Name: Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Leer een nieuwe methode voor tractiekrachtmicroscopie met fluorescerende microsferen in polyacrylamidegels nabij het celkweekoppervlak. Deze techniek verbetert de lokalisatie van sondes voor nauwkeurige meting van celmechanica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag het Interdisciplinair Innovation Initiative Program, Universiteit van Illinois te erkennen, verlenen 12035. SK werd gefinancierd op UIUC van National Science Foundation (NSF) Subsidie ​​0.965.918 IGERT: Het trainen van de volgende generatie van onderzoekers in Cellulaire en Moleculaire Mechanica en bionanotechnologie.

Fabriceren en functionaliseren PA gels van verschillende stijfheden met fluorescerende microbolletjes ingesloten bij celkweek oppervlak. 1 functionaliserend de Top Glass Cover Slips <ol><li> Schoon glazen dekglaasjes (# 1.0, 12 mm diam.) Met water en zeep, gevolgd door ethanol om vreemde stof te verwijderen. </li><li> Plaats glazen dekglaasjes op een geraspte oppervlak (bijvoorbeeld pipetpunt houder), zodat zij niet aanraken tot gemak van interactie met de dekglaasjes vergemakkelijken. </li><li> De producten van het gehele oppervlak van de dekglaasjes met poly-D-lysine (0,1 mg / ml) gedurende 1 uur (figuur 1A). </li><li> Gedurende deze tijd is, een 1: 10.000 verdunning van de colloïdale oplossing van 0,1 urn diameter, fluorescerende microbolletjes met gedeïoniseerd (DI) water met een deeltjesdichtheid van ongeveer 1 microbolletjes per 20 urn 2 op het gel oppervlak te verkrijgen. Zie figuur 2 voor de resultaten van verschillende verdunningen. Dit dilution kan worden aangepast aan de behoefte van specifieke experimenten voldoen. </li><li> Plaats de verdunde oplossing in een ultrasoon waterbad gedurende 30 minuten. </li><li> Na 1 uur, gebruik een pincet om til elke dekglas en blaas droog met lucht. Zet de droge dekglaasjes om de geraspte oppervlak. </li><li> Verwijder de verdunde colloïdale oplossing van het ultrasoon bad en pipet 150 ul op elk dekglas. Laat gedurende 10 minuten (Figuur 1B). </li><li> Gebruik een pincet om til elke dekglas en blaas droog met lucht. Zet de droge dekglaasjes om de geraspte oppervlak en op te slaan in het donker totdat u ze gaat gebruiken. </li></ol> 2 Voorbereiding PA Gel Direct aan Glass Bottom Petrischalen <ol><li> Verwarm de kookplaat tot 100 ° C. </li><li> Leg het gewenste aantal glazen bodem petrischalen (35 mm schotel met 14 mm micro-goed, # 1.0) op een vlakke ondergrond in een zuurkast. </li><li> Bedek het glazen gedeelte van elke petrischaal micro-goed met 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3-APTES) gedurende 7 min voor activatie. Wees voorzichtig onbedoelde druipen van de 3-APTES aan het oppervlak van de kunststof in de petrischaal voorkomen degradatie van de polystyreen voorkomen. </li><li> Na 7 minuten, vul de petrischaal met DI-water en gooi niet gevaarlijk afval afvoeren. </li><li> Herhaal stap 2.4 3x voor elk gerecht, en dan schud de petrischaal om extra water te verwijderen. Plaats de petrischalen op de hete plaat tot het glas gedeelte droog is. </li><li> Verwijder de petrischaaltjes van de hete plaat en terug te keren naar een vlak oppervlak in een zuurkast. </li><li> In een zuurkast, maak een oplossing van 0,5% glutaaraldehyde en bedekken het glazen gedeelte van elke petrischaal en de oplossing gedurende 30 minuten. Wees voorzichtig onbedoelde druipen van de glutaraldehyde aan het oppervlak van de kunststof in de petrischaal voorkomen afbraak van het kunststof te vermijden. </li><li> Na 30 min, vul de petrischaal met DI-water en gooi in afvalcontainer te spoelen en verwijder de glutaraldehyde. </li><li> Herhaal stap 2.4 3x voor elk gerecht, en dan schud de petrischaal om extra water te verwijderen. Plaats de petrischalen op de hete plaat tot het glas gedeelte droog is. </li><li> Voor het mengen van de componenten van de PA geloplossing, verplaatst het gefunctionaliseerde glaasjes in de zuurkast zodat zij gemakkelijk toegankelijk zijn, waardoor de snelle sandwichen van de gel met de glazen bodem petrischalen na mengen van de gel oplossing. </li><li> In een 15 ml centrifugebuis, meng 40% bisacrylamide, 2% acrylamide en acrylzuur direct na elkaar in de in tabel 1 vermelde concentraties (naar gepubliceerde protocol 10) om de gewenste matrix elasticiteit te bereiken. </li><li> Voeg 100 mM HEPES, 10% ammoniumpersulfaat en TEMED in tabel 1 vermelde hoeveelheden die overeenkomen met de gewenste matrix elasticiteit van de geloplossing voltooien. </li><li> Onmiddellijk Pipetteer 15 ul geloplossing op het midden van de ruit gedeeltevan de petrischaaltjes. </li><li> Onmiddellijk halen een gefunctionaliseerde glazen afdekplaat slip met een pincet. <ol><li> Flip de glazen afdekplaat slip boven zodanig dat de fluorescerende kralen zijn op de zijkant maken het contact met gel oplossing. </li><li> Leg het dekglas voorzichtig bovenop de nu vloeistof PA gel zodanig dat de gefunctionaliseerde zijde in contact met de gel (figuur 1C). Opmerking: Voor het beste resultaat is een tweede persoon