereid gist pasta door het mengen van bakkersgist met een ongeveer gelijk volume van 10% methanol met een tandenstoker of een ander dergelijk instrument, totdat de pasta glad is. De gistpasta fungeert als een extracellulair cryoprotectant en wordt gebruikt om de ruimte rond het monster in de monsterdrager vullen. De hoeveelheid pasta afhankelijk van het aantal monsters; 10 monsters of minder de pasta (1 ml) worden gemengd in een microcentrifugebuis. </li></ol> 3 Hoge druk Bevriezing van Monsters <ol><li> Verwijderen van een blad (of ander weefsel) van de belangstelling van de plant en zachtjes leg het op een stuk dental was of ander snijoppervlak. Gebruik een punch van 2,0 mm of de gewenste grootte van een steekproef uit het blad te snijden. Behandel het monster voorzichtig met een pincet en zo snel mogelijk te werken. </li><li> Werken onder een stereomicroscoop, plaatst de bladschijf in de 0,2 mm kant van het type A specimen drager en bedek volledig in gist plakken. Zorg ervoor dat de schijf volledig is gevuld en de pasta is ter hoogte van de rand van de houder door het gladstrijken van de pasta met een fijn penseel (figuur 2). </li><li> Plaats de drager in de monsterhouder. Bedek het monster met het type B specimen drager, vlakke ondergrond neer. OPMERKING: Het monster houder moet droog en op kamertemperatuur zijn. </li><li> Neem monster in specimen houder, plaatst u deze in de machine en start een bevriezing cyclus door op de &quot;JET AUTO&quot;-knop, die moet voltooien in een seconde of twee. </li><li> Zo snel mogelijk te werken, verwijder de houder uit de machine en plaats de tip die de sample in vloeibare stikstof in de geïsoleerde doos op de HPF machine. Dompel de uiteinden van twee paar tang in de vloeibare stikstof worden gekoeld. OPMERKING: Na het bevriezen, de dragers mogen alleen worden met vloeibare stikstof gekoelde pincet behandeld. Warm (kamertemperatuur) tang zijn vaak de oorzaak van de storing in cryotechniques. </li><li> Open een cryovial met de FS media en plaats het deksel aan de zijkant van de box. Met behulp van een paar van vloeibare stikstof gekoeld tang, verwijder voorzichtig de schijf uit de monsterhouder, ervoor te zorgen dat de schijf is altijd in de vloeibare stikstof of damp. Werken in vloeibare stikstof damp, houdt de FS buis met een voorgekoeld pincet en gebruik de andere om de houder te plaatsen in de FS flacon. Schroef het deksel van de FS flesje weer. Zorg dat er geen enige vloeibare stikstof in de flacon. OPMERKING: Bij het overbrengen van monsters om cryovials voor QFS, ervoor zorgen dat er geen vloeibare stikstof wordt gevangen in de flesjes. Vloeibare stikstof breidt 700-voudig tijdens verwarmen en eventuele trapped vloeibare stikstof explosies veroorzaken tijdens deze periode. </li><li> Herhaal stap 3,1-3,7 totdat alle gewenste monsters bevroren. Meerdere bladschijven die dezelfde soort monster kan in hetzelfde flesje geplaatst. Merk op dat de monsterhouder te drogen en op kamertemperatuur gebracht tussen freezen runs. Om dit snel te doen, verwarmen met een föhn, en de controle op de temperatuur op de tast. </li></ol> 4 Voorbereiding op Freeze Substitutie <ol><li> Volledig onder te dompelen de aluminium heater blok in vloeibare stikstof gedurende 10 minuten of totdat kiemkoken stopt. Terwijl dit gebeurt, plaats een laag droog ijs (1-2 cm) op de bodem van de houder als de ruimte FS (figuur 3). Een storaxschuimcontainer of ijsemmer kan voor FS, samen met gemalen droog ijs of pellets. </li><li> Plaats vlug de cryovials met de monsters samen met de temperatuursensor in de middelste rijen van het verwarmingsblok. Zorg ervoor dat de deksels op deflacons zijn stevig vastgeschroefd, zodat de FS media niet lekken tijdens FS. De gegevens van de temperatuur. <ol><li> Voeg de temperatuursonde door een thermokoppel door de bovenkant van een cryovial zodat de bodem van de buis bereikt. Sluit de deksel van de buis met hars zodat er geen vloeistof lekt. De buis 1,5 ml aceton bij het begin van elke QFS run. </li></ol></li><li> Met behulp van geïsoleerde cryogloves of grote tang, giet alles uit de vloeibare stikstof uit de verwarming blok. Zorg ervoor dat u giet de cryovials. OPMERKING: Gebruik PBM inclusief cryogloves en een veiligheidsbril bij het werken met vloeibare stikstof. </li><li> Plaats het blok met de flesjes op de laag van droog ijs in de QFS kamer. Zorg ervoor dat het blok wordt geplaatst, zodat de buizen horizontaal liggen, maar met een lichte opwaartse tilt. Er mag geen lekkage als de juiste cryovials gebruikt. </li><li> Verpak de QFS kamer met droogijs zodat de FS buizen bedekt, hoewel het niet noodzakelijkbedek de bovenkant van het blok. Plaats het deksel op de kamer. </li></ol> 5 Quick FS OPMERKING: Voer de QFS run in een zuurkast in het geval dat elke lekkage van OsO 4 per ongeluk optreedt ondanks andere voorzorgsmaatregelen. <ol><li> Plaats QFS kamer op een platform rotatieschudinrichting in een zuurkast en draaien met 125 rpm gedurende 120 min. Gedurende deze tijd de temperatuur van het blok geleidelijk toenemen tot ongeveer -80 ° C. Het roeren zorgt mengen van de componenten beter FS. OPMERKING: De plaatsing van de shaker in de zuurkast en de positie van de zuurkast deur moet in de gehele QFS procedure en voor ieder QFS werking vaste opwarming monsters waarborgen. </li><li> Verwijder het droogijs uit de kamer en ga schudden een uur. OPMERKING: de temperatuur zou toenemen tot ongeveer -15 ° C tot -20 ° C. </li><li> Verwijder de monsters en temperatuursonde van de QFS kamer en op deshaker bij kamertemperatuur gedurende nog 10-15 min, totdat ze bij kamertemperatuur. Stop met het opnemen van de temperatuur. </li><li> Tijdens FS, schakelt u de HPF machine. <ol><li> Sluit de kraan van de vloeibare stikstof tank terwijl het HPF machine wordt gevuld met stikstof. </li><li> Druk op de &quot;nitrogen&quot; knop. </li><li> Wacht tot het rode &quot;ZUIGERMOTOREN DOWN&quot; licht gaat uit. </li><li> Druk op de &quot;ON / OFF&quot; knop. </li><li> Druk op de &quot;SYSTEM opdrogen&quot; knop. </li><li> Snijd de toevoer van samengedrukte lucht naar de machine. </li><li> Na een minimum van 12 uur (om uitdroging van vocht te garanderen), schakelt u de machine uit door de hoofdschakelaar van &quot;1&quot; naar &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6 Bericht FS Processing <ol><li> Verwijder voorzichtig de FS media met plastic pipetten en plaats het in de juiste container voor giftig afval. OPMERKING: OsO 4 en uranylacetaat zijn gevaarlijke chemische stoffenen moet in de zuurkast worden behandeld tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van gesloten-toed schoenen, laboratoriumjas en handschoenen. </li><li> Spoelmonsters vier maal met 100% aceton. Verzamel de eerste twee wasbehandelingen en plaats in het giftige afval container. </li><li> Met behulp van fijne tang, verwijder de weefselmonsters van de houders. Houd monsters nat met aceton als dit wordt gedaan, en werken heel voorzichtig te breken monsters te voorkomen. Opmerking: Het is niet ongewoon en kan zelfs handig zijn de gistpasta weg van de monsters vallen op dit punt. De gist pasta is meestal erg donker bruin, terwijl het blad weefsel is nog groen. </li><li> Het verzamelen van de monsters in cryovials met aceton. Ga verder met monstervoorbereiding (infiltratie en inbedding) voor TEM volgens gebruikelijke protocollen. </li></ol>

