Benutting van microschaal Silicon Cantilevers to Cellular contractiele functie Beoordelen In Vitro
3 oktober 2014
Dit protocol beschrijft het gebruik van microschaal silicium consoles als buigzaam cultuur oppervlakken voor het meten van de contractiliteit van spiercellen in vitro. Cellular samentrekking cantilever buigen, die kan worden gemeten, geregistreerd en omgezet in uitlezingen van kracht, die een non-invasieve en schaalbaar systeem voor het meten contractiele functie in vitro.
Het doel van het volgende experiment is om de contractiele activiteit van gekweekte spiervezels te meten in reactie op stimulatie in een gecontroleerde in vitro omgeving. Dit wordt bereikt door gedissocieerde spiercellen op microschaal silicium cantilevers te plaatsen en het versmelten van deze mononucleaire cellen te induceren om vezels te vormen, aangeduid als myobuizen. Deze cantilever chips die gedifferentieerde spiercellen ondersteunen worden vervolgens overgebracht naar een elektrofysiologiemicroscoop die is aangepast om een laser en fotodetector te ondersteunen die worden gebruikt om de cantileverdeflexie te meten in reactie op spiercontractie na plaatsing van de chip in de rig.
De laser wordt zo gepositioneerd dat deze zich op het uiteinde van de cantilever richt en de fotodetector wordt eveneens uitgelijnd zodat deze de gedeflecteerde straal opvangt. Resultaten worden verkregen die de mate van cantileverdeflexie tonen, die wordt veroorzaakt door spiercontractie in reactie op elektrische of chemische behandeling, wat een directe meting geeft van het contractieprofiel van de gezaaide cellen in realtime. Uiteindelijk kan de cantileververplaatsing worden verwerkt om een aflezing van kracht te geven. Dit systeem is multiplexed om een potentieel hoge doorvoertestbed te bieden voor de beoordeling van veranderingen in contractiele functie in reactie op medicamenteuze behandeling, ziekte, toestand of oefenprotocollen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met bestaande methoden zoals patch clamp elektrofysiologie, is dat deze methode voor functionele analyse niet-invasief is en gemakkelijk aanpasbaar voor hoge doorvoerstudies. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het geneesmiddelontwikkelingsveld, zoals identificatie van geschikte dosisresponsconcentraties vóór klinische evaluatie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van meerdere spierziekten omdat het middelen biedt om de functionele prestaties van cellen van verschillende pathologische fenotypes in realtime te onderzoeken, hoewel deze methode inzicht kan geven in skeletspiertweeledige pathologieën.
Het kan ook worden gebruikt voor andere weefselsystemen zoals hart- en gladde spieren Gesteriliseerde, eerder voorbereide cantilever chips en 13 F dekglasjes in 70% ethanoloplossing en laten drogen in een flowhood. Plaats vervolgens individuele cantilever chips bovenop 13 F dekglasjes. In een standaard 12-wellsplaat bekleed de cantilevers met de biopolymeer of oppervlaktemodificatie die is geoptimaliseerd voor het celtype dat wordt gebruikt. Volgens standaard celcultuurprotocollen duurt oppervlaktecoating 30 minuten met onze voorbereidingsmethode, maar kan worden aangepast afhankelijk van het specifieke cultuurprotocol van de onderzoeker.
Reese heeft de cellen in hun specifiek groeimedium naar de gewenste concentratie gebracht, vervolgens honderd microliters van de celsuspensie op het oppervlak van de cantilever chip, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de bel medium de cantilevervensters volledig bedekt. Breng de plaat met de chips over naar een incubator en laat de cellen minimaal een uur hechten na deze beplantingsperiode. Gebruik steriele pincetten om de chip over te brengen naar een schone put zonder 13 F dekglas en voeg een milliliter groeimedium toe aan elk.
Breng de plaat terug naar de incubator, onderhoud de cellen volgens hun standaardprotocol voor in vitro onderhoud. Plaats op dekglasjes een verwarmd kweekbakje op het onderstel van een rechtopstaande elektrofysiologiemicroscoop. Voeg drie milliliter van het huidige celvoedingsmedium toe aan de verwarmde microscoop.
Monteer roestvrijstalen elektroden op de binnenkant van het verwarmde kweekbakje met een scheidingsafstand van 15 millimeter. Verbind ze met een pulsgenerator die in staat is om veldstimulatie te produceren, pulsen met variabele intensiteit, frequentie en golfvorm om het systeem in staat te stellen veldstimulatie van cellen te produceren wanneer dat passend is. Bevestig een helium neon laser gemonteerd op XY-vertaalbare tafels aan de onderkant van de microscooptafel.