aanbevolen voor de rol van het toevoegen van het dekglas om de mogelijkheid van een gedeeltelijke polymerisatie vermijden tijdens pipetteren vloeistof PA gel oplossing op meerdere petrischaaltjes. </li></ol></li><li> Flip alle petrischalen naar helpen bij het vermijden van zwaartekracht op fluorescente nanodeeltjes polymeriseren in lagere niveaus van de PA gel. </li><li> Wacht ten minste 35 minuten of totdat de voorraadoplossing van PA gel zichtbaar gepolymeriseerd in de centrifugebuis. </li><li> Flip de petrischaaltjes terug over en vul ze met PBS om te helpen met het verwijderen van het dekglas. </li><li> Zorgvuldig maken contact met het glazen gedeelte van de petrischaal en de omtrek van het dekglas, met een pincet aan de omtrek van het dekglas schrapen. Voeren verschillende cycli totdat het dekglas wordt verdreven. Verwijder het deksel slip en gooi op een juiste slijpsel afvalcontainer. </li><li> Na het verwijderen van alle dekglaasjes, zal fluorescerende kralen hebben overgedragen aan de gel (figuur 1D). Bedek de PA gels volledig met PBS, plaats de petrischaal deksel op elk gerecht, en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> 3 functionaliserend PA gel met Fibronectine <ol><li> Bereid de volgende voorgemengde bereid zoals vermeld in een vooraf vastgesteld protocol 11: Opnemen oplossing (137 mM NaCl, 5% (v / v) glycerol) en 2x conjugatie buffer (0,2 M 2-(N -morpholino) ethaansulfonzuur (MES), 10 % (v / v) glycerol, pH 4,5). </li><li> Gebruik een vacuümpomp in een biologische kap om alle PBS van de glazen bodem gerechten met de PA gels verwijderen. </li><li> Pipette genieten oplossing op elke gel zodanig dat de gel volledig is ondergedompeld. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. </li><li> Warm 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) en N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) op kamertemperatuur. </li><li> Meng 10x oplossing van EDC (150 mM, 19 mg / ml in gedeïoniseerd water) en NHS (250 mM, 29 mg / ml in gedeïoniseerd water). </li><li> Meng 1 deel 10x EDC, 1 deel 10x NHS, 3 delen DI water, en 5 delen 2x vervoeging buffer. </li><li> Gebruik een vacuümpomp in een biologisch kap aan het weken oplossing te verwijderen. Zorg ervoor dat alle vloeistof wordt verwijderd uit de gel oppervlak. </li><li> Voeg genoeg NHS / EDC oplossing om de gel oppervlak bedekken en vul de glazen bodem en van de petrischaal (150-250 pi). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker. </li><li> Ontdooi fibronectine bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, meng steriel DI water in een 50 ug / ml fibronectine oplossing. </li><li> Gebruik een vacuümpomp in een biologische kap aan de NHS / EDC oplos verwijderentie. Zorg ervoor dat alle vloeistof wordt verwijderd uit de gel oppervlak. </li><li> Voeg 150 ul van fibronectine oplossing voor elke gel. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 35 min om voor hechting van fibronectine. </li><li> Na 35 min, voeg PBS aan elke petrischaal en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. </li></ol> 4 trekkracht Experimenten <ol><li> Warm cell media, PBS en trypsine tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Spoel gels 5x met steriel PBS, opzuigen van de PBS in tussen spoelingen en laat afgedekt in de kap. </li><li> Voeg 1 ml trypsine per 25 cm 2 kolf die cellen. Na cellen worden opgeheven van fles, verdun de trypsine met mobiele media en tel de cellen. Op basis van gel oppervlak Bepaal het aantal cellen vereist per gel voor een uiteindelijke cel zaaidichtheid van 3000 cellen / cm 2. Verdunnen of concentreren suspensie zodanig dat 150 ul van de cel-media mengsel bevat dit aantal cellen. Aliquot 150 pi cel suspension op elke gel. </li><li> Plaats de platen met cellen in een incubator gedurende 30 minuten. Dan voorzichtig de petrischalen verwijderd en vul de rest van de petrischaal met media (ongeveer 2 ml) zodanig dat het oppervlak van de schaal geheel wordt ondergedompeld. </li><li> Plaats de petrischalen terug in de couveuse tot het beeld acquisitie. </li><li> Bereid de microscoop en data-acquisitie systeem voor beeldvorming: steek de 40x water immersie objectief, steek de Differentieel Interferentie Contrast (DIC) prisma, selecteer de mCherry of gelijkwaardig fluorescerende filter, en zet de klimaatkamer. </li><li> Na bereiding voor beeldvorming, verwijdert u een petrischaal uit de incubator en leg het voorzichtig op de microscoop podium. Verwijder de petrischaal deksel voor DIC imaging. </li><li> Zoek een enkele cel en een stilstaand beeld van de cel in DIC vangen. </li><li> Zonder het verplaatsen van de microscoop podium, schakelt de weergave modus te fluorescentie. Focus op de fluorescerende microsferen en record een afbeelding van de microsferen. </li><li> Verwijder voorzichtig cel media uit de petrischaal met een pipet en voeg 0,05% trypsine-EDTA. </li><li> Beeld de microbolletjes onder de cel nadat de cellen losgemaakt. </li><li> Gebruik stromingsvisualisatie (PIV) analyse ImageJ 12 de verplaatsing veld berekenen door cellulaire krachten. </li></ol>