<ol><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li>
<li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li>
<li>Bowers, B. aM. M. Ch 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowers%2C+BaMM+%22Artifacts+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Artifacts in Biological Electron Microscopy</a>. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).</li>
<li>Mollenhauer, H. H. Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollenhauer%2C+HH+%22Artifacts+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Artifacts in Biological Electron Microscopy</a>. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).</li>
<li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen%2Ffreeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li>
<li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoor%2C+H+%22Cryotechniques+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Cryotechniques in Biological Electron Microscopy</a>. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+electron+microscopy%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice.</a> Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).</li>
<li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).</li>
<li>Hippe-Sanwald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freeze+substitution+on+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Impact of freeze substitution on biological electron microscopy.</a> Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).</li>
<li>Kiss, J. Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li>
<li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li>
<li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li>
<li>Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li>
<li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+substitution+in+3+hours+or+less%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li>
<li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li>
<li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li>
<li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+microanalysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li>
<li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing%2C+cellular+tomography%2C+and+structural+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li>
<li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het succes van het protocol hier gepresenteerde sterk afhankelijk van de gebruiker. Eerst wordt geavanceerde voorbereiding nodig om ervoor te zorgen dat alle benodigde materialen zijn direct beschikbaar en in voldoende hoeveelheid om een ​​hele HPF-QFS run te voltooien. Ten tweede moet de gebruiker sneller werken, overgang van stap tot stap op efficiënte wijze dat sample handling minimaliseert, waardoor veranderingen in de natieve toestand van het weefsel te minimaliseren. Zodra monsters worden ingevroren en voordat ze ...

