Name: Telomerase activiteit in de verschillende regios van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer een niet-radioactieve TRAP-assay voor het meten van telomerase-activiteit in verschillende hersengebieden van muizen. Deze methode toont geslachtsverschillen en biedt een tijd- en kostenefficiënt alternatief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door B.G. Negev-technologie en de bijdrage van Linda Powers.

Dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven in de Ben-Gurion Universiteit (IL-39-08-2010). 1 Mouse Brain Eiwitextractie <ol><li> Bereid 3 buisjes van 15 ml die elk 5 ml Ringer&#39;s oplossing en plaats buisjes op ijs. </li><li> Offer de muis met behulp van isofluraan anesthesie (LET OP - Gebruik van chemische kap) gedurende 10-20 sec gevolgd door cervicale dislocatie en onmiddellijke onthoofding. </li><li> Verwijder de hersenen uit de schedel en spoel een paar seconden met ijskoude Ringer&#39;s oplossing om schade aan het hersenweefsel voorkomen. </li><li> Met een chirurgisch mes, scheid de cerebellum (CR) en hersenstam (BS) van de frontale cortex. Vervolgens scheiden de kleine hersenen van de hersenstam en snijd de frontale kwab (FL) van de frontale cortex; verwijder het reukorgaan van de frontale kwab. Plaats de 3 gebieden van de hersenen in de aangewezen 15 ml buizen. </li><li> Homogeniseer het weefsel in elke buis. Fr toevoegenoplossing ESH ijskoud Ringer&#39;s zodat elke buis bevat hetzelfde volume en centrifugeer gedurende 7 min bij 800 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 100 pl CHAPS lysis buffer aan elke buis. Meng goed door de oplossing enkele malen (~ 10) door een 1 ml spuit met een 21 G naald en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Breng de inhoud van elke buis in nieuw micro-centrifugebuis en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 13.000 x g. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe micro-centrifugebuis en bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van een eerder vastgestelde methode. Bewaar de eiwitextracten in aliquots van 10 pi bij -80 ° C. </li></ol> 2 TRAP Assay Voorbereiding van instrumenten, Reaction Solutions, en Protein Verwatering Berekeningen <ol><li> Bereid juiste aantal gelabelde micro-centrifuge buizen voor proteïne-extract verdunningen en telomerase reactie buffer. Voer alle pipetteren in het protocol met behulp van filter tips om besmetting te voorkomen. </li&gt; <li> Ontdooi de volgende oplossingen op het ijs: TRAP reactie mix 10x, TS primer, dNTP&#39;s, UPW en proteïne-extracten (zie tabel van materialen voor reagentia en reagentia concentraties). </li><li> Verdun de oplossing van het eiwit extract tot een eindconcentratie van 1 ug / ul met ultrazuiver water (UPW). </li></ol> 3 Telomerase Reaction <ol><li> Bereid telomerase reactiemengsel door toevoeging van de volgende opties om een ​​micro-centrifugebuis: 2 pi TRAP mix (10x), 1 ui TS primer (0,1 ug), 1 ui dNTPs (10 mm) en 15 ul UPW. Voor meerdere monsters, vermenigvuldig bovengenoemde volumes door het aantal monsters, plus 1. </li><li> Voeg 19 ul van het reactiemengsel aan elke reageerbuis en voeg 1 pl van het verdunde proteïne extract (1 ug eiwit) aan elke buis voor een eindvolume van 20 pi. </li><li> Plaats de reageerbuisjes in een 30 ° C voorverwarmd waterbad gedurende 45 minuten. </li></ol> 4. PCR Reaction <ol><li> Vijftien min voor het einde van de telomerase reactie ontdooien de volgende oplossingen: ACX primer, Titanium Taq buffer, UPW. </li><li> Bereid PCR reactie mix door het toevoegen van de volgende opties om een ​​micro-centrifuge buis: 2,5 ul Titanium Taq Buffer (10x), 1 ui ACX primer (0,1 ug), 2 pi UPW (1 pi bij IC wordt gebruikt) en 0,5 ul Titanium Taq Polymerase (50x). Voor meerdere monsters, vermenigvuldig bovengenoemde volumes door het aantal monsters plus 2. </li><li> Voeg 6 ul van de PCR-mix elke PCR-buis en voeg het gehele volume van de telomerase reactiemengsel (20 pi) aan elke buis voor een eindvolume van 26 pi. </li><li> Plaats de PCR-buisjes om een ​​PCR thermo fietser en start het volgende programma: - 90 ° C - 2 min. - 94 ° C -. 30 sec * - 60 ° C -. 30 sec * - 72 ° C -. 45 sec * - 72 ° C - 2 min. WINKEL PCR producten bij -20 ° C. * = 34 cycli </li></ol> 5. Agarose Mini-gel Voorbereiding, Monsters Hardlopen, en gelkleuring <ol><li> Voeg 25 ml gekoelde elektroforese buffer (TBE) en een roerstaaf in een bekerglas dat 2-4 maal het volume van de bufferoplossing en langzaam strooi 1,125 g van de hoge-resolutie (HR) agarose poeder terwijl de oplossing snel geroerd . Verwijder het roerstaafje, dek het bekerglas af met een plastic folie en prik in een klein gaatje voor de ventilatie. Verhit de beker in de magnetron op &quot;Low&quot; stroom voor 3 min en dan overschakelen op &quot;Hoog&quot; kracht en verwarm de oplossing in korte pulsen met zorg niet te leiden tot morsen. Merk op dat wanneer het schuim door verhitting wordt grote bellen en verdwijnt na een paar seconden, de agarose klaar. </li><li> Zet de gel een horizontale mini-gel apparaat, nadat de gel stolt bij kamertemperatuur zodat de gel te koelen gedurende 20 minuten bij 4 ° C vóór gebruik. </li><li> Laad elke baan met 25 ul van TRAP monster (20 ul TRAP PCR-producten en 5 ul 6x gel-loading dye) en lopen op 110 V gedurende 3 uur in een 4 ° C koude kamer. </li><li> Bereid nucleïnezuur vlek 3x werkende oplossing door het toevoegen van 15 pi 10,000x nucleïnezuur vlek, stock oplossing tot 50 ml dubbel gedestilleerd water (DDW) met 0,1 M NaCl (0,29 g). Vlekken op de gel gedurende 20 minuten onder voorzichtig schudden. </li><li> Gebruik UV transilluminator met 302 nm golflengte aan de TRAP ladder DNA-banden te bekijken. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Analyse van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen via de TRAP assay bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) proteïnen extractie uit specifieke gebieden van het hersenweefsel 2) TS primerverlenging door telomerase - telomerase reactie 3) amplificatie van het telomerase reactieproducten door PCR 4 ) scheiding van de PCR producten met behulp van hoge resolutie agarose gel. Deze gemodificeerde TRAP assay worden twee belangrijke problemen die ontstaan ​​uit de traditionele assay: het gebr...

