Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

Hallo, ik ben Hel Lin, een post-grad student aan het Near Science Center, universiteit van Helsinki. Vandaag zullen mijn collega's en ik u laten zien hoe u optische en elektrofysiologische opnames kunt uitvoeren bij wakkere, hoofdgefixeerde, maar verder vrij bewegende en gedragende dieren. Onze methode creëert een tastbare, vertrouwde omgeving voor de muis om te navigeren en te verkennen.

Tijdens microscopische beeldvorming of opnamen van elektrofysiologie van enkele cellen, die een stevige fixatie van het hoofd van het dier vereisen, implanteren we een chronisch kraniek venster en laten we de muis wennen aan een geluchtmobiele thuiscage, die onder de voeten van het dier glijdt. Tijdens voortbeweging op een vlakke oppervlakte kan de mobiele thuiscage worden gepositioneerd onder een standaard rechtopstaande microscoop voor tweefoton beeldvorming of in een elektrofysiologieopstelling worden geplaatst voor patch clamp opnames in een wakkere muizenhersenen. Alle experimentele procedures die hier worden gepresenteerd, zijn goedgekeurd door het lokale ethische comité.

We implanteren kraniek vensters volgens gepubliceerde protocollen met kleine aanpassingen bij de implantatie van het kraniek venster. Het dier mag gedurende ten minste twee of drie weken herstellen; gedurende deze herstelperiode herwint het venster meestal zijn transparantie. Dieren met tekenen van resterende post-operationele ontsteking worden uitgesloten van de experimenten.

Train de dieren die voor een studie zijn geselecteerd om ze te wennen aan hoofdfixatie. In de mobiele thuiscage, behandel de muis gedurende vijf tot tien minuten rustig, vermijd abrupte bewegingen en geluiden, en plaats hem dan terug in de thuiscage. Herhaal de procedure twee of drie keer op ongelijke intervallen.

De mobiele thuiscage maakt hoofdfixatie mogelijk zonder het dier voorafgaand aan de hoofdfixatie te anesthetiseren. Gebruik een doek om de muis twee of drie keer op ongelijke intervallen in te pakken. Zorg ervoor dat het dier kalm blijft terwijl het is ingepakt.

Herhaal anders de procedure tot de muis er volledig aan is gewend. Begin de twee keer daagse training van de muizen op de mobiele thuiscage de volgende dag nadat de behandeling is voltooid. Weeg de dieren voor elke trainingssessie.

Dieren die meer dan 10% gewichtsverlies vertonen, moeten worden uitgesloten van de studie. Pas de positie van de hoofdfixatiearm aan om overeen te komen met de grootte van het getrainde dier. Verbind de luchttoevoer van het apparaat van de mobiele thuiscage met de standaard laboratoriumluchttoevoer onder druk.

Zorg ervoor dat de luchtdruk voldoende is voor vrij zweven van de geluchte thuiscage. Begin met de training van gewonde dieren in de mobiele thuiscage. Immobiliseer de muis door hem in de doek te wikkelen.

Plaats de metalen houder die aan het hoofd van het dier is bevestigd, in de hoofdfixatiearm en fixeer hem stevig door de schroeven vast te draaien. Zet de luchtstroom aan om de geluchte thuiscage te laten zweven. Verwijder de doek en laat de muis de thuiscage verkennen.

Tijdens de eerste trainingssessie kunnen muizen bevriezing en trillend gedrag vertonen en staartopstijgen. Om het dier te wennen aan geluid, zorg voor een constante blootstelling aan omgevingsgeluiden, bijvoorbeeld door een radiovertaling of opgenomen muziek en spraak tijdens alle trainingssessies en tijdens de experimenten te gebruiken. Om chronische stress te voorkomen, gebruik heldere lichthelderheid tijdens de eerste uur van de trainingssessie.

Na de eerste uur, voer de training in het donker uit en gebruik een nabij-infraroodcamera om het gedrag van het dier te monitoren. Wanneer de trainingssessie is voltooid, laat het dier vrij uit de hoofdfixatiearm door de schroeven los te maken. Breng het dier terug naar de thuiscage voor ten minste twee uur voor de volgende trainingssessie.

Het houden van de muis in een kooi met twee of meer andere muizen zal het stressniveau verlagen. Optioneel kunt u de geluchte kooi samen met het dier in zijn thuiscage plaatsen. Dit zal de omgeving verrijken en kan de gewenning van het dier aan de mobiele thuiscage versterken.

Tijdens de laatste trainingssessie zijn muizen gewend aan hoofdfixatie en moeten ze stressloos gedrag vertonen terwijl ze kalm rond de geluchte thuiscage navigeren. Bij afwezigheid van zichtbaar licht kan de traject van de muizenbeweging worden gevolgd door de bewegingen van de kooi te monitoren met een nabij-infraroodcamera of met een optische computermuis. Tijdens langere trainingssessies die langer duren dan een of twee uur, overweeg om de muis drinkwater te geven, hetzij handmatig of met behulp van een pipethouder die aan de structuur van de mobiele thuiscage is bevestigd.

Het volgende diagram geeft een overzicht van de tijdlijn van een typisch experimenteel onderzoek. Het onderzoek begint met de implantatie van het kraniek venster twee weken voordat de muis wordt behandeld, en gaat verder met acht twee keer daagse trainingssessies. Het typische onderzoek omvat een aantal beeldvormingssessies of patch clamp opnamesessies die met tussenpozen van een paar uur tot enkele dagen of weken zijn verdeeld.

Zowel optische als elektrofysiologische experimenten kunnen parallel worden uitgevoerd met cognitieve of gedragsstimuli en uitlezingen. Tweefoton microscopie is een unieke niet-lineaire optische technologie die realtime visualisatie van cellulaire en zelfs subcellulaire structuren in diepe corticale lagen van een knaagdierhersenen mogelijk maakt. Om een tweefoton microscopisch beeldvormingsexperiment uit te voeren, plaats een getrainde muis in de mobiele thuiscage, pas de stoppen aan om de microscoopoptiek te beschermen tegen onbedoelde schade.

Maak het dekglaas van het kraniek venster schoon om stofdeeltjes te verwijderen. Laat een immersieve vloeistof op het dekglaas vallen. We raden aan viskeuze oplossing te gebruiken omdat water snel verdampt.

Het platform kan op een typische gemotoriseerde optische tafel worden geplaatst met behulp van de wijdveldmodus van de fluorescentiemicroscoop en een lang doorlaat emissiefilter. Beoordeel de hersenvaten en selecteer een gebied van belang. Om de cortical