Onze kennis van cel ultrastructuur voornamelijk afkomstig elektronenmicroscopie, die informatie kan oplossen in het bereik van enkele nanometers 1. Ondanks het feit dat zo krachtig in resolutie TEM wordt niet beschouwd als gebruiksvriendelijk, als monstervoorbereiding vereist tijdrovend en moeizaam protocollen, en vereist enige expertise van de behandelaar. Traditionele fixatie van de monsters is gecombineerd gebruik van aldehyden en osmiumtetroxide vóór verdere verwerking die uitdroging omvat, inbedding in hars en vervolgens snijden om ultra-dunne secties die vervolgens worden gekleurd met zware metalen te produceren. Het is echter bekend dat chemische fixatie artefacten waaronder eiwit aggregatie en verlies van lipiden 1 en wijzigingen membranen die uiteindelijk invloed verscheidene cellulaire compartimenten 2 kan produceren. Deze artefacten zijn grotendeels toegeschreven aan de trage fixatie en dehydratatie bij kamertemperatuur 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Cryofixatie door hoge druk invriezen (HPF) vermijdt meeste artefacten veroorzaakt door chemische fixatie. Het principe van Cryofixatie is dat het verlaagt het vriespunt van water van 20 graden, vertraagt ​​de nucleatie en groei van ijskristallen en verhoogt de viscositeit van water in een biologisch monster zodat celbestanddelen wezen geïmmobiliseerd 6, 7. HPF afneemt a temperatuur monster met die van vloeibare stikstof, onder zeer hoge druk (210 MPa of 2.100 bar) in milliseconden. Wanneer goed uitgevoerd HPF voorkomt vorming van grote ijskristallen die grote schade aan cel ultrastructuur kan veroorzaken. HPF kan worden gebruikt om monsters van 100-200 urn dikte bepalen op typische concentraties van biologische opgeloste stoffen 7. Er zijn tal van recensies over de natuurkunde en de beginselen die ten grondslag liggen HPF, bijvoorbeeld 1, 7, 8. Na HPF worden monsters geïncubeerd bij lage temperatuur (-78.5 ° C tot -90 &amp;# 176, C) in de aanwezigheid van vloeibaar organisch oplosmiddel dat chemische fixatieven zoals osmiumtetroxide, meestal een paar dagen. Bij deze lage temperatuur wordt het water in het monster vervangen door het organische oplosmiddel, meestal aceton of methanol 1, 9. Daarom is deze werkwijze genoemd freeze substitutie (FS). Het monster wordt vervolgens geleidelijk verwarmd en gedurende deze tijd wordt vastgesteld, meestal met osmiumtetroxide en uranyl acetaat 9. Verknoping bij lage temperaturen heeft het voordeel vaststelling moleculen die geïmmobiliseerd 1. FS levert dus monsters van superieure kwaliteit in vergelijking met die van conventionele chemische fixatie bij kamertemperatuur vast, in het bijzonder het resulteert in een verbeterde ultrastructureel behoud, beter behoud van antigeniciteit en minder verlies van ongebonden cellulaire componenten 10, 11. De meeste FS wordt over langere tijdsperioden uitgevoerd typisch tot enkele dagen. Dit is vooral true voor planten monsters 12, 13, 14. Een recent protocol ontwikkeld door McDonald en Webb vermindert de tijd voor FS van enkele dagen tot enkele uren 15. In hun snelvriesstrip substitutie (QFS) procedure, wordt FS over 3 uur uitgevoerd, terwijl in de supersnelle FS (SQFS) monsters worden verwerkt in 90 minuten. De kwaliteit van de monsters die door deze werkwijzen vergelijkbaar met die aan traditionele FS protocollen. We hebben de QFS protocol voor verdere verwerking van plantaardige monsters na HPF aangenomen. Het is gebleken dat niet alleen tijd, maar ook geld, zoals QFS en SQFS gebruiken gemeenschappelijke labapparatuur plaats van de dure handel verkrijgbare FS machines. Plantenweefsels zijn vaak zeer moeilijk te bereiden TEM. Gemiddeld plantencellen groter dan zowel bacteriële of dierlijke cellen. De aanwezigheid van hydrofobe wasachtige cuticula, dikke celwanden, groot-water gevulde vacuolen bevatten organische zuren, hydrolasen en fenolische compounds die mogen nemen tot 90% van het totale celvolume 16, en de aanwezigheid van beluchte ruimtes ernstig vermindert warmtegeleidbaarheid van het systeem 17. Verder, in het geval van planten, de monsterdikte bijna altijd meer dan 20 urn, de limiet voor gebruik van chemische fixatie. Bij deze dikten, de lage warmtegeleidbaarheid van water voorkomt bevriezing percentage meer dan -10.000 ° C / sec in het midden van het monster. Dit percentage is nodig om schadelijke zeshoekige ijsvorming (ijskristallen met een lagere dichtheid en groter dan 10 tot 15 nm) te vermijden 8. Samen vormen deze huidige uitdagingen voor zowel de juiste vriespunt van het monster en de daaropvolgende FS. Toch Cryofixatie is de beste methode voor het bevestigen van planten monsters. Hier een protocol voor de HPF-QFS van plantaardige weefselmonsters wordt gepresenteerd. Het richt zich op het model soort Arabidopsis thaliana, maar is ook gebruikt met Nicotiana benthamiana. De typische resultaten tonen aan dat HPF-QFS produceert samples van vergelijkbare kwaliteit traditionele HPF-FS in een fractie van de tijd. Met de juiste aanpassingen kan dit protocol ook voor andere relatief dikke biologische monsters.

