Name: In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Leer de in vitro-reconstitutie van licht-oogstende pigment-eiwitcomplexen uit spinazie en algen. Dit protocol toont extractie, expressie van APA-eiwit in E. coli en spectroscopische analyse voor fotosyntheseonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Europese onderzoeksraad door een ERC starting/consolidator-subsidie aan RC en door de Nederlandse Stichting voor onderzoek naar materie (FOM) via een FOM-programma (10TM01).

1 Totaal pigmentextractie van spinazie bladeren <ol><li> Meng een handvol spinazie (~ 20 g) in 100 ml koude maalbuffer (zie tabel 1) met een menger gedurende 20 sec. </li><li> Filtreer de oplossing door twee lagen nylon doek met een poriediameter van 20 pm en gecentrifugeerd filtraat bij 1500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet met de chloroplasten met een zachte artiesten kwast in 1 ml koude wasbuffer (zie tabel 1). Nadat de pellet wordt geresuspendeerd, voeg 50 ml wasbuffer en centrifugeer de oplossing bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig (thylakoiden) in 50 ml wasbuffer (zie tabel 1). </li><li> Centrifugeer de oplossing bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en volledig verwijderen van het supernatant. Op dit punt, het uitvoeren van de volgende stappen in het donker, om pigment oxidatie te voorkomen. </li&gt; <li> Voeg ~ 20 ml 80% aceton gebufferd met Na 2 CO 3 (zie Tabel 1) om het pigment te extraheren. Laat de oplossing op ijs gedurende 10 minuten, vortexen af ​​en toe. </li><li> Pellet de cellulaire componenten door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. OPMERKING: Als de pigmenten niet helemaal uitgepakt, zal de pellet een groene kleur hebben en stap 1.6 moet worden herhaald. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof in een scheitrechter. Voeg 0,4 volumes diethylether, schud krachtig en open de klep om het gas te ontluchten. </li><li> Voeg 0,8 volumes van 0,33 M NaCl en meng krachtig. Laat ~ 10 min voor de lagen te scheiden. De etherfase bovenaan bevat de geëxtraheerde pigmenten. Verwijder de transparante onderste fase. Opmerking: Als de scheiding niet duidelijk, bevriezen en ontdooien de oplossing fasescheiding verbeteren. </li><li> Verwijder de ether door gieten van de top van de scheitrechter in een geschikte glazen container. Droog door het toevoegen van een lepel granheid op watervrij natriumsulfaat. Schud de oplossing en laat ~ 5 min voor het droogmiddel water absorberen uit de ether. OPMERKING: Herhaal deze stap als de natriumsulfaat volledig samen geklonterd lijkt; Er moet een vrij zwevende kristallen wanneer de ether voldoende gedroogd. Als een waterlaag vormen verwijdert dit met een Pasteur pipet voor het toevoegen van extra watervrij natriumsulfaat. </li><li> Schenk de ether in nieuw glazen container, waardoor de natriumsulfaat vaste stof achter. </li><li> Damp de ether in een roterende speedvac of onder een stroom N2. </li><li> Los het pigment volledig in 10 ml 100% aceton. </li><li> Verdun een kleine hoeveelheid (~ 3 ui) in 1 ml van 80% aceton en meet de absorptiespectra en bepaal de Chl a / b-verhouding en de Chl concentratie met de door Porra e.a. methode. (1989) 15. </li><li> Aliquot en droog de ​​pigmenten in een roterende speedvac of onder N2 stroom totdat de acetonvolledig afgedampt. Bewaar de gedroogde pigmenten bij -80 ° C. </li></ol> 2 Winning van carotenoïden uit Spinazie <ol><li> Volg de stappen 1,1 tot 1,5. Op dit punt, het uitvoeren van de volgende stappen in het donker, om pigment oxidatie te voorkomen. </li><li> Resuspendeer de pellet in thylakoid ~ 50 ml 96% ethanol gebufferd met Na 2 CO 3 (zie Tabel 1) om het pigment te extraheren. Laat de oplossing op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Pellet de cellulaire componenten door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. OPMERKING: Als de pigmenten niet helemaal uitgepakt, zal de pellet een groene kleur hebben en stap 2.2 moet worden herhaald. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof verwijderd en 0,1 volume 80% KOH (w / v) verzeping initiëren. </li><li> Laat de oplossing bij 4 ° CO / N, goed afgesloten en beschermd tegen het licht. </li><li> Verzamel de oplossing in een scheidtrechter. Voeg 1 volume diethylether en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 0,8 voloproepsignaal van 0,33 M NaCl en meng voorzichtig. Laat ~ 10 min voor de lagen te scheiden. De oranje etherfase bovenaan bevat verzeepte carotenoïden. Verwijder de groene onderste fase door aftappen door de plugkraan van de trechter. </li><li> Voeg 3 delen water toe en meng het kaliumhydroxide verwijderen. Wacht tot de lagen te scheiden. OPMERKING: Als de bovenste fase