Telomerase is een ribonucleoproteïne uit telomerase reverse transcriptase (TERT), de katalytische subeenheid van telomerase, en een RNA component (TERC). De canonieke rol van telomerase is de juiste lengte van de telomeren behouden door toevoeging van repetitieve sequenties (TTAGGG) de telomere eindigt derhalve bevordering genomische integriteit en celproliferatie 1. Aanvullende functies werden toegeschreven aan TERT in cellen, dwz resistentie tegen apoptose geïnduceerd door verschillende beschadigende middel 2 verleent beschermt menselijke mesenchymale stamcellen uit oxidatieve stress 3, en speelt een pro-survival rol in volledig gedifferentieerde neuronen door deelneming aan positieve RNA TIA1 granules 4. TERT- wordt uitgedrukt en zich hoofdzakelijk bezighield met somatische delende cellen en in de meeste vormen van kanker, terwijl het enzym expressie en activiteit niveaus strak zijn geregeld in niet-delende cellen 5,6. Studies hebben aangetoond dat in de rOdent hersenen, telomerase-activiteit niet herkend door postnatale dag 10, terwijl TERT mRNA wordt op lagere niveaus in de volwassenheid 7. Andere studies toonden telomerase activiteit in de volwassen sub-ventriculaire zone, de bulbus olfactorius, de hippocampus en in de volwassen cortex en cerebellum 8. We hebben onlangs aangetoond dat nieuwe verbindingen die telomerase expressie en activiteit te verhogen in de hersenen en ruggenmerg uitgeoefend neuroprotectieve effecten in N-methyl-D-aspartaat (NMDA) - geïnjecteerde muizen vertraagde het ontstaan ​​en de progressie van amyotrofische laterale sclerose ziekte in SOD1 transgene muizen en verhoogde de overleving van motorische neuronen in het ruggenmerg van deze muizen 9. Om volledig de pro-survival rol van telomerase in neuronen en in de hersenen, is het essentieel om een ​​eenvoudige en relatief gevoelig snelle test voor het detecteren van telomerase-activiteit in de verschillende gebieden van de hersenen ontwikkelen. De telomeer rEPEAT amplificatie protocol (TRAP) is een bekende gevoelige test combineert de canonieke activiteit van telomerase en de polymerase kettingreactie (PCR). In deze assay, telomerase voegt TTAGGG herhaalt een telomerase substraat (TS primer) oligonucleotide, gevolgd door PCR-amplificatie waarbij 6 baseparen (bp) DNA-ladder met de TS reverse primer genereert -. ACX 32P gemerkte dCTP worden gebruikt om te detecteren lage hoeveelheid PCR producten. De DNA ladder wordt opgelost door sequentiebepaling polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Zowel de intensiteit van de DNA-banden en de lengte van de DNA ladder weerspiegelen de hoeveelheid actief enzym moleculen en hun processivity respectievelijk 10. Dit traditionele test houdt een aantal grote problemen: Het gevaar van blootstelling aan radioactieve stoffen, grote en moeilijk te sequencing PAGE en de tijd het verbruik van de gel lopen en blootstelling van het radioactieve product film verwerken (&#39;s nachts in beide gevallen). </p&gt; Dit protocol biedt een verbeterde niet-radioactieve agarose mini-gel gebaseerde bepaling. De DNA 6 bp ladder wordt opgelost met 4,5% hoge-resolutie agarose gel en de detectie wordt bereikt met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek. De combinatie van het gebruik van hoge resolutie agarose mini-gel en gevoelige nucleïnezuur kleuring biedt eenvoudig te hanteren assay, wordt voorkomen van blootstelling aan radioactiviteit en aanzienlijk verkort overall duration assay van 3 dagen tot enkele uren.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Handmatig gemaakt, meng het volgende in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (verkocht door Sigma). Aliquots worden ingevroren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Ringer's oplossing</td><td></td><td></td><td>Handmatig gemaakt, meng het volgende in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4&middot;H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glucose watervrij.</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Zorgvuldig hanteren in een chemische kap</td></tr><tr><td>dNTP's (10 mM)</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligo's besteld in DRY-formaat en UPW toegevoegd volgens vereiste concentratie</td></tr><tr><td>ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligo's besteld in DRY-formaat en UPW toegevoegd volgens vereiste concentratie</td></tr><tr><td>Titanium Taq Polymerase/Buffer</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>High Resolution agarose</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Elke hoogwaardige hoog-resolutie agarose kan geschikt zijn</td></tr><tr><td>Mini-gel apparaat</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic Acid Stain (GEL-RED)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligo's besteld in DRY-formaat en UPW toegevoegd volgens vereiste concentratie</td></tr><tr><td>CHAPS lysis buffer</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9852S</td><td>Voeg PMSF (proteaseremmer) toe tot een eindconcentratie van 1 mM</td></tr><tr><td>Ultra Pure Water (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 muizen</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: non-radioactive telomerase herhaal amplification protocol (trap) assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, een ribonucleoproteïne, is verantwoordelijk voor het handhaven van de telomeerlengte en daarmee het bevorderen van genomische integriteit, proliferatie, en levensduur. Bovendien telomerase beschermt de mitochondriën tegen oxidatieve stress en resistentie tegen apoptose, suggereert de mogelijke betekenis voor de overlevende van niet-mitotische, zeer actieve cellen zoals neuronen. We hebben eerder werd aangetoond dat telomerase nieuwe activatoren telomerase activiteit en expressie in de verschillende muizen hersengebieden verhogen en motorische neuronen cellen tegen oxidatieve stress. Deze resultaten versterken het idee dat telomerase is betrokken bij de bescherming van neuronen uit verschillende letsels. Om de rol van telomerase in de hersenen onderstrepen we hier vergelijken de activiteit van telomerase in mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen en de afhankelijkheid van de leeftijd. TRAP assay is een standaard methode voor het detecteren van telomerase-activiteit in verschillende weefsels of cellijnen. Hier laten we de analysis van telomerase-activiteit in drie gebieden van de hersenen van muizen door niet-denaturerende eiwit extractie middels CHAPS lysis buffer gevolgd door modificatie van de standaard TRAP assay. In deze 2 stappen assay endogene telomerase verlengt specifieke telomerase substraat (TS primer) door toevoeging van TTAGGG 6 bp herhalingen (telomerase reactie). De telomerase reactieproducten worden versterkt door PCR-reactie het creëren van een DNA-ladder van stappen 6 bp. De analyse van de DNA ladder wordt door 4,5% hoge resolutie agarose gelelektroforese gevolgd door kleuring met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek. Vergeleken met de traditionele TRAP assay die gebruik 32 P gemerkt radioactief dCTP voor DNA detectie en polyacrylamide gelelektroforese oplossing van het DNA ladder Dit protocol biedt niet giftige tijdbesparende TRAP-assay voor het evalueren van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen, tonen de mogelijkheid om detecteren verschillen in telomerase activiteit in de verschillende vrouwelijke en mannelijke regio muizenhersenen.

