Name: Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer hoe je killer artificiële antigeen presenterende cellen (KaAPC) genereert voor de uitputting van antigeen-specifieke T-cellen in vitro. Deze methode biedt een gerichte aanpak voor celtherapie bij auto-immuunziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) en KFO 146 (MF), de DOD ministerie van Defensie subsidie ​​PC 040.972 (MO) en het National Institute of Health verleent RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 generatie van HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Bereid steriele boraatbuffer. Maak een 0,1 M oplossing van boorzuur in water en de pH op 7,0. Steriel filter (0,22 pm) buffer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid steriele kraal wasbuffer. Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder magnesium en calcium. Voeg humaan AB serum voor 3% uiteindelijke concentratie. Voeg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) voor 2 mM eindconcentratie. Voeg natriumazide (NaN 3) voor 0,01% uiteindelijke concentratie. Steriel filter (0,22 pm) buffer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Breng 250 pi epoxykralen (ongeveer 100 x 10 6 kralen) uit voorraad in een steriele glazen schroefdop flacon. </li><li> Voeg 250 pl boraatbuffer. </li><li> Zet glazen flacon op een magneet en laat kralen houden gedurende 2 minuten; aspireren buffer en verwijder glazen flacon van magneet. </li><li> Was parels eenmaal met 1 ml boraatbuffer. </li><li> Resuspendeer kralen in 550 ul van 0,018 g/ Ml HLA-A2-Ig en 3,64 ug / ml anti-humaan CD95 mAb (kloon CH11) en meng door schudden. (Zie de discussie sectie voor meer informatie.) </li><li> Incubeer glazen flacon op een rotator over de kop, bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Spin down kralen bij 300 g gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats glazen flacon op een magneet voor 2 min en zuig de &quot;KaAPC laden oplossing&quot;; verwijder glazen flacon van magneet, voeg 1 ml van de kraal wasbuffer en mengen zorgvuldig door te schudden. </li><li> Herhaal stap 1.10 tweemaal. </li><li> Incubeer glazen flacon op een rotator bij 4 ° C gedurende 24 uur in 1 ml kraal wasbuffer. Op dit moment worden alle resterende eiwit bindingsplaatsen geblokkeerd door humaan AB serum in de kraal wasbuffer. </li><li> Spin down kralen bij 300 g gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats glazen flacon op een magneet voor 2 min en zuig kraal wasbuffer; verwijder glazen flacon van magneet en vervang oplossing met 1 ml PBS. </li></ol> 2 Quality Control, Peptide Laden, Wverassing, opslag, en de stabiliteit van KaAPC <ol><li> Transfer 1.5 x 10 5 KaAPC in een FACS buis en wassen met 1 ml FACS wassen buffer. </li><li> Resuspendeer kralen in 100 ui FACS wasbuffer en voeg 1 pl anti-muizen IgG1 PE (voor detectie van het Fc gedeelte van het HLA-A2-Ig) en 1 pl anti-muis IgM FITC (kloon R6-60.2, voor detectie van de anti-humaan CD95 mAb). </li><li> Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C, wassen met 1 ml FACS wasbuffer en resuspendeer in 250 ul FACS wasbuffer en lees kleuring door flowcytometrie. </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 QC vlek van een KaAPC batch gemaakt zoals in het protocol. Kleuring werd uitgevoerd zoals in paragraaf 2 beschreven protocol HLA-A2-Ig werd gedetecteerd met een anti-muis-IgG1 PE mAb, terwijl anti-humaan-CD95 (anti-Fas) werd gedetecteerd met een anti-muis IgM-FITC mAb (zie protocol sectie 2.2) (blauwe lijn). Gevulde zwarte grafieken tonen lege korrels gekleurd met anti-muis-IgG1 PE mAb en anti-muis IgM-FITC mAb, respectievelijk. Nummers in de rechter bovenhoek geven de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <ol start="4"><li> Voor peptidebelading overdracht 20 x 10 6 KaAPC in een nieuwe steriele glazen flesje, leg op een magneet voor 2 min, aspireren PBS en resuspendeer kralen in 500 ul verse PBS met 5 ug peptide (Houd in gedachten, alleen HLA-A2 beperkte peptiden zal binden op het dimeer!). </li><li> WINKEL geladen KaAPC bij 4 ° C tot gebruik, gedurende ten minste 3 dagen voldoende peptide geladen op het HLA-A2-Ig dimeer mogelijk. </li><li> Onmiddellijk vóór gebruik wassen peptide geladen KaAPC zoals aangegeven in 1,14; Herhaal deze stap minimaal 6x. OPMERKING: Dit is een cruciale stap om ervoor te zorgen dat de vrije peptide heeft to volledig verwijderd vals positieve resultaten te vermijden doden; resterende vrije peptide werd aangetoond dat apoptose in antigeen-specifieke T cel cultures 9 induceren. Om uit te sluiten een oplosbaar peptide effect, lopen supernatant controlemonsters van peptide geladen en gewassen KaAPC (zie 3.8). </li><li> Count kralen met behulp van hemocytometer en label met datum, naam van de peptide en concentratie. OPMERKING: Geladen KaAPC functioneel blijven bij 4 ° C gedurende ten minste een maand. Na een maand, worden opnieuw geladen met hetzelfde peptide maakt KaAPC worden gebruikt voor maximaal een jaar. </li></ol> 3 KaAPC In Vitro Killing Assay <ol><li> Bereid co-cultuur media. Bereid compleet RPMI medium gesupplementeerd met 3% T cel groeifactor (in het lab 6) en 3% donor autoloog plasma. Als donor autoloog plasma beschikbaar is, gebruikt warmte geïnactiveerd humaan AB serum. </li><li> Bereid AnnexinV binding buffer voorbereiding. Los 8.12 g natriumchloride (NaCl) en 0,12 g calcium chloride (CaCl2) in 990 ml DDH 2 O.Add 10 ml 1 M HEPES buffer. </li><li> Genereer humaan antigeen-specifieke T-cellen. (Voor een gedetailleerd protocol zie een eerdere publicatie 7 gebruik te maken van kunstmatige antigeen presenterende cellen (AAPC)). Zorg ervoor dat peptide specificiteit ten minste&gt; 75%, zoals bepaald door tetrameer kleuring. </li><li> Voor elk monster incubeer 2 x 10 5 antigenspecifieke T-cellen / putje (in een 96 putjes ronde bodemplaat) in 200 pl co-kweekmedium bij een 1: 1 verhouding met KaAPC gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Harvest monsters en overbrengen naar een FACS buis; wassen met 1 ml AnnexinV bindingsbuffer gedeactiveerd bij 300 xg gedurende 5 min, gooi supernatant en resuspendeer in 100 ul bindingsbuffer AnnexinV </li><li> Stain monsters met 1 pl AnnexinV FITC en 5 ul 7-AAD voor 10-15 min bij KT, wassen met 1 ml AnnexinV binding buffer; spin down bij 300 g gedurende 5 minuten, supernatant een gooid resuspendeer in 250 ul AnnexinV binding buffer </li><li> Lees monsters direct op flowcytometer. </li><li> Bereid de volgende monsters antigeen-specifieke doding bepalen door KaAPC: voor T-cellen; T-cellen + oplosbaar anti-CD95; T-cellen + gelost KaAPC; T-cellen + niet-verwante peptide geladen KaAPC; T-cellen + verwant peptide geladen KaAPC; T-cellen + supernatant van verwante peptide geladen KaAPC. </li></ol><img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figuur 2 KaAPC killing assay Peptide geladen KaAPC of controlekorrels (HLA-A2-Ig alleen korrels) werden gekweekt gedurende 48 uur bij een 1: 1 verhouding met CMVpp65 specifieke T-cellen (~ 80%), geoogst en vervolgens gekleurd met AnnexinV en propidium jodide (PI) apoptose te bepalen door middel van flowcytometrie (zie protocol paragraaf 3.3-3.7). &quot;verwant&quot; verwijst naar beads geladen met CMVpp65 en &quot;niet-verwant&quot; zijnadvertenties geladen met Mart-1 peptide. Cijfers geven het percentage van levensvatbare T-cellen in het kwadrant linksonder van elk perceel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <ol start="9"><li> Om wirwar-experimenten, genereren antigeen-specifieke T-cellen van twee verschillende specificiteiten. </li><li> Verder antigeen-specifieke depletie-mogelijkheden van KaAPC evalueren een gelijktijdige analyse van de antigeen-specifieke eliminatie van T-cellen in T heterogene celpopulatie. (Voor een gedetailleerd protocol zie Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol><li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells%3A+the+synthetic+embodiment+of+a+%E2%80%9Cguided+missile%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+but+not+immature+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), At 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415</a> 5406-5413 (2003).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+by+Fas+ligand+%28FasL%2FCD95L%29-expressing+Killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li>
<li>Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li>
<li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Chiu, Y. -L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li>
<li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li>
</ol>