Pas vervolgens de laser aan zodat de laserstraal wordt gericht door de basis van het verwarmde kweekbakje in een hoek van 30 graden ten opzichte van het vlak van de cantilever. Bevestig vervolgens een quadrantfotodetectormodule gemonteerd op XY-vertaalbare tafels aan de onderkant van het microscooponderstel. Pas de positie aan zodat de gereflecteerde laserstraal in het midden van de vier quadranten landt.
Schrijf een softwareprogramma om de lineaire actuatoren te besturen die over de cantilevers scannen met verwijzing naar de stroomdiagram die in het tekstprotocol wordt gegeven. Schakel de cantileveranalysehardware en bijbehorende software in. Plaats de verwarmde fasethermometer in het medium en wacht tot deze 37 graden Celsius leest.
Plaats vervolgens de cantilever chip in de fase met de cantilevers gericht naar de rechterkant van de fase. Schakel de microscooplichtbron in. Richt de microscoop om de randen van de cantilevers in beeld te brengen en gebruik de laserfotodetectorbesturingssoftware om de laserstraal op het uiteinde van cantilever één te positioneren, ervan uitgaande dat de cantilevers naar rechts van de fasecantilever zijn georiënteerd.
Degene die zich in de bovenste linkerhoek van de matrix bevindt en de nummers lopen naar beneden tot 16. In de onderste linkerhoek. Cantilever 17 bevindt zich in de bovenste rechterpositie en loopt naar 32.
In de onderste rechterhoek drukt u op afspelen op de opnamesoftware. Positioneer de fotodetector zodat het signaal nul leest in zowel de x- als y-frames door de stappenmotoren aan te passen die de fotodetector besturen. Stel vervolgens de positie van cantilever één in de laserfotodetectorbesturingssoftware in.
Beweeg vervolgens de laser naar het uiteinde van cantilever 16. Herhaal de positionering van de fotodetector en stel de positie van cantilever 16 in de laserfotodetectorbesturingssoftware in. Beweeg nu de laser naar het uiteinde van cantilever 32.
Herhaal de positionering van de fotodetector en stel de positie van cantilever 32 in de laserfotodetectorbesturingssoftware in. Beweeg vervolgens de laser naar het uiteinde van cantilever 17. Herhaal de positionering van de fotodetector en stel de positie van cantilever 17 in de laserfotodetectorbesturingssoftware in.
Schakel de microscooplichtbron uit en vervolgens het bovenlicht in de laboratorium. Druk op opnemen op de opnamesoftware. Stel de hardware van de pulsgenerator in op 40 milliseconde en vijf volt pulsen, een frequentie van één hertz.
Schakel ver
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van microschaal silicium cantilevers als buigzame kweekoppervlakken voor het meten van de contractiliteit van spiercellen in vitro. Cellulaire contractie veroorzaakt buiging van de cantilever, wat gemeten en omgezet kan worden in krachtmetingen, waardoor een niet-invasief systeem ontstaat voor het beoordelen van de contractiele functie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Spiervezels kunnen in vitro worden gekweekt voor experimentele analyse.
- Microscale cantilevers bieden een innovatieve methode voor het meten van spiercontractie.
- Real-time meting van de contractiele activiteit is essentieel voor het begrijpen van de spierfysiologie.
- Deze methode maakt high-throughput testen van de spierfunctie mogelijk.
Doel van de studie
- Om de contractiele activiteit van gecultiveerde spiervezels te meten.
- Om de respons van spiercellen op elektrische of chemische stimulatie te beoordelen.
- Om een schaalbaar systeem te ontwikkelen voor het evalueren van de spiercontractiliteit.
Gebruikte methoden
- Gedissocieerde spiercellen worden geplaatst op micro-siliconen cantilevers.
- Cellen worden gestimuleerd om te fuseren tot myotubes voor contractiemetingen.
- Cantilever-chips worden geplaatst in een elektrofysiologische microscoop met laser en fotodetector.
- De afbuiging van de cantilever wordt gemeten als reactie op spiercontractie.
Belangrijkste resultaten
- Resultaten geven aan dat de mate van cantilever-afbuiging correleert met spiercontractie.
- Real-time gegevens bieden inzicht in het contractieprofiel van spiercellen.
- Het systeem maakt een gemultiplexeerde beoordeling van de contractiele functie mogelijk.