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics%3A+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-%CE%B2+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li>
<li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTse%2C+JR+%22Current+Protocols+in+Cell+Biol%22">Current Protocols in Cell Biol</a>. , Chapter 10, Unit 1 16(2010).</li>
<li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Mol.+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li>
<li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell%E2%80%93cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li>
<li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+chemistry%2C+topography%2C+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface%3A+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li>
<li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929(2011).</li>
<li>Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li>
<li>Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li>
<li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtanackovic%2C+T+%22Theory+of+Elasticity+for+Scientists+and+Engineers%22">Theory of Elasticity for Scientists and Engineers</a>. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Bij gebruik van deze techniek, is het essentieel dat de kraal oplossing goed verdund en de korrels worden gekozen gebaseerd op de gewenste diameter, PA gel substraat stijfheid, en de omvang omvang van de verschijnselen die is onderzocht in de gewenste experiment. Voorzichtigheid is geboden bij het verdunnen van de kraal oplossing voorafgaand aan funktionaliseren top dekglaasjes. De afstand tussen parels op het gel oppervlak kan worden veranderd door het veranderen van de verdunningsfactor va...

De mechanische interactie van een levende cel met de lokale omgeving is algemeen bestudeerd middels PA gels. Deze substraten rekenen op een eenvoudige, goed gekarakteriseerde protocol vastgesteld door Dembo en Wang in 1997 1. Een van de belangrijkste voordelen van deze substraten is dat de stijfheid kan worden afgestemd door het modificeren van de concentraties van specifieke componenten van de gel oplossing. Dit verschaft een gewenst platform interactie van cellen met verschillende omgevingen starheid bestuderen. Wanneer PA gels worden bekleed met extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, cellen zich aan hen kracht genereren. Door cel werking, gel vervormt als een elastisch lichaam. Deze vervorming is afhankelijk van de grootte van de door de cellen en de elastische eigenschappen van de gel toegepaste kracht. Diverse studies hebben PA gels gebruikt om cellulaire trekkrachten te onderzoeken. In een variant van PA gel fabricage, zijn fluorescerende microbolletjes (korrels) ingebed throughout de gel naar cel trekkrachten te kwantificeren op gels van verschillende rigiditeiten 2. Bij cel kracht toepassing, de kralen te verdringen uit hun oorspronkelijke locatie volgende gel vervorming. Het veld vervorming gemeten van de afzonderlijke kraal verplaatsingen. Dit veld vervorming gebruikt elasticiteit theorie en de elastische eigenschappen van de gel om de trekkrachten berekenen. Deze metingen geven inzicht in hoe cellen mechanisch gevoel en interactie met hun lokale micro-omgeving 3. In vele algemeen gebruikte PA gel fabricage protocollen, worden de beads vermengd gehele PA gel in vloeibare, niet-gepolymeriseerde toestand. Een volledig gepolymeriseerde PA gel bevat fluorescerende kralen gehele volume. Bij het berekenen cel trekkrachten worden beads meest nabij het gel oppervlak (cel-substraat interface) gecontroleerd. De verplaatsingen van deze kralen worden geacht plaats te hebben op de celkweek oppervlak voor eenvoud de kracht BEREKEn. De plaats van de korrels in de diepte van de gel wordt genegeerd. In een elastisch medium (zoals PA gel), een korrel dichter bij een bijzondere krachtuitoefening meer dan een kraal die verder van het te verplaatsen. Aldus behandelen van de verplaatsing van een punt (op de korrel locatie) distaal van het oppervlak dat aan het oppervlak leidt tot een onderschatting van cellulaire aandrijvingen. De mate van fouten afhankelijk van de afstand van de hiel van het oppervlak. De fout kan niet worden bepaald zonder kennis van de locatie van de kraal. De behoefte aan een eenvoudige methode om kralen beperken vlakbij de celkweek oppervlak heeft gericht een aantal technieken. Een manier is om de dichtheid van de korrels verhogen de gehele gel zodat er voldoende kralen in de top focal plane beweging meten vlakbij het oppervlak. Een andere techniek betreft de bouw van een confocale beeldvorming kamer voor live cell imaging zodanig