Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Het algemene doel van het volgende experiment is om veranderingen in alternatieve splitsing tijdens EMT te detecteren. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een inductibel EMT-model waarin expressie van het fusie-eiwit twist er. In de humane mammaire epitheelcellen activeert het EMT bij behandeling met tamoxifen als tweede stap.

De expressie van splitsvarianten wordt geanalyseerd door kwantitatieve R-T-P-C-R met behulp van isovormspecifieke primersets, wat veranderingen in alternatieve splitsing op RNA-niveau onthult. Vervolgens wordt de abundantie van eiwitten die overeenkomen met elke isovorm bepaald door immunoblotting om de expressie van splitsvarianten op eiwitniveau te bevestigen, resultaten worden verkregen die veranderingen in alternatieve splitsing in genen van belang tijdens EMT laten zien, gebaseerd op kwantitatieve R-T-P-C-R en immunoblotting analyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van RN-alternatieve splitsing en EMT, zoals hoe alternatieve splitsing wordt gereguleerd tijdens EMT en hoe deze regulatie EMT en EMT-gerelateerde pathologische processen beïnvloedt. De implicaties van deze techniek zijn van belang voor kankertherapie omdat EMT een belangrijke rol speelt bij het bevorderen van tumorinvasie en metastase.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in alternatieve splitsing tijdens EMT. De methode voor isovormspecifieke MRA-detectie kan ook worden toegepast in andere systemen, zoals het bestuderen van alternatieve splitsing in neurondifferentiatie en het programma van celdood. De eerste stap is om cellen die het twist ER-fusie-eiwit tot expressie brengen in een 10 centimeter weefselkweekschaal te zaaien in duplicaat, vervolgens de Tamoxifen-oplossing te bereiden en te beschermen tegen licht om de epitheliale mesenchymatische overgang of EMT te induceren, behandel cellen met 20 nanomolar Tamoxifen bevattende media voor een niet met Tamoxifen behandelde controlegroep, voeg 0,01% ethanol toe aan een extra set cellen twee dagen na incubatie.

Maak foto's onder een lichtmicroscoop bij 10 x vergroting om eventuele morfologische veranderingen vast te leggen. Was vervolgens de cellen met koud PBS. Schraap de cellen van de ene helft van de plaat in RNA-lysebuffer voor RNA-isolatie en de andere helft in 100 microliter ijskoud ripa-buffer voor eiwitanalyse. Passageer de cellen uit beide groepen zoals eerder werd getoond en behandel continu met 20 nanomolar Tamoxifen of voertuig.

Herhaal deze stappen om de dag tot dag 14, waarop Tamoxifen-behandelde twist ER-cellen een spindelvormige mesenchymatische morfologie zouden moeten vertonen. Terwijl de met voertuig behandelde controles de kubusvormige epitheliale morfologie zouden moeten behouden. Hier wordt een vier-exon prem NNA gebruikt als voorbeeld voor de detectie van exon-inclusie.

Ontwerp een voorwaartse primer binnen het variabele exon drie en een omgekeerde primer binnen het nabijgelegen constitutieve exon vier. Dit maakt de specifieke amplificatie van het variabele exon inclusie-isovorm mogelijk om exon-overspringingsgebeurtenissen specifiek te versterken. Ontwerp primers die de verbinding tussen het constitutieve exon twee en exon vier overspannen, die anders zouden worden vernietigd wanneer variabele exon drie wordt opgenomen.

Ontwerp de andere primer binnen het constitutieve exon vier om de totale transcripten van het gen te detecteren en vermijd PCR-producten die zijn versterkt vanuit genoom-DNA of prem NA. Ontwerp primers binnen twee constitutieve exons wanneer u klaar bent. Volg standaard RNA-extractieprocedures om het RNA van de eerder verzamelde celmonsters te isoleren. Bepaal de concentratie en kwaliteit van RNA door UV-absorptie om de eerste streng CD NA op te zetten, stel reverse transcriptase-reacties op in een eindvolume van 20 microliters.

Voer RT-reacties uit bij 42 graden Celsius gedurende een uur, gevolgd door incubatie bij 70 graden Celsius gedurende vijf minuten. Om het RT-enzym te inactiveren voor real-time. PCR, stel 20 microliter-reacties op die bestaan uit 10 microliters cyber groen mastermix, 0,1 tot 1,0 microliters CD NA-sjabloon en vijf picomol voorwaartse en omgekeerde primers.

Voer real-time PCR uit met 40 cycli in drievoud. Controleer de dissociatiecurven en zorg ervoor dat er voor elke primerset een enkele piek wordt waargenomen. Verkrijg de kwantificeringscycluswaarden door de tweede afgeleide waarden van de amplificatiecurven te berekenen.

Bereken de relatieve hoeveelheid doelmRNA's in geïnduceerde monsters vergeleken met het niet-geïnduceerde monster met behulp van de delta delta CQ-methode zoals getoond door deze formule. Laat de cellen die zijn verzameld voor eiwitanalyse ongeveer 10 minuten op ijs staan voordat u centrifugeert en het supernatant verzamelt. Na het bepalen van de eiwitconcentratie, verdun de monsters in SDS-loading, buffer en laad 20 tot 40 microgram eiwitten in 10%SDS-page-gels.

Voer SDS page-gels uit bij 20 milliamp voor 1,5 uur. Breng de eiwitten na deze tijd over naar PVDF-membranen in een nat overdrachtssysteem bij vier graden Celsius gedurende drie uur bij 85 volt. Pas de overdrachtstijd aan volgens het molecuulgewicht van de doeleiwitten.

Blokkeer vervolgens het membraan gedurende 30 minuten tot een uur met 5% magere melk. Incubeer het membraan bij kamertemperatuur gedurende een nacht bij vier graden Celsius met een primaire antilichaam. Het primaire antilichaam herkent het epitoop in het constitutieve exon coatinggebied en detecteert gelijktijdig slic-isovormen op basis van hun verschillende eiwitgroottes.

Tegelijkertijd bewaakt u EMT door immunoblotting. Voor EMT-markers. Gebruik eec, ahern, gamma-catenine en occludine als epitheliale markers en fibronectine n-cadherine en menton als mesenchymale markers.

De volgende dag wast u het membraan drie keer met TBST met intervallen van vijf minuten. Incubeer vervolgens het membraan gedurende een uur bij kamertemperatuur met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in een verdunning van 1 op 10.000. Na deze tijd wast u het membraan nogmaals drie keer met TBST met intervallen van vijf minuten.

Ten slotte visualiseert u de eiwitten met een chemiluminescentie detectiesysteem en s