CS en MF hebben niets te onthullen. Onder een licentieovereenkomst tussen NexImmune en de Johns Hopkins University, Drs. Schneck en Oelke hebben recht om aandelen van royalty door de universiteit ontvangen op de verkoop van AAPC de producten die in dit artikel wordt beschreven. Ze bezitten ook NexImmune voorraad, die is onderworpen aan bepaalde beperkingen uit hoofde van de Universiteit beleid. Dr Schneck is lid van het bedrijf &quot;s Raad van Bestuur en de Scientific Advisory Board. De voorwaarden van deze regeling worden beheerd door de Johns Hopkins University in overeenstemming met haar beleid van belangenverstrengeling.

De meest cruciale stap in het protocol is de geschikte verhouding van signaal 1 (peptide MHC) signaal 2 (anti-Fas mAb) waarborgen. We hebben intensief titratie-experimenten uitgevoerd om de perfecte verhouding voor signaal 1 en 2 te definiëren; bleek dat minimale verschillen als gevolg van verschillen in de HLA-A2 Ig dimeer of anti-Fas mAb concentraties kan het functioneren van de KaAPC. Aldus is de concentratie van beide signalen moeten altijd gecontroleerd en kwaliteit van beide eiwitten moet regelmatig worden getest ook al werd besteld bij een commerciële bron. Bovendien moeten de concentraties altijd worden bepaald door dezelfde test als verschillende detectie-assays kan resulteren in verschillende concentraties. Functionaliteit van het HLA-A2-Ig kan worden belemmerd door onvolledige opnieuw vouwen en / of inefficiënte peptide geladen. Bovendien kan dimeer moleculen aggregeren in verschillende mate, die van invloed kunnen op de functionele activiteit van het eiwit. Daarom is de actual dimeer nodig voor het genereren van een functioneel en specifieke KaAPC kunnen variëren. Bovendien vonden we dat het geschikt bereik voor het doodinducerend signaal anti-Fas mAb op KaAPC bijzonder krap. In onze handen grotere hoeveelheden 3,64 ug / ml tot niet-specifieke doding van Fas positieve T-cellen tijdens bedragen dan 3,64 ug / ml resulteerde in een dosis-afhankelijk verminderde dodende activiteit. Hoewel deze condities lijken heel strak wordt aandacht deze gegevens resulteren in de vorming van een functioneel en specifieke KaAPC. Terwijl de huidige KaAPC fenotype werkt bij uitputting van geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen, eerste experimenten gericht op naïeve of rusten antigeen-specifieke T-cellen geen significante inductie van antigeen-specifieke apoptose als deze populaties Fas expressie verminderde. Daarom zou men voor ogen het toevoegen van een co-stimulerend signaal op de KaAPC om de up-regulatie van Fas op rustende T-cellen om te zetten hen ertoein een doelstelling voor de KaAPC. Hoewel dit mogelijk is alle drie de signalen zal moeten zorgvuldig worden getitreerd om een ​​functionele KaAPC fenotype zorgen. Aanpassen kraal platform een biocompatibele of biologisch afbreekbare matrix KaAPC verbeteren in vivo toepassing. Onlangs, Shen et al. Hebben gemeld succesvolle in vivo gebruik van KaAPC gebruik 5 urn latex beads geconjugeerd anti-Fas (Jo2 kloon) en anti-His / H2-K b -TRP2 11. We hebben kunnen aantonen dat het algemene concept van kunstmatige antigeen-presenterende cellen (AAPC) met succes kan worden overgedragen van micrometer bemeten nm deeltjes 12 en dat de functionaliteit wordt beïnvloed door deeltje geometrie 13 geweest. Aldus, door het variëren van de grootte en / of vorm van toekomstige KaAPC ontwerp zou men kunnen invloed hebben op de in vivo functionaliteit en bio-distributie, die essentieel voor een succesvolle behandeling van orgaanspecifieke autoimmuunziekten zijn. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC overwinnen van de grote tekortkomingen van cellen gebaseerde uitputting strategieën als een makkelijk te gebruiken &quot;van de plank&quot;, tijd en kosten efficiënte aanpak, die onafhankelijk is van de donor conditie en voorbehandeling. KaAPC zijn geen doelstellingen van zichzelf of paracrine doden signalering en niet gevoelig zijn voor cytolytische effector functies van CTL. KaAPC zal de identificatie van de desbetreffende ziekte antigeen nodig hebben en vertrouwen op hun specifieke HLA-type. Terwijl nog talrijke geschikte HLA-A2 beperkte antigenen van type 1 diabetes, zijn GvHD en multiples sclerose geïdentificeerd 2, ontwikkeling van aanvullende HLA klasse I moleculen dimeer en de voortdurende identificatie van nieuwe auto relevante antigenen verder verhogen en verbreden van de toepasbaarheid van KaAPC. Verder kan gedacht worden aan gebruik KaAPC tegen verschillende epitopen van meerdere antigenen tegelijkertijd richten. Samengevat, KaAPC vormen een flexibel platform technologie voortigen-specifieke T-cel depletie. Hun &quot;lego-achtige&quot; karakter maakt de opname van nieuwe signalen zoals aanvullende co-stimulerende of remmende signalen zoals PD1 of TRAIL op diverse matrices, die kunnen verbreden en versterken de daaropvolgende in vitro en in vivo toepassing. We presenteren hier de protocol stap voor stap KaAPC, de eerste parel gebaseerde benadering voor het voorkomen van antigeen-specifieke T-cellen van T cel mengsels met verschillende specificiteiten te genereren. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 KaAPC elimineren CTL in een antigeen-specifieke wijze PKH26-gemerkte Fas + geactiveerde effector-geheugen CTL en PKH67-gemerkte CMVpp65-specifieke CTL uit dezelfde donor werden gemengd in een 1:. 1 verhouding en co-gekweekt met CMVpp65 KaAPC gedurende 48 uur. Controle kweken werden behandeld met gelost KaAPC of 1 ug / mlvan oplosbare anti-Fas-mAb (kloon CH11). Minimaal verlies van levensvatbare cellen werd bepaald onbehandeld ongesorteerd CTL kweken (T mix). Originele FACS data voor elk CTL bevolking van de T mix worden getoond. Analyse van apoptose werd uitgevoerd zoals eerder door afzonderlijke gating gepubliceerd op beide T-celpopulaties 10. Getallen afgebeeld in de linker kwadrant vertegenwoordigt% van de totale cellen. De illustreren cijfer wordt verkregen ve representatief experiment uit drie onafhankelijke experimenten. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood. . Schütz, C. c.s. Killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen: een nieuwe strategie voor specifieke T-cellen te verwijderen Blood.. 2008; 111, 3546-52. Copyright van de American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