troebel, voeg een kleine hoeveelheid NaCl (bv 3 g NaCl in 200 ml oplossing) en schud zachtjes op te lossen. </li><li> Verwijder de onderste fase door aftappen door de plugkraan van de trechter. </li><li> Volg stap 1,10-1,13. </li><li> Verdun een kleine hoeveelheid (~ 3 ui) in 1 ml van 80% aceton en meet de absorptie spectra bij 440 nm in 80% aceton. Om de concentratie te bepalen, gebruikt de gemiddelde extinctie coëfficiënt van de carotenoïden (ε = 440 255) 16 de volgende formule: Car [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (optische weglengte) = 1 cm. </li><li> Aliquot en droog de carotenoids in een speedvac of onder N2 stroom totdat alle diethylether werd verdampt. Bewaar de gedroogde pigmenten bij -80 ° C. </li></ol> 3 Totaal Pigment en Carotenoïde Winning Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Groeien C. reinhardtii op vast TAP medium 17 in een petrischaal door het verspreiden van een kleine hoeveelheid vloeibare kweek op het oppervlak. Groeien onder continue belichting flux van 20 umol&#39;s PSA m -2 s -1 tot er een groene laag van cellen zichtbaar. </li><li> Met behulp van een steriele entnaald, oogst een kleine hoeveelheid C. reinhardtii van de vaste TAP medium en zet de cellen in 500 ml TAP medium 17 in een 1 L kolf. Groeien de cultuur bij 25 ° C met 170 rpm agitatie onder een continue belichting flux van 20 umol&#39;s PSA m -2 sec -1. </li><li> Na 5-6 dagen, dient de kweek het einde van de logaritmische fase bereikt (6 x 10 6 cellen / mlof 2-2.5 optische dichtheid bij 750 nm). Centrifugeer de kweek bij 4000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Voor de totale pigmentextractie, volgt u stappen 1,6-1,15. </li><li> De opbrengst van de totale pigment extract vanaf 500 ml volle groei cultuur van C. reinhardtii is ongeveer 5 ml oplossing met een concentratie van 0,5 mg chl a + b / ml. </li><li> Voor carotenoïden extractie, volgt u stappen 2,2-2,12. </li></ol> 4 Zuivering van Inclusion Bodies <ol><li> Kloon de coderende sequentie van de LHC eiwit van interesse in een expressievector die resulteert in een gefuseerd C-eindstandige His-tag onder toepassing van standaard moleculair biologische werkwijzen. Transformeer deze construct in E. coli gastheerstam zoals BL21 (DE3). </li><li> Bereid Lysis buffer, Detergent buffer, Triton buffer, TE (tabel 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en LB medium 18 met de geschikte antibiotica. </li><li> Kies een enke E. coli kolonie die de expressie kloon van een vers uitgestreken plaat in ~ 5 ml LB medium met geschikte antibiotica middels standaardprocedures 6. Groeien bij 37 ° C met 220 rpm agitatie gedurende tenminste 16 uur. </li><li> Voeg 2,5 ml van de O / N kweek in een 1 L erlenmeyer met 250 ml LB aangevuld met de juiste antibiotica. </li><li> Kweek de cellen gedurende 2-3 uur (of totdat de OD 600 is ~ 0,6) bij 37 ° C bij 220 rpm. </li><li> Voeg IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Blijf de cellen groeien bij 37 ° C met 220 rpm 3-4 uur. </li><li> Centrifugeer de kweek gedurende 10 minuten bij 5000 xg bij 4 ° C in een vooraf gewogen centrifugebuis. Verwijder het supernatant zorgvuldig en bepaal het gewicht van de pellet door opnieuw wegen en aftrekken van de centrifugebuis gewicht. </li><li> Resuspendeer de E. coli cel pellet in 0,8 ml / g lysisbuffer door krachtig vortexen. OPMERKING: U kunt de cel pellet bij -80 worden bevrorenC voor later gebruik. Als u met een bevroren pellet, volledig laten ontdooien voor het toevoegen van de lysis buffer. </li><li> Voeg 2 mg lysozym per gram cellen en incubeer op nat ijs met af vortexen gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCl, 20 ug / ml RNAse. Vortex en zet op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 2 ml koude buffer Detergent per gram cellen. Meng goed en houden kamertemperatuur 5 minuten. </li><li> Transfer naar 2 ml centrifugebuis (in twee buizen indien nodig). Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C om de insluitingslichamen te pelleteren. </li><li> Voeg 1 ml koud Triton buffer en een volledige resuspensie van de pellet door behandeling met ultrageluid (3 pulsen x 5 sec x 50% vermogen met 20 sec interval). OPMERKING: Laat de buis in een klein bekerglas omringd door ijswater om het tijdens de behandeling met ultrageluid koud te houden. In het geval van meerdere buizen combineren geresuspendeerd inclusielichamen in een buis na resuspensie. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000xg bij 4 ° C om de insluitingslichamen te pelleteren. </li><li> Herhaal stap 4.13 en 4.14 twee keer. </li><li> Resuspendeer de inclusielichamen in 1 ml koude TE met sonificatie een laatste wassing voor het Triton buffer te verwijderen. Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C om de insluitingslichamen te pelleteren. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml koude TE door sonificatie. </li><li> Beoordeel de eiwitconcentratie met standaardmethoden zoals de Bradford assay 19. WINKEL aliquots van de inclusielichamen bij -20 ° C. </li></ol> 5 Reconstructie Dit protocol levert gewoonlijk 1-2 ml gereconstitueerde eiwit met een buitendiameter van 4 bij absorptie wordt gemeten in de regio Qy (600-750 nm). Afname kan naar wens worden ingesteld, maar er moet worden om de juiste verhoudingen te behouden tijdens de procedure. <ol><li> Bereid de volgende oplossingen zoals beschreven in Tabel 1: 2x Reconstitution Buffer, 20% OG, 2 M KCl, TE. Voer de volgende sTEP&#39;s bij weinig licht. </li><li> Resuspendeer 800 ug LHC inclusielichamen in totaal 400 pi TE in een 2 ml microcentrifugebuis. Voeg 400 ul van de 2x reconstitutiebuffer en vortex kort. </li><li> Voeg 0,6 ul van β-Mercaptoethanol (stock 14.8 M) tot een eindconcentratie van 10 mM heeft. Verwarm het eiwit gedurende 1 min bij 98 ° C. Vortex kort plaats bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. </li><li> Resuspendeer 500 ug totaal gedroogd chlorofylpigmenten plus 80 ug carotenoïde pigmenten in 30 ul 100% EtOH door krachtig vortexen gedurende 1 min of plaats in een badsonicator gedurende 1-2 minuten. </li><li> Draai de pigmentmix ~ 30 seconden bij 15.800 xg bij 4 ° C en controleer of er geen pellet. Als er een pellet, herhaal vortexen en / of sonificatie. BELANGRIJK: Na de resuspensie en de spin meteen pigment toe te voegen aan het eiwit, of het kan aggregeren en zal opnieuw moeten worden gesuspendeerd. </li><li> Voeg langzaam het pigment mix om het afgekoelde eiwit terwijl vortexen. Blijven vortex 5-10 sec en plaats buis op nat ijs. Pas te krachtig niet vortex als het eiwit de bovenkant van de buis kan overstromen. </li><li> Voeg 94 ul van 20% octyl-β-D-glucopyranoside (OG) (eindconcentratie van 2%), vortex kort houden op ijs 10 min. </li><li> Voeg 90 ul van KCl 2 M (uiteindelijke concentratie 150-200 mM), vortex kort en blijf op ijs 20 min. OPMERKING: column voorbereiding (hoofdstuk 6) kan op dit moment worden gestart. </li><li> Spin gedurende 10 min bij 15.800 xg bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet (neergeslagen LDS) een 10 ml buis. Houd koude en beschermd tegen licht. </li></ol> 6 Nickel Column Zuivering <ol><li> Bereid de volgende oplossingen zoals beschreven in Tabel 1: OG buffer, OG spoelbuffer, Elution buffer. </li><li> Sluit een Ni-Sepharose-kolom (1 ml) of equivalent aan een peristaltische pomp zodat er geen lucht in het inwendige van de kolom tijdens deze stap en de volgende stappen. </li><li> Stel de snelheid van tHij pomp tot 1 ml / min en spoel de kolom met 5-10 ml water om de opslagoplossing verwijderen. </li><li> Equilibreer de kolom met 3-4 ml OG buffer. </li><li> Voeg 3-4 ml OG buffer om het eiwit monster en belasting van de kolom. OPMERKING: als het eiwit is zittend op het ijs langer dan 10 minuten na het verwijderen van de LDS, draai weer bij 15.800 xg bij 4 ° C gedurende 1 minuut om extra LDS neerslag te verwijderen. </li><li> Spoel de kolom met 5 ml OG buffer. </li><li> Was de kolom met 2 ml OG spoelbuffer. </li><li> Elueren het gebonden eiwit met 3 ml elutiebuffer. Verzamel de groene elueren die het opgeloste eiwit bevat. Opmerking: Dit is meestal ongeveer 1 ml in totaal. </li></ol> 7 Sucrose gradiëntcentrifugatie <ol><li> Bereid de volgende oplossingen zoals beschreven in Tabel 1: Sucrose-oplossing, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6. </li><li> Vul ultracentrifugebuizen met de sucrose-oplossing en bevriezen bij -20 ° CO / N or -80 ° C gedurende tenminste 1 uur. </li><li> Haal de buis uit vriezer en laat het ongestoorde ontdooien bij 4 ° C. OPMERKING: De vries / dooi proces creëert een gradiënt van 0,1 tot 1 M sucrose. Een 15 ml buisje dooi kenmerkend in ongeveer 3 uur. </li><li> Verwijder voorzichtig van boven hetzelfde volume als de groene fractie geëlueerd uit nikkel Sepharose kolom in stap 6.8. Laad daarna de gereconstitueerde monster bovenop langzaam om te voorkomen dat het verstoren van het verloop. </li><li> Balance buizen en centrifugeren op 200.000 xg bij 4 ° C in een ultracentrifuge met een SW-41 of SW-60 swinging bucket rotor gedurende 18 uur, op acceleratie en stoppen zonder remmen vertragen. </li><li> Verwijder voorzichtig het verloop van de buis houder met een pincet. Gebruik een spuit met een lange naald die een stompe opening naar de fractie van boven Collect. OPMERKING: Anders, verzamel fracties uit de bodem van de buis doorboren met een naald en verzamelen druppels. </li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict

Membraaneiwitten zijn niet zo makkelijk om te studeren. Isolatie van natieve membraaneiwitten wordt gecompliceerd door de noodzaak de lipide bilaag oplosbaar met detergentia die het eiwit kan beschadigen en verwijderen essentiële cofactoren. Deze eiwitten kunnen ook bij lage niveaus in biologische membranen, of wordt gemengd met nauw verwante eiwitten, zoals bij het light harvesting complexen, die zuivering van afzonderlijke complexen bemoeilijkt. Heterologe eiwitexpressie in E. coli en in vitro reconstitutie biedt de mogelijkheid om deze problemen te vermijden. In vitro reconstitutie en zuivering van gevouwen eiwitten resulteert in complexen die kenmerken vergelijkbaar met die van de natieve complexen 20,21,23 is er wel kan worden gebruikt om complexen die niet kunnen worden gezuiverd tot homogeniteit 24 studeren - 27. Deze methode maakt gebruik van spinazie, dat is gemakkelijk attainable jaar door, als een bron voor het totale pigment en carotenoïdenpreparaten. Voor sommige reconstructies van eiwitten afkomstig uit algen, is het gebruik van pigmenten gezuiverd uit algen voorkeur vanwege verschillende pigment samenstellingen. De Chl a / b-verhouding en Chl / auto verhouding hetzelfde blijft ongeacht pigment bron. Het is belangrijk te realiseren dat de efficiëntie van de reconstitutie gewoonlijk ongeveer 35% 28. Zo is het noodzakelijk om de niet-gebonden pigmenten en uitgeklapte apoprotein van de oplossing na de reconstitutie verwijderen. Een twee-staps zuiveringsproces protocol wordt gepresenteerd in dit protocol (zie ook resulteert). Er moet echter worden opgemerkt dat de sucrose gradiënt stap de volledige scheiding van apo-en holo-eiwit niet toestaat. Voor de meeste analyses is dit geen probleem, aangezien de apoproteïne geen pigmenten en dus niet interfereert met de functionele metingen. Daarom, moet het apo-eiwit volledig te verwijderen van de fractie met het gereconstitueerde complex (bijvoorbeeld om het pigment eiwit stoichiometrie berekenen) kan een anionische uitwisselende kolom gebruikt (zie Passarini et al. 2009 29 voor details). Het vermogen om recombinante light harvesting eiwitten te hervouwen met geïsoleerde pigmenten in vitro biedt de gelegenheid om &quot;manipuleren&quot; de complexen door aanpassing van de reconstitutie &quot;omgeving&quot; op verschillende manieren, waardoor de kenmerken van het verkregen complex veranderen. Bijvoorbeeld, de pigment samenstelling verandert tijdens reconstitutie kan resulteren in een complex met gewijzigde pigment compositie. Deze functie kan worden gebruikt om de invloed van verschillende pigmenten op de structuur en stabiliteit van het complex te bestuderen. Meestal pigment preparaat met spinazie een Chl a / b verhouding van 3: 1 en een Chl / auto-verhouding van 2,9: 1. Deze verhouding geeft gewoonlijk een gereconstitueerd eiwit met dezelfde eigenschappen als de ntieve een. Echter, kan aanpassing van de Chl a / b-verhouding door toevoeging van gezuiverde Chl a of b beïnvloeden de binding van verschillende pigmenten door variabele selectiviteit van de bindingsplaatsen 30-33. Dit is mogelijk omdat de meeste pigment bindingsplaatsen niet volledig selectief voor Chl a of b Chl, maar is geschikt voor beide, zij het ​​met verschillende affiniteit 10,30,34. Op soortgelijke wijze werden de carotenoïde bindingsplaatsen ook aangetoond kunnen meerdere xanthofyl species 8,35 tegemoet - 38. Verschillende reconstructies van CP26, een pigment-eiwitcomplex van hogere planten, met verschillende pigment samenstellingen worden getoond in Tabel 2 39. Deze reconstructies werden gebruikt om de affiniteit van bindingsplaatsen voor bepaalde pigmenten 39 beoordelen. Het is interessant op te merken dat, om een ​​complex met hetzelfde pigment c verkrijgenAMENSTELLING als naturalness moet de Chl a / b-verhouding van pigment mix 3: 1. Dit lijkt het geval voor alle LHC complexen van hogere planten 20,40 zijn. De combinatie van moleculaire biologie met de reconstitutie techniek kan de eigenschappen van een Chl-bindende complex te bestuderen in meer detail. Het belang van de verschillende eiwit domeinen op de stabiliteit en het vouwen van de complexen, of hun betrokkenheid bij de eiwit-eiwit interacties, zijn bepaald door het afkappen van de apo-eiwit of het uitvoeren van willekeurige mutagenese 8,41 - 44. Single aminozuurresiduen rol in de coördinatie van verschillende pigmenten kunnen worden veranderd door plaatsgerichte mutagenese om de eigenschappen van de individuele pigmenten analyseren of evalueren hun bijdrage aan de functie en stabiliteit van het complex 10,28,29,45 - 52. Figuur 6 toont gereconstitueerde Lhcb4 (CP29) meteen mutatie van de histidine op positie 216 53. Een vergelijking van de pigment samenstelling van wildtype en mutante complexen toont aan dat de mutatie induceert het verlies van Chl een molecuul, wat aangeeft dat de doelplaats herbergt een Chl een in de WT complex. De verschillen van de absorptiespectra van WT en mutante, na normalisatie naar het pigmentgehalte, toont ook de absorptie eigenschappen van de verloren pigment. In dit geval kan het verschil te zien in de grote piek bij 680 nm, wat aangeeft dat de Chl een gecoördineerd door His216 absorbeert bij deze golflengte (voor meer informatie over deze mutant en de spectroscopische eigenschappen zie Mozzo et al. 2008 53). Mutatie analyse kan ook worden gebruikt om het effect van het milieu op de spectroscopische eigenschappen van de pigmenten 54 bepalen. Concluderend kan licht oogsten eiwitten gemakkelijk worden opgelost in vitro resulteert in pigment-protein complexen met zeer vergelijkbare eigenschappen met inheemse complexen. Op deze wijze worden de problemen isoleren natieve eiwitten geëlimineerd, terwijl het ook eiwitpreparaat met hoge opbrengst en zuiverheid voor verdere studie. Het belang van een 3: 1 Chl a / b-verhouding in het produceren van een authentiek complex wordt benadrukt, en voorbeelden van gereconstitueerde wildtype en mutante LHCs worden aan toepassingen van de techniek illustreren.