dat het licht vanalleen de kralen in de bovenste meest focal plane wordt verzameld 4. Een andere werkwijze omvat bedekkend een uiterst dunne laag PA gel die kralen bevatten bovenop een reeds gepolymeriseerde gel zonder kralen 5. Een nadeel van elk van deze technieken is dat de precieze locatie van de korrels in de gel niet bekend. Dit introduceert fout in de berekening van de verplaatsing gebied van de kralen, en dus de berekening van cel krachten. Een andere techniek omvat conjugatie van kralen om het bovenvlak van een reeds gepolymeriseerd PA onder toepassing Sulfo-SANPAH 6. Deze techniek zorgt de kralen zijn inderdaad alleen op de bovenkant van de PA gel, maar de mate waarin ze zijn ingebed in de diepte van de gel is onbekend. Dit kan mogelijk zorgen voor een lokale topografie voor de cellen, die het gedrag van cellen kunnen veranderen, zoals eerder werk heeft gesuggereerd dat cellen kracht enkele microns weg 7 kan voelen. Onlangs, een techniek voor patroonvorming PA gels met 1 urn diameter fluorescent fibronectine dot markers in een geregulariseerd scala opgericht 8. In dit geval wordt de diepte van de fluorescente merkers bekend, en is in wezen nul, zoals de fibronectine patroon indirect gedrukt op het gel oppervlak. Echter, deze methode geen continue omgeving waarop cellen kunnen hechten, zoals de ECM eiwit beperkt tot 1 urn diameter dots. Een methode voor het volledig integreren tracker kralen binnen PA gels en beperken ze naar een bekende locatie zeer dicht bij het oppervlak moet nog worden vastgesteld. Hier ontwikkelen we een techniek om sub-micrometer tot micrometer diameter fluorescerende kralen te beperken tot een focal plane vlakbij de celkweek oppervlak binnen PA gel. Een gel wordt gewoonlijk uitgehard door daartussen gepolymeriseerde vloeibare geloplossing tussen twee glasplaten. Een van de platen wordt gefunctionaliseerd zodat de gel sterk opgevangen. De andere is ongefunctionaliseerde en wordt verwijderd nadat de gel kuren. We passen deze verwijderbaar glazen suce door het bekleden met een laag korrels. Bij daartussen de vloeistof gel tussen de gefunctionaliseerde en het glasoppervlak parels gecoate, de kralen overdracht aan de gel tijdens het uitharden. Dit beperkt de afstand van integratie de kralen &quot;in de gel op 1,6 pm van het oppervlak. Glazen bodem Petrischalen worden gebruikt als het hechtende oppervlak waarop de gel wordt uitgehard. Om een ​​platte top gel oppervlak tijdens de polymerisatie te vormen, is een ronde glazen afdekplaat slip gebruikt om sandwich de gel met de glazen bodem petrischaal. Vóór gel fabricage, wordt de bovenste glazen dekglas gecoat met poly-D-lysine (PDL), hetgeen een positieve oppervlaktelading. De PDL wordt afgeblazen met perslucht en een oplossing van korrels in water wordt afgezet op de dekglaasjes. We maken gebruik van gecarboxyleerde fluorescerende microbolletjes, die een negatieve lading te dragen, en de interactie met de positief geladen oppervlak gemaakt door behandeling met PDL. Na het blazen van de kraal oplossing van het dekglaasje met perslucht, een enkele laagbeads blijft elektrostatisch gekoppeld met de droge dekglas. De PDL coating heeft geen invloed op de kleverigheid van het glas om het gel oppervlak, zoals de objectglaasjes onbeschadigd en uit de PA gel volledig intact. De glazen bodem Petrischalen hechtende gemaakt door behandeling met 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane en 0,5% glutaaraldehyde. PA gels gewenste starheid worden gemaakt door het mengen van geschikte concentraties bisacrylamide en acrylamide via een standaardprocedure 9. Een druppel van de gel oplossing gepipetteerd op de glazen bodem petrischaal. Het dekglaasje bevattende korrels met daartussen de gel met de petrischaal. Wanneer de gel wordt uitgehard, wordt de bovenste dekglas verwijderd waardoor de korrels ingebed in de PA gel binnen 1,6 pm van het oppervlak.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES bufferoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2% Bisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro;m Fluorescerende microspheres (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, Human, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfaat</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Acrylzuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethansulfonzuur (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materialen</td></tr><tr><td>35 mm Glas bodem schotel met 14 mm micro-well #1 dekglas</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Glas dekglazen, 12 mm diam.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr></tbody></table>