In de afgelopen twee decennia veel vooruitgang geboekt in het begrijpen van de pathogene mechanismen van auto-immuunziekten. Echter, de meest voorkomende behandelingen nog steeds afhankelijk corticosteroïden en immunosuppressiva zoals purine analogen, alkyleringsmiddelen en calcineurineremmers 1. Het gebruik van dergelijke geneesmiddelen is sterk verbeterd de prognose voor patiënten, maar de behandeling geeft geen genezing van de onderliggende immunologische defect. Veel patiënten kwetsbaar voor infecties en de ontwikkeling van kanker. Vandaar het uiteindelijke doel voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten en transplantaatafstoting is specifiek te richten enige ziekte veroorzaken T-cellen terwijl tegelijkertijd, waardoor het resterende immuunsysteem intacte en bevoegd immunologische aandoeningen te bestrijden. Gebruik makend van antigenpresenterende cellen (APC) als behandeling van perifere T-cel responsen onderdrukt werd eerst beschreven al1970 door verscheidene groepen. Sindsdien hebben vele cellen gebaseerde benaderingen ontwikkeld (beoordeeld in Schütz et al. 2). Strategieën door middel van-FasL uiten killer-APC als immunoregulatoire cellen toonde veelbelovende resultaten wijzen op therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van auto-immuniteit, allograftafstoting en chronische infecties. Er zijn echter belangrijke beperkingen met behulp van strategieën FasL Killer-APC die uiteindelijk beperkt de klinische toepasbaarheid; (I) productie of isolatie van APC tijd, arbeid en kostenintensief (ii) patiënten cytopenie gevolg van immunosuppressie bieden beperkte hoeveelheden en kwaliteit van cellen (iii) coating of transductie van APC apoptose inducerende signalen zoals FasL resultaten in sterk variabele fenotypes en (iv) Killer-APC zijn gevoelig voor effectorfuncties van T-cellen dus hun therapeutisch potentieel cytotoxische verminderen. Daarom is het moeilijk om een ​​gedefinieerde reproduceerbare Killer-APC feno garanderensoort die kan worden gebruikt voor antigeen-specifieke modulatie van T-cel responsen in vivo. Op basis van onze eerdere werk met FasL expressie Killer-APC 3-5 en kunstmatige antigeenpresenterende cellen (AAPC) 6,7 ontwikkelden we een kraal benadering (KaAPC) voor antigeen-specifieke remming of eliminatie van autoreactieve T-cellen in vitro. KaAPC bestaan ​​uit een HLA-A2-Ig dimeer (signaal 1) en een anti-Fas mAb (apoptose inducerende signaal) covalent geïmmobiliseerd op een oppervlak van een 4,5 urn paramagnetische latex bolletje. Ze afbrekende antigeen-specifieke T-cellen in een Fas / FasL gemedieerde wijze met T celkweken meerdere specificiteiten in een antigeen-specifieke wijze en onafhankelijk van de activering geïnduceerde celdood (AICD) pathway. Dosisafhankelijke apoptose in doelwit T-cellen snel geïnduceerd reeds na 30 min 8. KaAPC kan eenvoudig worden gegenereerd in een gecontroleerde manier te zorgen voor een bepaald uit de kast phenotype en overwinnen meeste van de tekortkomingen van celgebaseerde depletie strategieën. Bijgevolg KaAPC tonen groot potentieel voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten en transplantaatafstoting, bevorderen het gebied van T cel specifieke behandelingsstrategieën.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 epoxybeads</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1 magnet</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>Screw top glass vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95 (clone CH11)</td><td>Millipore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dimer</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG1 PE</td><td>BD/Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgM FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96-well Round bottom plate</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