- Potentiële toepassingen omvatten beoordelingen van medicamenteuze behandelingen en trainingsprotocollen.
Conclusies
- Deze methode biedt een niet-invasieve benadering om spiercontractiliteit te bestuderen.
- Het biedt een platform voor high-throughput analyse van de spierfunctie.
- De resultaten kunnen bijdragen aan het begrip van de spierfysiologie en pathologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Microscale silicium-cantileversystemen maken niet-invasieve real-time meting van de cellulaire contractiele functie mogelijk, waardoor een voorspellend in vitro platform ontstaat voor het beoordelen van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen in spierweefsels. Deze benadering ondersteunt vroege targetvalidatie en leadidentificatie door kwantitatieve, reproduceerbare gegevens te leveren over contractiele responsen op farmacologische of genetische perturbaties. Het gemultiplexte array-ontwerp faciliteert screening met een middel tot hoge doorvoersnelheid, wat de triage van portfolios verbetert en biologische risico's in een laat stadium vermindert bij de therapeutische ontwikkeling voor neuromusculaire, cardiale en gladde spieren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe functionele outputs van skelet-, hart- en gladde spiercellen als reactie op stimulatie te meten.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van nauwkeurige, labelvrije kwantificering van contractiele activiteit als fenotypische read-out voor target-engagement.
- Predictieve waarde: Genereert dosis-respons- en kinetische gegevens die bijdragen aan lead-optimalisatie en preklinische go/no-go-beslissingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare contractiele metingen over gemultiplexte cantilever-arrays voor een consistente evaluatie van verbindingen.
- Schaalbaarheid: Maakt protocollen met een middel tot hoge doorvoer mogelijk voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in de contractiele functie, wat de efficiëntie van screeningcampagnes ondersteunt.
- Datakwaliteit: Levert real-time, op uitbuiging gebaseerde krachtmetingen die de variabiliteit verminderen en het vertrouwen in structuur-activiteitsrelaties vergroten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziektemodellering: Maakt het mogelijk om contractiele dysfunctie in cellen met pathologische fenotypes te beoordelen, wat fenotypische screening voor neuromusculaire en andere spierziekten ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Faciliteert de evaluatie van de vorming van de neuromusculaire junctie en de neuron-spiercommunicatie in co-cultuursystemen, wat bijdraagt aan de validatie van het doelmechanisme.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie door longitudinale beoordeling van de contractiele prestaties onder condities van vermoeidheid, stimulatie of blootstelling aan verbindingen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het cantilever-systeem is geïntegreerd in de discovery-workflow, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie en preklinische beoordeling, en biedt een functioneel fenotypisch platform dat biochemische en genetische screeningsbenaderingen aanvult.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan meetbare veranderingen in cellulaire contractiliteit.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid mogelijk via gemultiplexte deflectiemetingen, wat bijdraagt aan betrouwbare screening van compound-bibliotheken.
- Analytics: Levert kwantitatieve outputs, waaronder piekforce, time-to-peak en relaxatiekinetiek, die helpen bij het vergelijken van de effectiviteit van compounds en hun werkingsmechanisme.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door ziekte-relevante contractiele fenotypes te modelleren en therapeutisch herstel te beoordelen in spiergebaseerde modellen.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een herbruikbare, aanpasbare capaciteit over verschillende spierceltypen en ziektemodellen, waardoor redundante assay-ontwikkeling wordt verminderd.
Operationele en Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door functionele, fysiologische eindpunten te meten in plaats van surrogaatmarkers.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door geautomatiseerde laser-deflectiedetectie en gemultiplexte array-formaten.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege functionele triage van verbindingen mogelijk te maken, waardoor investeringen in fout-positieven worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door mechanistisch inzicht te bieden in contractiele liability of effectiviteit voorafgaand aan in vivo studies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, spierdifferentiatie en microscopie die compatibel is met elektrofysiologie.
- Afhankelijk van laser- en fotodetectorinstrumentatie, XY-translatiepodia en pulsgeneratorhardware voor stimulatie en meting.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor celzaaien, oppervlaktecoating en stimulatieprotocollen voor reproduceerbare resultaten over verschillende locaties.
- Aanpassing aan verschillende spiertypes (skelet-, hart-, gladde spier) kan optimalisatie van oppervlaktecoatings en kweekcondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige uitlijning van optische componenten en potentiële signaaldrift tijdens langdurige opnames, zoals vermeld in het protocol.