een nieuwe methode voor het lokaliseren van reporter fluorescent beads dichtbij de celkweek surface voor traction force microscopy

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels lang gebruikt als een platform om cel trekkrachten vanwege gemak van fabricage en de mogelijkheid om stemmen hun elastische eigenschappen te bestuderen. Wanneer het substraat wordt bekleed met een extracellulaire matrix eiwitten, cellen zich aan de gel en krachten toepassen, waardoor de gel te vervormen. De vervorming is afhankelijk van de cel tractie en de elastische eigenschappen van de gel. Wanneer de vervorming van het oppervlak gebied bekend is, kan het oppervlak tractie worden berekend met elasticiteitsleer. Gel vervorming wordt gewoonlijk gemeten door het inbedden fluorescente merker korrels gelijkmatig in de gel. De probes verdringen als gel vervormt. De probes nabij het oppervlak van de gel worden gevolgd. De verplaatsingen die door deze probes worden beschouwd als oppervlak verplaatsingen. Hun diepten van het oppervlak worden genegeerd. Deze aanname introduceert fout in trekkracht evaluaties. Voor nauwkeurige meting van cel krachten, is het essentieel voor de locatie van de korrels bekend zijn. We hebben ontwikkeldeen techniek die eenvoudig chemie gebruikt om fluorescente merker kralen, 0,1 en 1 urn in diameter beperken, in PA gels, op 1,6 pm van het oppervlak. We jas een dekglaasje met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende kralen. PA gel oplossing wordt dan ingeklemd tussen het dekglaasje en een hechtoppervlak. De fluorescerende kralen overdracht naar de geloplossing tijdens het uitharden. Na polymerisatie, de PA gel bevat fluorescerende kralen op een vlak nabij het gel oppervlak.