killer artificial antigeen presenterende cellen (kaapc) voor efficient in vitro uitputting van human antigeen-specifieke t-cellen

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Voor behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten berust grotendeels over strategieën globale immunosuppressie, die op lange termijn gaat gepaard met nadelige bijwerkingen zoals een verminderd vermogen om infecties en maligniteiten regelen. Daarom moeten nieuwe benaderingen worden ontwikkeld dat alleen de ziekte mediëren doelcellen en laat de resterende immuunsysteem intact. In het afgelopen decennium verschillende celtherapie strategieën moduleren T cel gemedieerde immuun responsen ontwikkeld. De meeste van deze benaderingen afhankelijk tolerantie inducerend antigeen presenterende cellen (APC). Echter, naast het technisch moeilijk en omslachtig, zoals celgebaseerde benaderingen zijn zeer gevoelig voor cytotoxische T-cel responsen, die hun therapeutische capaciteit beperkt. Hier presenteren we een protocol voor het genereren van niet-cellulaire killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen (KaAPC), waardoor voor de uitputting van pathologische T-cellen terwijl de reresterende immuunsysteem onaangeroerd en functioneel. KaAPC een alternatieve oplossing voor cellulaire immunotherapie die potentieel voor het behandelen van auto-immuunziekten en allotransplantaatafstotingen door het reguleren van ongewenste T-cel responsen in een antigeen-specifieke wijze heeft.

Het gebruik van deze protocollen zijn gedefinieerd genereren van een KaAPC fenotype dat HLA-A2-Ig (signaal 1) en anti-Fas mAb (apoptose signaal) tegelijkertijd, die in vergelijking met cellen benaderingen niet veranderd door coating geeft of transductie efficacies en kan gemakkelijk gemoduleerd tijdens de productie (figuur 1). Bovendien KaAPC, zijn niet gevoelig voor cytotoxische effectorfuncties van T-cellen en hun functionaliteit niet afhankelijk van de kwaliteit van autologe antigeen presenterende cellen voor en na in vitro manipulatie. KaAPC kunnen aantasten van antigeen-specifieke T-cellen in vitro beladen met verwante peptide, terwijl niet-verwante geladen KaAPC niet T-cellen (figuur 2) afbreken. Daarom KaAPC induceren T cel apoptose in een antigeen-specifieke wijze. Vervolgens gebruikten we KaAPC voor selectieve depletie van antigeen-specifieke T-cellen uit een mengsel van verschillende T-cel specificities, waaruit blijkt dat slechts minimale cytotoxiciteit lekte in buur T-cellen (figuur 3). Aldus KaAPC vormen een uitstekende hulpmiddel voor in vitro antigeen-specifieke depletie van humane geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen met mogelijke klinische toepasbaarheid voor de behandeling van autoimmuunziekten en allotransplantaatafstotingen.

Richtlijnen gepresenteerd voor het genereren van killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen, KaAPC, een efficiënt hulpmiddel voor in vitro depletie van humane antigeen-specifieke T-cellen en een alternatieve oplossing voor cellulaire immunotherapie voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten in een antigen specifieke manier, zonder afbreuk te doen aan de resterende immuunsysteem.

