Name: Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer cytosolische calciummetingen in renale epitheelcellen met flowcytometrie. Deze methode gebruikt fluorescerende kleurstoffen en trypsinisatie voor snelle analyse van calciumsignalering in cellulaire fysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in de laboratoria wordt gefinancierd door de Fritz-Bender Foundation, München, Duitsland (TD) en de Universiteit van Witten / Herdecke intern onderzoek subsidie ​​(tot W.-KL). We willen graag Prof Dr. Dr. Frank Thévenod bedanken (Instituut voor Fysiologie, Pathofysiologie en toxicologie, Universiteit van Witten / Herdecke) voor nuttige tips.

1. Bereiding van reagentia en oplossingen <ol><li> Bereid een gemodificeerde Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, zonder fenolrood). Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1,5 M CaCl2 en 2 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) (pH 7,2) voorraadoplossingen met gedestilleerd water. </li><li> Bereid een 250 mM voorraad oplossing van probenecide. Voor het vrije zuur (vaak aangeduid als water oplosbaar), ontbinden probenecide poeder in 1 N NaOH, vul tot driekwart van het uiteindelijke volume met gedestilleerd water en langzaam titreren tot pH 7,4 met 1 N HCl. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Los fluorescente membraan permeabel calcium bindende kleurstof in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) een voorraad concentratie van 1 mM. Bewaar bij -20 ° C in het donker. </li><li> Voorafgaand aan elk experiment vers bereid, bevattende probenecide HBSS flux (PHF) buffer door combineren gemodificeerd met HBSS (in uiteindelijke concentraties) 1,5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% foetaal runderserum, 2 mM probenecide en 5.55 mM glucose. Warm tot 37 ° C. </li></ol> 2. Celkweek <ol><li> Plaat 2,5 x 10 5 nier proximale tubulus cellen (WKPT-0293 Cl.2) per putje van een 6 well plaat of schaal van 35 mm in standaard kweekmedium en te groeien voor 2 dagen het bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 70%. </li></ol> 3. Calcium Dye Loading <ol><li> Voor elk putje of schaal, meng 1 ml kweekmedium dat 5% foetaal runderserum, 4 uM celpermeabel calciumbindende kleurstof en 2 mM probenecide. </li><li> Vervang het kweekmedium met 1 ml loading dye mengsel in elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Bedek de plaat met aluminiumfolie om het bleken van de fluorescerende indicator voorkomen. </li></ol> 4. Bereiding van CeLLS voor flowcytometrie <ol><li> Warm 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing 37 ° C. </li><li> Zuig calcium loading dye oplossing uit elk putje en voeg 1 ml trypsine langs de wand van de put. </li><li> Incubeer bij 37 ° C totdat alle cellen losgemaakt. </li><li> Overdracht cellen om een ​​1,5 ml buis en pellet door centrifugeren in een microcentrifuge bij 10.000 g gedurende 1 min. </li><li> Zuig het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren. </li><li> Was de cellen door toevoeging van 1 ml PHF buffer en resuspendeer door en neer te pipetteren. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 10.000 g gedurende 1 min. </li><li> Herhaal stap 4.6. en 4.7. nog twee keer. </li><li> Resuspendeer cellen in een eindvolume van 500 pl buffer PHF en gebruik de cellen voor experimenten binnen 1 uur. </li><li> Optioneel: Aantal cellen naar de cel concentratie te bepalen en te gebruiken 5 x 04-01 oktober x 10 5 cellen per meting. </li></ol> 5. Flow Cytometer Setup <ol><li> Start de flowcytometer, opent de fluïdica lade en draai de ventilatieklep tuimelschakelaar om de luchtdruk van de schede vloeistoftank verhogen. </li><li> &quot;Prime&quot; het instrument om potentiële wonende luchtbellen vanuit de binnenbanden en de stroom kamer te verwijderen. </li><li> In de flowcytometrie software, opent twee puntdiagram ramen. <ol><li> De eerste puntdiagram vereist voorwaartse strooilicht (FSC) voor de parameter X en zijkant diffuus licht (SSC) voor de parameter Y te controleren voor de kwaliteit van de cellen