Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Het algemene doel van dit experiment is om een niet-cellulaire HLA IG-gebaseerde killer artificiële antigeen presenterende cel, of K-A-A-P-C voor de depletie van autoreactieve of ongewenste T-celpopulaties te genereren. Dit wordt bereikt door eerst covalente binding van HLA IG-moleculen en Antifa monoklonale antilichamen op celgrote ijzerdextran-deeltjes voor de generatie van de functionele K-A-A-P-C In de tweede stap worden de K-A-A-P-C gekarakteriseerd door middel van flowcytometrie om hun juiste functionaliteit te garanderen. Vervolgens worden de K-A-A-P-C geladen met verschillende peptiden van belang om de ongewenste antigeenspecifieke T-celpopulatie te targeten.

Uiteindelijk kan flowcytrische analyse worden uitgevoerd om de antigeenspecifieke anti-vet gemedieerde doding van de T-cellen door de cognate geladen K-A-A-P-C te meten. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het ontwikkelen van een op cellen gebaseerde killer antigeen presenterende cel terwijl we tegelijkertijd werkten aan de ontwikkeling van een beat-gebaseerde platform. Technologie voor immuuncel modulatie Om K-A-A-P-C te genereren, voegt u eerst 250 microliters epoxykralen van een voorraad en 250 microliters vers bereid boraatbuffer toe aan een steriele schroefdop glazen fles.

Plaats de fles op een magneet om de kralen na twee minuten te laten hechten, aspireer de buffer en verwijder de fles van de magneet. Was de kralen eenmaal met nog een milliliter bore eight buffer, en suspendeer ze vervolgens in 550 microliters van HLA A twee IG en anti-human CD 95 MAB. Schud de fles voorzichtig om de kralen met de antilichamen te mengen en incubeer vervolgens de kralen op een roterend apparaat kop over staart bij vier graden Celsius gedurende 24 uur.

De volgende dag centrifugeert u de kralen gedurende twee minuten bij 300 Gs en kamertemperatuur en plaatst u de fles terug op de magneet. Na twee minuten aspireert u de laadbuffer. Verwijder de fles van de magneet en was de kralen in een milliliter wasbuffer met voorzichtig schudden.

Na de derde wassing, roteer de fles in een milliliter verse kralenwasbuffer om eventuele resterende eiwitbindplaatsen te blokkeren. De volgende dag centrifugeert u de kralen opnieuw en plaatst u de fles terug op de magneet. Na twee minuten aspireert u de wasbuffer.

Verwijder de fles van de magneet en voeg een milliliter PBS toe aan de KAPC. Om de kwaliteit van de kralen te controleren, brengt u 1,5 keer 10 tot de vijfde van de K-A-A-P-C over in een faxbuis en wast u ze met een milliliter faxwasbuffer Resus. Suspendeer de kralenpellet in 100 microliters van de wasbuffer en voeg een microliter van anti-muis IgG een PE toe om de HLA A twee IG te detecteren en een microliter van anti-muis IG MFI TC om de anti-human CD 95 MAB te detecteren.

Na een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius, wast u de kralen in een milliliter faxwasbuffer Resus. Suspendeer ze in 250 microliters wasbuffer en lees de monsters op een flowcytometer voor peptidebelasting. Breng twee keer 10 tot de zevende van de K-A-A-P-C over in een nieuwe steriele glazen fles.

Nadat de kralen gedurende twee minuten op de magneet zijn geplaatst, aspireert u de PBS en suspendeert u de kralen in 500 microliters verse PBS met vijf microgram peptide. Label de fles met de datum en de naam van het geladen peptide, K-A-A-P-C. Bewaar vervolgens de geladen K-A-A-P-C gedurende ten minste drie dagen bij vier graden Celsius om voldoende peptidebelasting op de HLA A twee IG-dimer mogelijk te maken om A-K-A-A-P-C in vitro killing assay uit te voeren.

Was de peptide-geladen K-A-A-P-C zoals gedemonstreerd ten minste zes keer om alle vrije peptide te verwijderen. Breng vervolgens K-A-A-P-C en twee keer 10 tot de vijfde antigeenspecifieke T-cellen over naar één put per monster van een 96-wels ronde bodemplaat in 200 microliters co-cultuurmedium met een verhouding van één op één na 48 uur cultuur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng de monsters over naar de juiste overeenkomstige faxbuizen en was ze in een milliliter van een nexin vijf bindingsbuffer.

Resuspendeer vervolgens de pellets in 100 microliters van een nexin vijf bindingsbuffer, en incubeer vervolgens de monsters in een microliter van een nexin vijf FITC en vijf microliters van zeven a a d bij kamertemperatuur. Na 10 tot 15 minuten, was de monsters met een milliliter van een nexin vijf bindingsbuffer en resuspendeer de pellets in 250 microliters van een nin vijf bindingsbuffer. Lees vervolgens onmiddellijk de monsters op een flowcytometer.

K-A-A-P-C toont HLA A twee IG en Antifa MAB tegelijkertijd, wat in vergelijking met cel-gebaseerde benaderingen, niet wordt gewijzigd door codering of transductiëfficiënties en kan gemakkelijk worden gemoduleerd tijdens productie. K-A-A-P-C zijn in staat om antigeenspecifieke T-cellen in vitro te depeleren wanneer geladen met cognate peptide, terwijl niet-cognate geladen K-A-A-P-C geen T-cellen depeleren, dus K-A-A-P-C geïnduceerde T-cel apoptose op een antigeenspecifieke manier.

Vervolgens, wanneer K-A-A-P-C wordt gebruikt voor de selectieve depletie van antigeen-specifieke T-cellen uit een mengsel van verschillende T-cel specificiteiten, lekt minimale cytotoxiciteit naar naburige T-cellen. Dus, K-A-A-P-C vertegenwoordigen een uitmuntend hulpmiddel voor in vitro antigeen, antigeen-specifieke depletie van menselijke geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen met een potentiële klinische toepasbaarheid voor de behandeling van auto-immuunziekten en allotransplantaat afstotingen Na zijn ontwikkeling. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van cellulaire immunologie om nieuwe benaderingen te verkennen voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten en transplantaat afstotingen.