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Het algemene doel van dit experiment is om een niet-cellulaire HLA IG-gebaseerde killer artificiële antigeen presenterende cel, of K-A-A-P-C voor de depletie van autoreactieve of ongewenste T-celpopulaties te genereren. Dit wordt bereikt door eerst covalente binding van HLA IG-moleculen en Antifa monoklonale antilichamen op celgrote ijzerdextran-deeltjes voor de generatie van de functionele K-A-A-P-C In de tweede stap worden de K-A-A-P-C gekarakteriseerd door middel van flowcytometrie om hun juiste functionaliteit te garanderen. Vervolgens worden de K-A-A-P-C geladen met verschillende peptiden van belang om de ongewenste antigeenspecifieke T-celpopulatie te targeten.Uiteindelijk kan flowcytrische analyse worden uitgevoerd om de antigeenspecifieke anti-vet gemedieerde doding van de T-cellen door de cognate geladen K-A-A-P-C te meten. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het ontwikkelen van een op cellen gebaseerde killer antigeen presenterende cel terwijl we tegelijkertijd werkten aan de ontwikkeling van een beat-gebaseerde platform. Technologie voor immuuncel modulatie Om K-A-A-P-C te genereren, voegt u eerst 250 microliters epoxykralen van een voorraad en 250 microliters vers bereid boraatbuffer toe aan een steriele schroefdop glazen fles.Plaats de fles op een magneet om de kralen na twee minuten te laten hechten, aspireer de buffer en verwijder de fles van de magneet. Was de kralen eenmaal met nog een milliliter bore eight buffer, en suspendeer ze vervolgens in 550 microliters van HLA A twee IG en anti-human CD 95 MAB. Schud de fles voorzichtig om de kralen met de antilichamen te mengen en incubeer vervolgens de kralen op een roterend apparaat kop over staart bij vier graden Celsius gedurende 24 uur.De volgende dag centrifugeert u de kralen gedurende twee minuten bij 300 Gs en kamertemperatuur en plaatst u de fles terug op de magneet. Na twee minuten aspireert u de laadbuffer. Verwijder de fles van de magneet en was de kralen in een milliliter wasbuffer met voorzichtig schudden.Na de derde wassing, roteer de fles in een milliliter verse kralenwasbuffer om eventuele resterende eiwitbindplaatsen te blokkeren. De volgende dag centrifugeert u de kralen opnieuw en plaatst u de fles terug op de magneet. Na twee minuten aspireert u de wasbuffer.Verwijder de fles van de magneet en voeg een milliliter PBS toe aan de KAPC. Om de kwaliteit van de kralen te controleren, brengt u 1,5 keer 10 tot de vijfde van de K-A-A-P-C over in een faxbuis en wast u ze met een milliliter faxwasbuffer Resus. Suspendeer de kralenpellet in 100 microliters van de wasbuffer en voeg een microliter van anti-muis IgG een PE toe om de HLA A twee IG te detecteren en een microliter van anti-muis IG MFI TC om de anti-human CD 95 MAB te detecteren.Na een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius, wast u de kralen in een milliliter faxwasbuffer Resus. Suspendeer ze in 250 microliters wasbuffer en lees de monsters op een flowcytometer voor peptidebelasting. Breng twee keer 10 tot de zevende van de K-A-A-P-C over in een nieuwe steriele glazen fles.Nadat de kralen gedurende twee minuten op de magneet zijn geplaatst, aspireert u de PBS en suspendeert u de kralen in 500 microliters verse PBS met vijf microgram peptide. Label de fles met de datum en de naam van het geladen peptide, K-A-A-P-C. Bewaar vervolgens de geladen K-A-A-P-C gedurende ten minste drie dagen bij vier graden Celsius om voldoende peptidebelasting op de HLA A twee IG-dimer mogelijk te maken om A-K-A-A-P-C in vitro killing assay uit te voeren.Was de peptide-geladen K-A-A-P-C zoals gedemonstreerd ten minste zes keer om alle vrije peptide te verwijderen. Breng vervolgens K-A-A-P-C en twee keer 10 tot de vijfde antigeenspecifieke T-cellen over naar één put per monster van een 96-wels ronde bodemplaat in 200 microliters co-cultuurmedium met een verhouding van één op één na 48 uur cultuur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng de monsters over naar de juiste overeenkomstige faxbuizen en was ze in een milliliter van een nexin vijf bindingsbuffer.Resuspendeer vervolgens de pellets in 100 microliters van een nexin vijf bindingsbuffer, en incubeer vervolgens de monsters in een microliter van een nexin vijf FITC en vijf microliters van zeven a a d bij kamertemperatuur. Na 10 tot 15 minuten, was de monsters met een milliliter van een nexin vijf bindingsbuffer en resuspendeer de pellets in 250 microliters van een nin vijf bindingsbuffer. Lees vervolgens onmiddellijk de monsters op een flowcytometer.K-A-A-P-C toont HLA A twee IG en Antifa MAB tegelijkertijd, wat in vergelijking met cel-gebaseerde benaderingen, niet wordt gewijzigd door codering of transductiëfficiënties en kan gemakkelijk worden gemoduleerd tijdens productie. K-A-A-P-C zijn in staat om antigeenspecifieke T-cellen in vitro te depeleren wanneer geladen met cognate peptide, terwijl niet-cognate geladen K-A-A-P-C geen T-cellen depeleren, dus K-A-A-P-C geïnduceerde T-cel apoptose op een antigeenspecifieke manier.Vervolgens, wanneer K-A-A-P-C wordt gebruikt voor de selectieve depletie van antigeen-specifieke T-cellen uit een mengsel van verschillende T-cel specificiteiten, lekt minimale cytotoxiciteit naar naburige T-cellen. Dus, K-A-A-P-C vertegenwoordigen een uitmuntend hulpmiddel voor in vitro antigeen, antigeen-specifieke depletie van menselijke geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen met een potentiële klinische toepasbaarheid voor de behandeling van auto-immuunziekten en allotransplantaat afstotingen Na zijn ontwikkeling. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van cellulaire immunologie om nieuwe benaderingen te verkennen voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten en transplantaat afstotingen.