in het monster door respectievelijk grootte en granulariteit. </li><li> De tweede dot plot meet de fluorescentie-intensiteit van de calcium gebonden kleurstof. Selecteer de juiste fluorescentie detectie kanaal voor de parameter Y met behulp van een logaritmische schaal en tijd in seconden voor de parameter X op een lineaire schaal. </li></ol></li><li> Stel de snelheid in op &#39;high&#39;. </li></ol> 6. flowcytometrie Measurement <ol><li> Voer de metingen bij KT. In een flowcytometrie monsterbuis (11,5 x 75 mm), voeg 480 ul buffer PHF. </li><li> Voeg 20 ul celsuspensie en kort vortex te mengen. </li><li> Verplaats de tube draagarm aan de kant en plaats het monster buis over het injecteren van een monster buis totdat er een goede afdichting wordt gevormd. Zet de buis draagarm naar zijn oorspronkelijke positie gecentreerd. </li><li> Optimaliseren meting door aanpassing van de fluorescentie kanaal zodanig dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het monster op ongeveer 10 2 op de y-as. Slaan en te gebruiken voor verdere experimenten. </li><li> Om een ​​experiment te beginnen, herhaalt u de stappen 6,1-6,3. </li><li> Record basislijnfluorescentie 50 sec. </li><li> Pauze meting, verwijder het monster buis, voeg verbinding van interesse, vortex kort en terug te keren naar de monsterinjectie buis. Deze stap niet meer dan 15 seconden duren. </li><li> Hervat meting en gedurende een totaal van 204,8 sec. </li><li> Gebruik een calcium ionophore zoals ionomycine (10 uM) en een calcium chelator, zoals ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), MnCl2 of CoCl2 (2 mM), positieve en negatieve controles, respectievelijk. </li></ol> 7. Data Analyse <ol><li> Analyseren van gegevens met behulp van speciale flowcytometrie software voor offline analyse, zoals WinMDI (Windows Multiple Document Interface voor flowcytometrie), een gratis software pakket ontwikkeld door Joe Trotter bij het Scripps Institute, flowcytometrie Core Facility. </li><li> Open een dot plot met SSC en FSC parameters. </li><li> Selecteer de regio van cellen voor analyse met behulp van de &quot;Regio&quot; tool (klik met de rechtermuisknop op de afbeelding) om dode cellen of cel puin gevonden in de linker benedenhoek van de data-analyse (figuur 1) uit te sluiten. </li><li> Kwadrant analyse (figuur 2) <ol><li> Open een dichtheid perceel tijd op de x-as en fluorescentie-intensiteit op de y-as. Gebruik alle evenementen. </li><li> Onse dezelfde gating regio als in 7.3. </li><li> Kwantificeren van de data met behulp van de &quot;Quadrant&quot; tool. </li><li> Stel het kwadrant afscheiders zodat de verticale lijn wordt geplaatst ten tijde van verbinding toevoeging en de horizontale lijn in het middelpunt van de basislijn fluorescentie in de controles. Waarborgen dat de positionering van het kwadrant afscheiders gelijk in alle monsters. </li><li> Het percentage cellen in elk kwadrant wordt weergegeven in elke hoek (figuur 2). Vergelijk het kwadrant rechtsboven (UR) tussen de monsters. </li></ol></li><li> Histogram analyse (Figuur 3) <ol><li> Open de besturingsgegevens in een histogram raam met fluorescentie-intensiteit op de x-as en evenementen op de y-as. Gebruik alle evenementen. </li><li> Voor een picturaal overzicht, voeg de testgegevens te worden vergeleken met de controle plot als overlay percelen (ga naar Bestand → Open File → Archief → Overlay). </li><li> Voor kwantitatieve analyse enkele histogram winnendows worden gebruikt. Gate de celpopulatie met behulp van de regio R1 vanaf stap 7.3. </li><li> In de niet behandelde controle, gebruikt de markering functie (&quot;Markers&quot;) om het gebied voor ze vanuit het midden tussen de minimum en maximum fluorescentie van de controle piek en eindigt bij de maximale fluorescentie-intensiteit markeren. Het percentage cellen in dit gebied wordt berekend. </li><li> Ophalen gegevens uit de statistieken venster. Herhaal dit voor de overige data bestanden met dezelfde gemarkeerde gebied voor analyse. </li></ol></li><li> Fluorescentie-intensiteit analyse (Figuur 