Hele cellen eiwitextracten werden bereid uit de frontale kwab (FL), hersenstam (BS) en cerebellum (CR), verkregen uit 3 CD-1 vrouwelijke en 3 mannelijke CD-1-muizen op de leeftijd van 1 en 3 maanden voor de gewijzigde TRAP assay en 3 CD-1 mannelijke muizen op de leeftijd van 2 maanden oud voor de radioactieve TRAP assay. Telomerase-activiteit werd gedetecteerd in 1 ug eiwit extract met behulp van de gemodificeerde TRAP-test en 2 pg eiwitten te extraheren voor de radioactieve TRAP assay. Detectie van telomerase-activitei...

Telomerase wordt tot expressie gebracht in de neonatale hersenen en ook in verschillende regio's van de volwassen hersenen. We presenteren een niet-toxische, tijdbesparende TRAP-assay voor de analyse van telomerase-activiteit in verschillende regio's van de muizenhersenen en voor het detecteren van verschillen in telomerase-activiteit tussen mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen.

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Het algemene doel van deze procedure is om de telomerase-activiteit in normaal hersenweefsel te meten. Dit wordt bereikt door eerst hele cel-eiwitextracten uit verschillende hersenweefsels voor te bereiden als bron voor een actief telomerase-enzym. De tweede stap is om gelijke hoeveelheden van de eiwitextracten toe te voegen aan een specifiek telomerase-reactiemengsel dat het substraat en de nucleotiden bevat die nodig zijn voor de telomerase-activiteit.Vervolgens worden de telomerase-reactieproducten versterkt door PCR en geanalyseerd door hoge resolutie aros-gelelektroforese. De laatste stap is om de versterkte telomerase-reactieproducten te visualiseren door het aros-gel te kleuren met een zeer gevoelige DNA-kleuringsmiddel. Uiteindelijk resulteert dit thoma-straal's herhaalde amplificatieprotocoltest uit zes basenpaar increment, DNA-ladders equivalent aan thoma-straal's activiteit in verschillende hersenweefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals een radioactieve valtest of commerciële valtestkits, is dat dit protocol een relatief tijd- en kostenefficiënte alternatief biedt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de activiteit in hersenweefsel, kan deze ook worden toegepast op elk ander levend weefsel of celkweek. Bereid voor het starten van deze procedure drie 15 milliliter buizen, elk met vijf milliliter ringeroplossing. Plaats de buizen op ijs na het verwijderen van de hersenen uit een geëuthanaseerd muis.Spuit de hersenen een paar seconden met ijskoude ringeroplossing om schade aan het hersenweefsel te voorkomen. Gebruik een chirurgisch mes om het cerebellum en de hersenstam te scheiden van de frontale cortex. Scheid vervolgens het cerebellum van de hersenstam.Verwijder de reukbol uit de frontale kwab en snijd de frontale kwab los van de frontale cortex. Plaats de drie hersengebieden in de aangewezen 15 milliliter buizen, homogeniseer het weefsel in elke buis. Voeg vervolgens vers ijskoud ringeroplossing toe zodat elke buis hetzelfde volume bevat en centrifugeer gedurende zeven minuten bij 800 keer G, verwijder het supernatant en voeg 100 microliters chap-schijfjes toe.Buffer toe aan elke buis. Meng goed door de oplossing ongeveer 10 keer door een enkele milliliter spuit met een 21 gauge naald te laten lopen, incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Na 30 minuten breng de inhoud van elke buis over in een nieuwe microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende 30 minuten.Bij 13.000 keer