De fotosynthese-apparaat van planten en algen bevatten integrale membraaneiwitten die chlorofyl a binden (chl a), b (chl b) en carotenoïden (auto). De pigment-eiwitcomplexen zijn actief in oogsten lichtenergie en overdracht die excitatie energie aan het reactiemengsel centra, waar het wordt gebruikt om ladingsscheiding 2 promoten. Ze zijn ook betrokken bij regulerende feedback mechanismen die de fotosynthese-apparaat van hoge lichte schade 3,4 beschermen. The light harvesting complexen (LHCs) bestaan ​​uit een grote familie van verwante eiwitten in planten en algen 5. De homogene zuivering van elk lid van de familie wordt bemoeilijkt door de zeer vergelijkbare chemische en fysische eigenschappen van de complexen. Bovendien zuiveringswerkwijzen vaak tot verlies van pigmenten of andere potentiële cofactoren zoals lipiden. In vitro reconstitutie vertegents een krachtige methode om deze problemen te overwinnen. De LHC verbonden fotosysteem II (LHC-II) werd eerst gereconstitueerd in vitro door Plumley en Schmidt in 1987 1. De onderzoekers geëxtraheerd ontvette eiwitten en pigmenten afzonderlijk van planten chloroplasten, en vervolgens gecombineerd warmte gedenatureerd eiwit met pigmenten in aanwezigheid van lithium Dodecyl Sulfate (LDS), gevolgd door drie cycli van invriezen en ontdooien 1. Zij toonden aan dat de spectrale eigenschappen van de gereconstitueerde LHC complexen waren zeer vergelijkbaar met complexen gezuiverd uit planten. Het gemak reconstitueren LHC pigment-eiwitcomplexen, waarschijnlijk vanwege een aantal inherente zelfassemblage functie, samen met de moeilijkheid om gezuiverde complexen uit organismen, tot de snelle vaststelling van de werkwijze door andere onderzoekers. De reconstitutie van fotosynthetische proteïnen overexpressie in Escherichia coli (E. coli) bereikt door Paulsen en collega&#39;s in 1990 6. In E.coli, overexpressie membraaneiwitten worden meestal verpakt in inclusielichamen, welke voorzieningen de zuivering. Reconstitutie wordt bereikt door hitte denaturatie van de inclusielichamen bevattende recombinant eiwit in aanwezigheid van LDS, gevolgd door de toevoeging van pigmenten die de eiwitvouwing initieert. Vouwen van de LHCII complex is een proces in twee stappen: eerst wordt chlorofyl een gebonden in minder dan 1 minuut; tweede, is chlorofyl b gebonden en gestabiliseerd gedurende enkele minuten 7. Naast het verschaffen van inzicht in de vouwen dynamiek, in vitro reconstitutie gecombineerd met plaatsgerichte mutagenese heeft het mogelijk gemaakt specifieke aminozuren belangrijk voor stabiliteit (bijvoorbeeld 8,9) of pigment coördinatie (bijvoorbeeld 10). Manipulatie van het opnieuw vouwen voorwaarden door het aanpassen van parameters zoals pigmentsamenstelling of reinigingsmiddelen zijn ook geïdentificeerd elementen critical voor juiste vouwing, zoals het vereiste van xanthofyllen de LHCII complex (bijvoorbeeld 1,11). Bovendien is onderzoek naar de eigenschappen van afzonderlijke pigmenten gebonden aan de complexen onmogelijk geweest met complexen gereconstitueerd in vivo (bijvoorbeeld 10). De hier beschreven methode begint met isolatie van pigmenten (chlorofylen en carotenoïden) uit spinazie en de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. De expressie en zuivering van een LHC eiwit van E. coli in de vorm van inclusielichamen wordt vervolgens beschreven, gevolgd door de reconstructie van LHC en daaropvolgende zuivering met Ni affiniteitskolom. In de laatste stap worden de bereide complexen verder gezuiverd door sucrose gradiënt centrifugatie om pigmenten en ongevouwen apoproteïne verwijderen. Dit protocol vormt een geoptimaliseerde procedure waarin verscheidene wijzigingen die door verschillende laboratoria dan hebben ingevoerdtijd 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cloth&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu;m poriën</td></tr><tr><td>Zachte schilderskwast voor kunstenaars&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Melkpoeders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>zie referentie 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>zie referentie 19</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstructie van licht-oogsten complexen van planten en groene algen