4) <ol><li> Open een puntenplot tijd op de x-as en fluorescentie-intensiteit op de y-as. Gebruik alle evenementen. </li><li> Enable &quot;Kinetics Mode&quot; en &quot;Overlay Kinetics Line&quot;. Een blauwe lijn verschijnt in de dot plot die de gemiddelde fluorescentie-intensiteit. </li><li> Kwantificeren van de relatieve instroom van calcium door het creëren van meerdere rechthoekige regio. Elke regio moet aw hebbenidth van ongeveer &quot;50&quot;, hetgeen overeenkomt met &quot;10 sec&quot;. Definieer tot 15 rechthoekige gebieden. </li><li> Ophalen kwantificering van de statistieken venster en kopieer in een spreadsheet. </li><li> Gebruik de y-gemiddelde gegevens voor analyse. Bereken het gemiddelde van R2 tot R6, wat overeenkomt met 20 tot 50 sec. Dit is de uitgangswaarde. </li><li> Kies een geschikte tijdsinterval voor calciuminflux analyse (afhankelijk van aanvang, de duur en intensiteit). </li><li> Bereken de calcium signalen van elk gebied binnen het tijdsinterval van het gemiddelde uitgangswaarde, dat wil zeggen, het fluorescentiesignaal voor verbinding toevoeging, die is ingesteld op 100%. Bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie van de regio&#39;s te posten verbinding toevoeging; Dit is de gemiddelde calcium signaal opgewekt door de verbinding. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+pumps+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger%2C+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li>
<li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li>
<li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM+proteins%3A+dynamic+calcium+signal+transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li>
<li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li>
<li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+and+pumps+in+cancer%3A+changes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li>
<li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+the+heart%3A+when+it%27s+good%2C+it%27s+very+very+good%2C+but+when+it%27s+bad%2C+it%27s+horrid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li>
<li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li>
<li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+immunopathology+research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li>
<li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li>
<li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+Ca2%2B+flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li>
<li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li>
<li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li>
<li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li>
<li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benemid%2C%27+p-%28di-n-propylsulfamyl%29-benzoic+acid%3B+its+renal+affinity+and+its+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li>
<li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li>
<li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations%2C+anions+and+zwitterions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li>
<li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+ATP-binding+cassette+%28ABC%29+transporter+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li>
<li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li>
<li>Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li>
<li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102(2010).</li>
<li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li>
<li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Calcium is een belangrijke gebeurtenis in verschillende cellulaire processen als een tweede boodschapper signaalmolecule en ook als een middel voor communicatie tussen de ER en mitochondria. Het vermogen om veranderingen in vrije cytosolische calciumconcentraties meten is een nuttige techniek die kan worden toegepast op alle gebieden van celbiologie. Er zijn verschillende methoden om cytosolische calcium signalen te detecteren. Klassiek, signalen van een ratiometrische calcium indicator, zoals Fura-2, worden bewaakt in ...