G, breng de supranaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Na het bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van een eerder gevestigde methode, bewaar de eiwitextracten in aliquots van 10 microliter bij min 80 graden Celsius. Begin dit deel van het protocol door het juiste aantal gelabelde microcentrifugebuizen voor de eiwitextractverdunningen en de telomerase-reactiebuffer voor de volgende oplossingen op ijs voor te bereiden.10 x valreactiemix DS-primer dn tps, ultrapuur water en eiwitextracten verdunnen de oplossing van het eiwitextract tot een eindconcentratie van één microgram per microliter. Gebruik ultrapuur water en voer alle pipetteren uit met behulp van filtertips om besmetting of de telomeerreactie te voorkomen. Elke steekproef vereist een telomeerreactiemix die bestaat uit twee microliter valmix, één microliter TS-primer, één microliter DN NTPs en 15 microliters ultrapuur water voor meerdere steekproeven.Vermenigvuldig deze volumes met het aantal steekproeven plus één, voeg 19 microliters van de MASE-reactiemix toe aan elke reactiebuis, gevolgd door één microliter van het verdunde eiwitextract. Voor een eindvolume van 20 microliters, plaats de reactiebuizen in een met 30 graden Celsius voorverwarmd waterbad gedurende 45 minuten. 15 minuten voor het einde van de valreactie, bereid voor op de amplificatie van de valreactieproducten door de volgende oplossingen te hebben, een CX-primer, titanium tack-buffer en ultrapuur water.Elke steekproef vereist een PCR-reactiemix bestaande uit 2,5 microliters titanium tech-buffer, één microliter CX-primer, twee microliters ultrapuur water en 0,5 microliters titanium tech-polymerase voor meerdere steekproeven. Vermenigvuldig deze volumes met het aantal steekproeven plus twee. Voeg zes microliters van de PCR-reactiemix toe aan elke PCR-buis en voeg het volledige volume met de mase-reactie toe aan elke buis.Voor een eindvolume van 26 microliters, plaats de PCR-buizen in een PCR-thermocycler en voer het volgende programma uit, 90 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door 34 cycli van 94 graden Celsius gedurende 30 seconden. 60 graden Celsius gedurende 30 seconden en 72 graden Celsius gedurende 45 seconden. En een laatste twee minuten bij 72 graden Celsius.Wanneer de PCR-reactie voltooid is, bewaar de PCR-producten bij min 20 graden Celsius. Om de eigelrozen voor het gieten van de minigel voor te bereiden, voegt u eerst 25 milliliter gekoelde TBE-elektroforesebuffer en een roerstaaf toe aan een beker die twee tot vier keer het volume van de bufferoplossing is en begin met roeren. Roer vervolgens langzaam 1,125 gram van de hoogwaardige aros-poeder in.Terwijl de oplossing snel roert, verwijdert u de sterrenstaaf. Bedek de beker met plasticfolie en prik een klein gaatje voor ventilatie. Wanneer u de agros raakt, is het van cruciaal belang om het kookpunt te bereiken om de agros volledig op te lossen.Let goed op de beker in de magnetron om ervoor te zorgen dat het gegenereerde schuim niet overloopt. Verwarm de beker in de magnetron op laag vermogen gedurende drie minuten, schakel daarna over op hoog vermogen en verwarm de oplossing in korte pulsen met de nodige voorzichtigheid om morsen te voorkomen. Giet het gel in een horizontaal minigelapparaat en laat het bij kamertemperatuur stollen. Nadat het gel is gestold, laat het gel gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius staan.Voor gebruik voor elektroforese, laadt u elke laan met