Confocale beeldvorming werd gebruikt om te bepalen dat de kralen inderdaad onder het gel oppervlak en de precieze locatie te kwantificeren in de gel diepte. Fluorescent kralen van een andere golflengte dan die in de gel werden bezinken op het oppervlak, en de afstand tussen de ingebedde fluorescente nanodeeltjes en die op het oppervlak werd berekend volgens een zwaartepunt identificatiealgoritme. De locatie van de kraal over het gel oppervlak dient als referentie voor het bovenoppervlak van de gel-waar de cellen toepass...

Traditionele technieken voor het vervaardigen polyacrylamide (PA) gels die fluorescente probes omvatten waartussen een gel tussen een hechtend oppervlak en een glasplaatje. Hier laten we zien dat deze dia bekleden met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende probes lokaliseert de probes binnen 1,6 urn uit het gel oppervlak.

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Het algemene doel van deze procedure is om poly acrylamide of PA-gels te fabriceren voor celcultuur met fluorescente microsferen ingebed zeer dicht bij het geloppervlak. Dit wordt bereikt door eerst glasdeksels te functionaliseren met poly D lysine. De tweede stap is om de glasdeksels te coaten met een oplossing die fluorescente microsferen bevat.Vervolgens worden PA-gels geformuleerd door het mengen van geschikte concentraties bis, acrylamide en acrylamide, en geplaatst tussen een onderliggend oppervlak en de gefunctioneerde zijde van de glasdeksels. De laatste stap is om het gel te functionaliseren met een extracellulair matrixeiwit en cellen te kweken op het geloppervlak. Uiteindelijk wordt tractiekrachtmicroscopie gebruikt om mechanische krachten gemeten die door cellen worden uitgeoefend als gevolg van celgeïnduceerde substraatvervorming.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele PHL-fabricage, is dat het fluorescente microsferen lokaliseert op een bekende locatie binnen de geldiepte, waardoor een nauwkeurigere berekening van cellulaire tractiekrachten mogelijk is. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien er zorgvuldig moet worden omgegaan met het functionaliseren van de glasdeksels om ervoor te zorgen dat de fluorescente delen goed overgaan naar de PHL First Place. Plaats eerder gereinigde glasdeksels op een geribbeld oppervlak zodat ze elkaar niet raken.Om de interactie met de deksels te vergemakkelijken, bedek het hele oppervlak van de deksels gedurende een uur met 0,1 milligram per milliliter poly D lysine. Gedurende deze tijd, voer een verdunning van één op 10.000 uit van de colloïdeoplossing van 0,1 micrometer diameter. Rode fluorescente microsferen met gedeïoniseerd water om een ​​deeltje-dichtheid van ongeveer één microsfeer per 20 vierkante micron op het geloppervlak te verkrijgen.Plaats de verdunde oplossing gedurende 30 minuten in een ultrasoon waterbad. Na een uur gebruikt u een pincet om voorzichtig elke deksel op te tillen en deze met lucht te drogen. Plaats vervolgens de droge deksels terug op het geribbelde oppervlak.Zodra de verdunde colloïdeoplossing uit het ultrasone bad is verwijderd, pipet 150 microliters van de oplossing op elke deksel. Gebruik na 10 minuten een pincet om voorzichtig elke deksel op te tillen en deze met lucht te drogen. Zodra de droge deksels zijn teruggeplaatst op het gegradeerde oppervlak, bewaar ze in het donker totdat ze klaar zijn om te worden gebruikt.Leg vervolgens het gewenste aantal glazen bodem Petri-schalen op een vlak oppervlak in een chemische afzuigkap. Bedek het glazen deel van elke Petri-schaal. Microput met 97% van drie aminopropyltrimethyl gedurende zeven minuten voor chemische activering.Na zeven minuten vult u de Petri-schaal met gedeïoniseerd water en gooit u de oplossing weg in een afvalinische. Bedek voorzichtig het glazen deel van elke Petri-schaal. Wel met een eerder bereide 0,5% glutaraldehyde-oplossing gedurende 30 minuten.Na 30 minuten vult u de Petri-schaal met gedeïoniseerd water en gooit u deze weg in een afvalinische om de