Calcium is een belangrijke tweede messenger verantwoordelijk voor de overdracht van cellulaire fysiologische en pathofysiologische signalen 1. Cytosolische calciumconcentraties worden door de activiteit van calcium pompen en uitwisselaars calcium laag gehouden. De sarcoplasmatisch / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA) vult het endoplasmatisch reticulum (ER) calcium opslag als onderdeel van een &quot;pomp lek&quot; systeem dat het plasmamembraan calcium ATPase (PMCA) extrudeert calcium aan het extracellulaire compartiment, zowel ATP-afhankelijke manieren 2. Fysiologische boodschappers, zoals hormonen of neurotransmitters, geven hun signalen via G-eiwit gekoppelde receptoren, activering van fosfolipase C, dat fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) in de plasmamembraan hydrolyseert om diacylglycerol en inositol-trifosfaat (IP3) 3 gegenereerd. Terwijl diacylglycerol blijft in de plasmamembraan, IP3 diffundeert in het cytosol en bindt aan IP3 receptors (IP3R), die ligand geactiveerde calciumkanalen in het ER membraan en calcium vrij uit het ER luminale winkel afgesloten met een toename van cytosolische calciumconcentraties 4. Een alternatieve route voor calcium naar het cytosol te bereiken is door calciumkanalen en warmtewisselaars in de plasmamembraan. Crosstalk tussen deze twee compartimenten zijn beschreven: calcium geïnduceerde calcium vrijstelling (CKP) waar extracellulair calcium induceert calcium vrijlating uit ER winkels 5, en op te slaan bediend calciumentryblokkade (SOCE) waar het legen van de ER-winkels wordt waargenomen door STIM en veroorzaakt opening van Orai calciumkanalen op het plasmamembraan naar hervullen van de ER winkels 6 promoten. Onder pathofysiologische omstandigheden, de cellulaire calcium respons gedereguleerd en cytosolische calcium verhogingen in afwezigheid van fysiologische stimulatoren 1. De calcium respons kan worden beïnvloed op een aantal manieren langdurige calciumsignaal vertraagd calcium verwijdering uit het cytosol, uitputting van calcium winkels of gelocaliseerde veranderingen in calcium. Bovendien de mitochondriën nemen een centrale rol in buffering en vrijgeven calcium 7. Langdurige en / of supramaximale cytosolische calcium verhoging leidt tot celdood. In feite, calcium meestal niet betrokken bij de cellulaire respons pathofysiologische en is een belangrijke gebeurtenis in een breed scala aan ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekte, hartziekte, kanker, botziekte en nierziekten, die voornamelijk worden geassocieerd met celdood en verlies of wijziging van orgaan of weefsel functie 8-10. Bovendien heeft verstoring van calciumsignalen gekoppeld aan cellulaire aanpassing en veranderingen in cellulaire functies en reacties. Traditioneel worden calcium gemeten signalen met een negatief geladen fluorescente calcium indicator die in cellen is geplaatst in een cel permeabele acetoxymethyl (AM) estervorm. Eenmaal gesplitst door cellulaire esterases, de fluorescente indicatoren blijven binnen het intracellulaire compartiment en de toename in fluorescentie-intensiteit als calcium gebonden. De meest bekende en gebruikte calcium indicator is de ratiometrische Fura-2 ontwikkeld door Roger Tsien en collega 11. Calcium indicatoren met verschillende affiniteiten voor calcium toe verschillende calcium zwembaden worden bewaakt. Detectiemethoden zijn live cell imaging, fluorescentie microplaataflezer en flowcytometrie. De relatief snelle kinetiek van calcium signalen (gewoonlijk binnen enkele seconden tot minuten) maakt beeldvorming van levende cellen de beste werkwijze voor het verkrijgen van de informatie over de kenmerken van de calcium signaal. Naast de snelle kinetiek van calciumsignalen (binnen milliseconden), live cell imaging is een betere methode voor het bestuderen van cellulaire compartimentering van calcium signalering binnen een enkele cel 12. Absolute calciumconcentraties kunnen worden berekend door de minimum en maximum van de fluorescentie calcium indicator door toevoeging van een calcium chelator en permeabiliserende de cellen, respectievelijk, zoals beschreven door Grynkiewicz et al. 11. Het gebruik van flowcytometrie calcium signalen te meten werd eerst ontwikkeld in de jaren 1980 in immunologische cellen waarin de mogelijkheid vele parameters, zoals membraan integriteit en gescheiden celpopulatie, en het vereiste van cellen in suspensie in combinatie met de ontwikkeling van enkele golflengte meten calcium indicatoren gemaakt flowcytometrie een ideale en convenientdetection methode 13-15. In hechtende cellen beeldvorming van levende cellen verschaft de informatie over calcium signalering, vooral de kinetiek, maar vereist een ingewikkelde installatie omvattende een fluorescentie microscoop, een perfusiesysteem, onderhoud van de cellulaire omgeving, zoals temperatuur, en gespecialiseerde software microscoop voor het verwerven en analyseren van gegevens. Alternatieve methoden zoals fluorescentie microplaat lezer of Pharmacological middel door het gebruik van calciumvangers zijn onvergelijkbaar qua opgedaan informatie. Flowcytometrie wordt op grotere schaal gebruikt cytosolische calcium in hechtende cellen volgen echter in de meeste studies slechts eindpunt metingen worden uitgevoerd. Volgens de methode oorspronkelijk ontwikkeld door Gergely et al. In immunologische B-cellen 16 zijn wijzigingen in cytosolische vrije calciumconcentratie door flowcytometrie met real-time kinetiek en monitoren van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen uit een monster populatie succes gemeten in kankercellen epitheelcellen en kanker stamcellen hybriden 17. Deze werkwijze werd verder aangepast voor gebruik in hechtende epitheelcellen die moeilijk te beladen met calcium indicatoren 18 zijn. Hier, met behulp van een onsterfelijk aanhanger epitheliale cellijn afgeleid van de S1-segment van de rat nier proximale tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 beschrijven we een geoptimaliseerde vereenvoudigd methode voor het meten van veranderingen in cytosolische calciumconcentratie door flowcytometrie. Aangezien veel epitheelcellen een aantal organische transporteurs voor anionische verbindingen bezitten, kan het laden van de cellen met een calcium indicator blijken te zijn een uitdaging. Om de uitstroom van calcium indicatoren, probenecide, de prototypische remmer van organische aniontransporters en oorspronkelijk ontwikkeld om de renale uitscheiding van penicilline 20 afnemen voorkomen, wordt gelijktijdig toegepast in de incubatie medium. De cellen worden gehandhaafd in monolagen op calcium indicator laden gebracht suspensie en calcium signalen direct na toevoeging verbinding gedetecteerd.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1241&nbsp;</td><td>Celpermeabel</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8761</td><td>Niet oplosbaar in water, oplossen in 1 N NaOH</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td><td>Joe Trotter, The Scripps Institute</td><td></td><td>Houd er rekening mee dat dit een oudere 16-bits applicatie is die FCS 2.0 compliant bestanden leest, maar FCS 3.0 digitale gegevens niet herkent.</td></tr><tr><td>WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar gesteld door Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &amp; Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)</td></tr></tbody></table>