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode wordt beschreven dat beoordeelt lengte van telomeren in meerdere weefsels en diersoorten met behulp van qRT-PCR. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.

Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Telomeren en telomerase spelen essentiële rollen bij veroudering en tumorigenese. Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe je twee muis-induceerbare telomerase knock-in allelen kunt genereren en hoe je ze kunt gebruiken in de studies van weefseldegeneratie/regeneratie en kanker.

Gebruik makend van Muriene Induceerbaar Telomerase Allelen in de Studies van weefseldegeneratie / Regeneration en Kanker

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) synthetiseert niet alleen Telomere DNA, maar ook double-stranded RNA door RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit. Hier beschrijven we een nieuw opgerichte assay voor het detecteren van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van endogene TERT.

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een levensvatbare vrouwelijke muizenmodel met niet-Random X-chromosoom inactivatie, dat wil zeggen, de moederlijke erfelijke X-chromosoom is inactief in 100% van de cellen. We beschrijven ook een protocol om de haalbaarheid, tolerantie, en de veiligheid van farmacologische reactivering van het inactieve X-chromosoom in vivo te testen.

Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

We hebben met succes omgezet de standaard Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) assay te worden gebruikt in druppel digitale polymerase chain reacties. Deze nieuwe Assay, genaamd ddTRAP, is gevoeliger en kwantitatieve, waardoor een betere opsporing en statistische analyse van telomerase activiteit binnen verschillende menselijke cellen.

Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Leer een niet-radioactieve TRAP-assay voor het meten van telomerase-activiteit in verschillende hersengebieden van muizen. Deze methode toont geslachtsverschillen en biedt een tijd- en kostenefficiënt alternatief.

Telomerase activiteit in de verschillende regios van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay (Video) | JoVE Journal

Telomerase activiteit in de verschillende regio's van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Meer video's verkennen