<table><tbody><tr><td>Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>HPF02</td><td>Met geïntegreerde oscilloscoop om bevriezings- en drukcurven weer te geven; PC (niet inbegrepen) is vereist voor weergave&nbsp; van bevriezingsparameters</td></tr><tr><td>Houder voor DN 3 x 0,5 mm aluminium apecimen carriers</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Specimen carriers, P=1.000, DN 3 x 0,5 aluminium, type A</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>241-200</td><td></td></tr><tr><td>Specimen carriers, P=1.000, DN 3 x 0,5 aluminium, type B</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>242-200</td><td></td></tr><tr><td>Opslag Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td><td>Chart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baker's gist</td><td></td><td></td><td>Houder de betere, om overmatige gas (CO2) productie te voorkomen</td></tr><tr><td>Tandstokers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermokoppel data logger EL-USB-TC</td><td>OMEGA Engineering Inc.</td><td>OM-EL-USB-TC&nbsp;</td><td>Vervangende batterij afzonderlijk te koop</td></tr><tr><td>Temperatuursonde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>34505</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsblok 12/13 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roterende shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-10</td><td></td></tr><tr><td>Blad punch - Harris Uni-core 2,00</td><td>Ted-Pella Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>Roze tandheelkundig was</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Cryogene vials 2 ml</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haardroger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Droog ijs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td>Meerdere paren</td></tr></tbody></table>

tandem hogedruk invriezen en quick freeze vervanging van plantaardige weefsels voor transmission electron microscopy