cytosole calcium metingen in renal epitheelcellen door flowcytometrie

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Een verscheidenheid aan cellulaire processen, zowel fysiologisch als pathofysiologisch, vereisen calcium of worden erdoor bestuurd, waaronder exocytose, mitochondriale functie, celdood, celmetabolisme en celmigratie om er slechts enkele te noemen. Cytosolisch calcium wordt normaal gesproken op lage nanomolare concentraties gehandhaafd; eerder wordt het aangetroffen in hoge micromolare tot millimolare concentraties in het endoplasmatisch reticulum, mitochondriale matrix en het extracellulaire compartiment. Bij stimulatie dient een voorbijgaande toename van cytosolisch calcium als signaal voor downstream-gebeurtenissen. Het detecteren van veranderingen in cytosolisch calcium wordt normaal gesproken uitgevoerd met behulp van een live-celbeeldvormingsopstelling met calciumbindende kleurstoffen die een toename van de fluorescentie-intensiteit of een verschuiving in de emissiegolflengte bij calciumbinding vertonen. Een live-celbeeldvormingsopstelling is echter niet vrij toegankelijk voor alle onderzoekers. Alternatieve detectiemethoden zijn geoptimaliseerd voor immunologische cellen met flowcytometrie en voor niet-immuunologische aderente cellen met een fluorescentie microplaatlezer. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde, eenvoudige methode voor het detecteren van veranderingen in epitheliale cellen met flowcytometrie met behulp van een calciumbindende kleurstof met één golflengte. Adherente renale proximale tubulus-epitheelcellen, die normaal gesproken moeilijk te laden zijn met kleurstoffen, werden geladen met een fluorescerende, celpermeabele calciumbindende kleurstof in aanwezigheid van probenecide, in suspensie gebracht en calciumsignalen werden gemonitord voor en na toevoeging van thapsigargine, tunicamycine en ionomycine.