glutaraldehyde te spoelen en te verwijderen. Voordat u de componenten van de polyacrylamide-gelooplossing mengt, verplaatst u de gefunctioneerde glasplaatjes in de chemische afzuigkap zodat ze gemakkelijk toegankelijk zijn, waardoor het gel snel kan worden gesandwichd met de glazen bodem Petri-schalen. Na het mengen van de geloplossing in een 15 milliliter centrifugeerbuis, meng 40% bisacrylamide, 2% acrylamide en acrylzuur in onmiddellijke opvolging.Om de gewenste matrixelasticiteit te bereiken, voegt u vervolgens 100 millimolar HEP's, 10% ammoniumpersulfaat en in hoeveelheden die overeenkomen met de gewenste matrixelasticiteit. Om de geloplossing te voltooien, pipet 15 microliters geloplossing onmiddellijk op het midden van het glazen deel van de Petri-schalen. Nadat u een gefunctioneerd glasdeksel met een pincet hebt opgepakt, draait u het om zodat de fluorescente kralen aan de kant zijn die contact maken met de geloplossing.Leg vervolgens het deksel voorzichtig op het nu vloeibare polyacrylamide-gel zodat de gefunctioneerde kant in contact is met het gel. Draai vervolgens alle Petri-schalen om om zwaartekrachteffecten op fluorescente nanodeeltjes te voorkomen. Polymerisatie in lagere niveaus van het polyacrylamide-gel.Na polymerisatie draait u de Petri-schalen weer om en vult u ze met BS. Maak voorzichtig contact met het glazen deel van de Petri-schaal en de omtrek van het deksel met behulp van een pincet om de omtrek van het deksel te schrapen. Na verschillende cycli van schrapen. Verwijder het deksel en gooi het weg in een geschikte container voor scherpe afvalstoffen.Na het verwijderen van alle deksels, plaatst u het Petri-schaaldikje op elke schaal en bewaart u het bij vier graden Celsius. Zodra de polyacrylamide-gels warm zijn tot kamertemperatuur, gebruikt u een vacuümpomp in een biologische kap om alle PBS uit de glazen bodemschotels met de gellen te verwijderen. Pipeteerd eerder bereide wekoplossing op elke gel zodat de gel volledig is ondergedompeld. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende ten minste een uur, voegt u 150 tot 250 microliters van een eerder bereide H-S-E-D-C-oplossing toe om het geloppervlak te bedekken en vult u de glazen bodemput van de Petri-schaal.Vervolgens incubeert u de gellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Zodra de N-H-S-E-D-C-oplossing door vacuüm is verwijderd, voegt u 150 microliters van een eerder bereide fibronectine-oplossing toe aan elke gel. Incubeer vervolgens opnieuw gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur om de aanhechting van fibronectine mogelijk te maken.Op dit punt verwarmt u celmedium PBS en trypsine tot 37 graden Celsius in een waterbad. Spoel de gellen vijf keer met steriele

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the traction force microscopy assay. The assay determines the cellular traction of human colon cancer cells on the extracellular matrix present on soft elastic hydrogel having embedded fluorescent beads. The resultant displacement of fluorescent beads is measured using an appropriate software.

Traction Cytometry Assay: A Method to Quantify Traction Force Exerted by Cancer Cells on ECM

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Hier presenteren we een protocol dat wordt gebruikt om tractiekracht microscopie experimenten uit te voeren op B-cellen. We beschrijven de voorbereiding van zachte polyacrylamide gels en hun functionalisering, evenals data-acquisitie aan de microscoop en een samenvatting van data-analyse.

Traction Force Microscopie naar Studie B Lymphocyte Activatie

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Leer een nieuwe methode voor tractiekrachtmicroscopie met fluorescerende microsferen in polyacrylamidegels nabij het celkweekoppervlak. Deze techniek verbetert de lokalisatie van sondes voor nauwkeurige meting van celmechanica.

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy (Video) | JoVE Journal

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

Meer video's verkennen