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Sinds 1940 transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is het verstrekken van biologen met ultra-hoge resolutie beelden van biologische materialen. Maar omdat bewerkelijke en tijdrovende protocollen vereisen ook ervaring bereiding van artefactvrij monsters TEM wordt niet als een gebruiksvriendelijke techniek. Traditionele monstervoorbereiding voor TEM gebruikt chemische fixatives om cellulaire structuren te behouden. Hogedruk invriezen is Cryofixatie biologische monsters onder hoge druk zeer snel afkoelsnelheid produceren, waardoor ijsvorming, hetgeen nadelig is voor de integriteit van cellulaire ultrastructuur beperken. Hoge druk invriezen en vries substitutie zijn de methoden van de keuze voor het produceren van de hoogste kwaliteit morfologie in harssecties voor TEM. Deze methoden minimaliseren van de artefacten normaal in verband met conventionele verwerking voor TEM van dunne secties. Na Cryofixatie het bevroren water in het monster wordt vervangen door vloeistoforganisch oplosmiddel bij lage temperaturen, een proces genaamd freeze substitutie. Freeze substitutie wordt meestal uitgevoerd over meerdere dagen in speciale, dure apparatuur. Een innovatie kan het proces drie uur te vullen, in plaats van de gebruikelijke twee dagen. Dit wordt meestal gevolgd door een aantal dagen van monstervoorbereiding dat infiltratie en inbedding in epoxyharsen voor het snijden omvat. Hier presenteren we een protocol combineert hoge druk invriezen en quick freeze substitutie waarmee planten monster fixatie kan worden bereikt binnen een paar uur. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het werken met andere weefsels of organismen. Plantenweefsels zijn van bijzonder belang vanwege de aanwezigheid van beluchte ruimtes en watergevulde vacuolen die ijsvrij bevriezing van water belemmeren. Bovendien is het proces van chemische fixatie is bijzonder lang in planten door celwanden de penetratie van de chemische belemmeren om diep in de weefsels. Plantaardige weefsels zijn daarom particularly uitdagend, maar dit protocol is betrouwbaar en produceert monsters van de hoogste kwaliteit.

Onderstaande resultaten zijn verkregen met behulp van een Wohlwend Compact 02 voor HPF (figuur 1A). Een groot voordeel van dit instrument is het gemak van het gebruik van het model dragers en de houders ervan. Bij het ​​gebruik van andere instrumenten, McDonald raadt twee gebruikers de monstervoorbereiding en HPF, men moet uitvoeren voorbereiding van de monsters en de andere doet het invriezen en transfer naar de FS cryovials 9. De Wohlwend monsterdragers en houder is eenvoudig genoeg voor ee...

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cellulaire structuren van plantencellen te immobiliseren door hoge druk, bevriezing en snelle vriesvervanging voor daaropvolgende visualisatie door transmissie-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door zorgvuldige voorbereiding van een weefselmonster voor bevriezing door het te coderen met een cryoprotectant om ervoor te zorgen dat het weefsel minimaal beschadigd raakt tijdens bevriezing onder hoge druk. Als tweede stap wordt het monster snel bevroren onder hoge druk, wat de celcomponenten immobiliseert en de vorming van kristallijn ijs beperkt, resulterend in cellen met intacte morfologie.Vervolgens wordt snelle vriesvervanging uitgevoerd om het cellulaire water te vervangen door organische oplosmiddelen en om fixeermiddelen zoals osmiumtetroxide te introduceren, waardoor cellulaire ultrastructuren worden gekoppeld en gestabiliseerd. Er worden resultaten verkregen die aantonen dat bevriezing onder hoge druk en snelle vriesvervanging effectief plantencellulaire structuren en morfologie behouden op basis van transmissie-elektronenmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zo

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Hier laten we zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. We laten ook zien hoe u monsters kunt voorbereiden op ultradunne secties na snelvriezen.

Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Leer hoe je plantaardige weefsels bewaart met hogedruk invriezen en quick freeze substitutie voor transmissie-elektronenmicroscopie. Deze methode minimaliseert artefactvorming en behoudt de ultrastructuur.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Meer video's verkennen