Om cytosolische calcium te verhogen, werden twee farmacologische verbindingen toegepast op renale proximale tubulus cellen (WKPT-0293 Cl.2) geladen met celpermeabel calcium binden kleurstof, Fluo-3-AM. Niet-behandelde controlemonsters werden beladen met calcium bindende kleurstof in aanwezigheid van probenecide en gemengd zonder toevoeging van verbindingen. Thapsigargine (TG) is een klassieke remmer van de SERCA pomp leidt tot lekkage van de ER en resulteert in een verhoogde cytosolische calcium. Tunicamycine (TUN) blok...

Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in cytosolisch calcium in renale epitheliale cellen te detecteren. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te laden met een fluorescerend calcium-responsief kleurmiddel in aanwezigheid van een aniontransporterremmer probit. De tweede stap is om de cellen in suspensie te brengen door middel van zachte trypsinisatie.Na centrifugatie werden de cellen gewassen in probit-bevattend HBSS-buffer. De laatste stap is het meten van door verbindingen geïnduceerde veranderingen met behulp van een flowcytometer. Uiteindelijk wordt flowcytometrie gebruikt om de kinetiek van veranderingen in cytosolisch calcium in renale epitheliale cellen te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals lifestyle-imaging, is dat het eenvoudig uit te voeren is en geschikt voor het screenen van verbindingen. Deze spier kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het gebied van intracellulair signaalverkeer door individuen in staat te stellen de rol van calcium in de context van fysiologische en pathofysiologische cellulaire signalering te onderzoeken. Het demonstreren van deze procedure zal Sylvia Kyle zijn, e

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel zal detail het protocol voor het meten van calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen met behulp van flow cytometrie.

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

This video describes a confocal microscopy imaging-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in cultured cells. The assay uses the calcium-sensitive fluorescent dye Rhod-2/AM to measure the mitochondrial calcium in permeabilized cultured cells.

Calcium Influx Assay to Measure Mitochondrial Calcium Uptake in Cultured Cells

Veranderingen in de intracellulaire calciumniveaus in de podocyten zijn een van de belangrijkste middelen om de filtratiefunctie van glomeruli te beheersen. Hier leggen we een high-throughput benadering uit die detectie van real-time calciumverwerking en activiteit van enkele ionkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli mogelijk maakt.

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER + voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K d meting en kalibratie wordt ook besproken.

Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Verstrekken van eencellige gevoeligheid, is real-time stroom cytometry uniek geschikt voor het kwantificeren van multimodale receptor functies van levende culturen. Met behulp van neurale volwassen voorlopercellen, de P2X7 receptor functie evalueerden via calcium toestroom gedetecteerd door calcium indicator kleurstof, transmembraan porie vorming door ethidium bromide opname en fagocytose met behulp van fluorescerende latex kralen.

Real-Time Live-cel Stroom Cytometry te onderzoeken Calcium toestroom, porie vorming en fagocytose door P2X7 receptoren in volwassen neurale voorlopercellen

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Levendcelbeeldvorming van calciumsignalering wordt uitgebreid gebruikt om calciummobilisatie te bestuderen in stabiele cellijnen die in monolagen zijn gekweekt. Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming van calciumsignalering in levende cellen met behulp van levende-celkleurstoffen op complex, primair weefsel, en maakt ook gebruik van machine learning-software om de fluorescentieintensiteit van duizenden individuele cellen gelijktijdig te kwantificeren, waardoor analyses worden...

Fluorescentie-gebaseerde calciumbeeldvorming in primaire epitelkweken van de menselijke luchtweg met behulp van geautomatiseerde celsegmentatie

Leer cytosolische calciummetingen in renale epitheelcellen met flowcytometrie. Deze methode gebruikt fluorescerende kleurstoffen en trypsinisatie voor snelle analyse van calciumsignalering in cellulaire fysiologie.

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

Meer video's verkennen