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om allogeen-specifieke anergie induceren in humane perifere bloed mononucleaire cellen. De techniek kan klinisch worden toegepast op niet-alloreactieve donorcellen te genereren. Infusie van deze cellen zou kunnen verbeteren immuun reconstitutie en vermindering van toxiciteit na allogene hematopoietische stamceltransplantatie.

Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Hier beschrijven we een werkwijze voor het activeren en uitbreiden menselijke NKT cellen van bulk T-celpopulaties met kunstmatige antigen presenterende cellen (AAPC). Het gebruik van CD1d gebaseerde AAPC een gestandaardiseerde werkwijze voor het genereren van grote aantallen functionele NKT cellen.

Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

This video describes a protocol for isolating rare-antigen-specific CD8+ T cells using magnetic nanoparticle-based artificial antigen-presenting cells (aAPCs) functionalized with antigenic peptide-loaded MHC-Igs and anti-CD28 antibodies. Interaction of the aAPCs with CD8+ T cells specifically expressing the antigenic peptide-targeting T cell receptors, followed by their expansion in vitro, results in the enrichment and expansion of this CD8+ T cell population.

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

This video demonstrates a technique to manufacture chimeric antigen receptor (CAR) T cells ex vivo. Human T cells are incubated with magnetic beads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, along with a medium supplemented with interleukin-2 (IL-2), leading to T cell activation and proliferation. Transgenic lentiviral vectors are introduced, allowing the transgenic RNA to integrate into the host genome and express the transgene. This results in the transduced T cells expressing chimeric...

An Ex Vivo Technique to Manufacture Chimeric Antigen Receptor T Cells

This video demonstrates a technique for the ex vivo generation of tumor antigen-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells. Retroviral vectors carrying transgenic RNA are mixed with spleen cells in a medium supplemented with interleukin-2 to promote T-cell survival and proliferation. The mixture is then transferred to a plate coated with recombinant human fibronectin fragments and centrifuged to facilitate the fusion of the virus with the cell, allowing the RNA to integrate into the host...

An Ex Vivo Technique to Generate Tumor-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van...

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Leer hoe je killer artificiële antigeen presenterende cellen (KaAPC) genereert voor de uitputting van antigeen-specifieke T-cellen in vitro. Deze methode biedt een gerichte aanpak voor celtherapie bij auto-immuunziekten.

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen (Video) | JoVE Journal

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Meer video's verkennen