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In planten en groene algen, wordt licht opgevangen door de light-harvesting complexen (LHCs), een familie van integrale membraaneiwitten die chlorofyl en carotenoïden te coördineren. In vivo, worden deze eiwitten gevouwen met pigmenten om complexen die in de thylakoidmembraan worden ingevoegd vormen van de chloroplast. De hoge gelijkenis in de chemische en fysische eigenschappen van de leden van de familie, en het feit dat zij gemakkelijk pigmenten kunnen verliezen tijdens isolatie, maakt hun zuivering in een natieve toestand uitdagend. Een alternatieve benadering homogene preparaten van LHCs verkrijgen werd ontwikkeld door Plumley en Schmidt in 1987 1, die aantoonde dat het mogelijk was om deze complexen in vitro uitgaande van gezuiverde pigmenten en ongevouwen apoproteins reconstitueren, waardoor complexen met eigenschappen vergelijkbaar met die van natuurlijk complexen. Dit maakte de weg vrij voor het gebruik van bacteriële expressie gebrachte recombinante eiwitten in vitro </em&gt; reconstitutie. De reconstitutie werkwijze is krachtig om verschillende redenen: (1) zuivere preparaten van afzonderlijke complexen kan worden verkregen, (2) pigment samenstelling kan worden gecontroleerd om hun bijdrage beoordelen structuur en functie (3) recombinante proteïnen kunnen worden gemuteerd om de functionele studie rol van de afzonderlijke residuen (bijvoorbeeld pigment bindingsplaatsen) of eiwit domein (bijvoorbeeld eiwit-eiwit interactie, vouwen). Deze werkwijze is geoptimaliseerd in verschillende laboratoria en toegepast op het meeste licht-harvesting complexen. De hier beschreven protocol beschrijft de methode voor de reconstructie light-harvesting complexen in vitro momenteel gebruikt in ons laboratorium, en voorbeelden beschrijven toepassingen van de werkwijze voorzien.

Dit protocol beschrijft de reconstituurtie van licht-oogstcomplexen in vitro. Deze integrale membraaneiwitten coördineren chlorofylen en carotenoiden en zijn verantwoordelijk voor het oogsten van licht in hogere planten en groene algen.

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om in vitro lichtharkende pigment-eiwitcomplexen van planten of algen te reconstrueren. Dit wordt bereikt door de pigmenten uit spinazieblaadjes of algenculturen te extraheren en het APA-eiwit in E. coli over te produceren. Als tweede stap wordt het APA-eiwit gemengd met de pigmenten om een gereconstitueerd complex te verkrijgen.Vervolgens wordt het gereconstitueerde pigment-eiwitcomplex gezuiverd van de overtollige pigmenten en worden de resultaten van de ongevouwen eiwitten verkregen die vergelijkbare spectroscopische kenmerken van het gereconstitueerde pigment-eiwitcomplex en het native complex laten zien op basis van absorptiespectra, fluorescentiespectra en circulaire deïsm. Het grote voordeel van deze procedure is dat het ons in staat stelt een relatief grote hoeveelheid pigment-eiwitcomplexen te verkrijgen en ook om de complexen te manipuleren met behulp van gemuteerde type eiwitten en pigmentmengsels met verschillende samenstellingen, waardoor wordt aangetoond dat de procedure werkt. Alberto, een afstudeerstudent in het lab, begint met de procedure voor het extraheren van totaal pigment uit spinazieblaadjes. Gebruik een blender om een handvol spinazie, ongeveer 20 gram, in 100 milliliter koude maalbuffer gedurende 20 seconden te homogeniseren.Filter de oplossing door twee lagen nylondoek met een poriëndiameter van 20 micrometer en centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten bij 1.500 Gs. Bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg een milliliter koude wasbuffer toe.Resuspendeer het pellet met de chloroplasten met een zachte schilderskwast. Zodra het pellet is gesuspendeerd, voeg 50 milliliter wasbuffer toe en centrifugeer, een oplossing gedurende 10 minuten bij 10.000 Gs. Bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet voorzichtig in 50 milliliter wasbuffer, centrifugeer, een oplossing gedurende 10 minuten bij 10.000 Gs bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant vanaf dit punt volledig.Deze procedure moet in het donker worden uitgevoerd. Om pigmentoxidatie te voorkomen, voeg ongeveer 20 milliliter 80% aceton toe, gebufferd met natriumcarbonaat om de pigmenten te extraheren, laat de oplossing 10 minuten op ijs staan. Vorm de cellulaire componenten door centrifugatie bij 12.000 Gs gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Totale pigmentextractie zou moeten resulteren in een wit pellet. Verzamel de snat in een scheidingstrechter. Voeg 0,4 volumes dathylether toe.Schud krachtig en zorg ervoor dat u de kleppen opent om het gas te ontluchten. Voeg 0,8 volumes van punt 33 molaire natriumchloride toe en meng krachtig. Laat ongeveer 10 minuten wachten totdat de lagen zich scheiden.De etherfase bovenaan bevat de geëxtraheerde pigmenten. Verwijder en gooi de heldere onderste fase weg. Verwijder de ether door het vanaf de bovenkant van de scheidingstrechter in een geschikte glazen container te gieten.Laat de ether drogen door er een lepel korrelige watervrij natriumsulfaat aan toe te voegen. Draai de oplossing om en laat ongeveer vijf minuten wachten totdat het droogmiddel water uit de ether heeft geabsorbeerd. Wanneer de ether voldoende is gedroogd.Er zouden wat vrij zwevende kristallen moeten zijn en er mag geen klontering van het natriumsulfaat zijn. Decanteer de ether naar een nieuwe glazen container, laat het natriumsulfaat achter en verdeel de pigmenten in aliquoten en droog ze in een draaiende vacuümsnelheid tot het aceton volledig is verdampt. Bewaar de gedroogde pigmenten bij min 80 graden Celsius.De extractie van keratinoïde uit spinazie wordt in deze video niet getoond, maar de gedroogde pigmenten worden ook bewaard bij min 80 graden Celsius. Het lichtharkende complex of LHC voor reconstitutie werd tot expressie gebracht en gezuiverd uit E. coli in de vorm van inclusielichamen. Voor het succes van de reconstitutie is de verhouding tussen pigmenteiwitten en de hoeveelheid buffer die wordt gebruikt cruciaal.Deze procedure moet in zwak licht worden uitgevoerd. Resuspendeer 800 microgram LHC-inclusielichamen in een totaal van 400 microliters te. Voeg in een twee milliliter fugebuis 400 microliters van twee x reconstitutiebuffer toe en vortex.Voeg kort 0,6 microliter van een 14,8 molaire beta mar CAPTA ethanol stock toe. Om een ​​finale concentratie van 10 millimolair te verkrijgen, verwarm het eiwit gedurende één minuut bij 98 graden Celsius. Vortex kort en laat het drie minuten op kamertemperatuur staan.Resuspendeer 500 microgram totaal gedroogd chlorofylpigmenten, plus 80 microgram keratinoïde pigmenten in 30 microliters 100% ethanol door krachtig te vortexen. Gedurende één minuut. Spin het pigmentmengsel gedurende ongeveer 30 seconden bij 15.800 Gs bij vier graden Celsius en bevestig dat er geen pellet is onmiddellijk na het spinnen, voeg het pigmentmengsel langzaam toe aan het gekoelde eiwit terwijl u vortext.Wees voorzichtig om niet te krachtig te vortexen, aangezien het eiwit de bovenkant van de buis kan overstromen. Vorm gedurende vijf tot 10 seconden en plaats de buis vervolgens op nat ijs. Voeg 94 microliters van 20%octal, beta D glucocide of og toe om een ​​finale concentratie van 2% te verkrijgen. Vortex kort en houd het 10 minuten op ijs, voeg 90 microliters van twee molaire kaliumchloride toe om een ​​finale concentratie van 150 tot 200 micromolair te verkrijgen.Vorm kort en houd het 20 minuten op ijs. Spin gedurende 10 minuten bij 15.800 GS bij vier graden Celsius. Breng het SUP natant over naar een 10 milliliterbuis zonder het pellet te verstoren.Houd het natin koud en beschermd tegen licht. Begin met deze procedure door een een milliliter nikkel SROs-kolom voor te bereiden zoals beschreven in de protocoltekst. Voeg drie tot vier milliliter OG-buffer toe aan het eiwitmonster en laad het monster op de kolom.Spui de kolom uit met vijf milliliter OG-buffer, gevolgd door twee milliliter OG-spoelbuffer. Elueer het gebonden eiwit met drie milliliter elubuffer. Ver

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en high-throughput werkwijze voor het samenstellen in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten die is gebaseerd op water-in-olie-emulsies. We tonen de effectiviteit van de werkwijze voor de assemblage van natieve chlorofyl vier varianten van recombinant water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten (WSCPs) van Brassica planten tot expressie gebracht in E. coli.

Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol om te isoleren fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP) van diatomeeën en in liposomen met natuurlijke lipide composities aan het bestuderen van excitatie energieoverdracht op ion samenstelling veranderingen te integreren.

Isoleren en de integratie van licht-oogst antennes van Diatomee Cyclotella Meneghiniana in liposomen met thylakoïde lipiden

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Hier presenteren we een protocol om te scheiden van ontbindend thylakoïde complexen door Native groen gelelektroforese. Groene gel banden worden vervolgens gekenmerkt door tijd gecorreleerd Single Photon Counting (TCSPC) en basisstappen voor data-analyse worden verstrekt.

Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze autofluorescentiebeeldvorming en evaluatie van fycobiliproteïneveranderingen in rode algen op basis van spectrale analyse. Dit is een labelvrije en niet-destructieve methode om cellulaire aanpassing aan extreme habitats te evalueren, wanneer alleen schaars materiaal beschikbaar is en cellen langzaam of helemaal niet groeien onder laboratoriumomstandigheden.

Autofluorescentie beeldvorming om de fysiologie van rode algen te evalueren

Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische manipulatie van groene microalgen, Chlorella vulgaris

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Leer de in vitro-reconstitutie van licht-oogstende pigment-eiwitcomplexen uit spinazie en algen. Dit protocol toont extractie, expressie van APA-eiwit in E. coli en spectroscopische analyse voor fotosyntheseonderzoek.

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

Meer video's verkennen