Name: Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Leer de overlay-assay om bacteriocine-activiteit en quorum sensing van Streptococcus pneumoniae te visualiseren. Deze methode biedt een snelle screening van meerdere stammen voor antimicrobiële interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is ondersteund door de Elizabeth E. Kennedy Research Award.

1 Voorbereiding van Producent Strain <ol><li> Streak een pneumokokken stam te worden getest op bacteriocineproductie productie op een 5% schapen bloed tryptische soja-agar plaat van -80 ° C vriezer voorraden. NB: Gebruik van bloedplaatjes voor groeien van de stam te testen op remming verhoogt de reproduceerbaarheid van de assay. Bovendien kunnen andere niet-pneumococcen stammen die bacteriocines produceren gebruikt worden, hoewel groeiomstandigheden moet worden aangepast voor een bepaald organisme. We hebben Streptococcus mitis en Lactococcus lactis gebruikt in de overlay test met succes. </li><li> Incubeer de plaat gedurende de nacht (O / N) bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Na incubatie van de producerende stam, bereid de tryptische soja-agar (TSA) plaat pipetteren 3000 tot 4000 eenheden katalase op platen die 25 ml TSA en spreid het catalase oplossing met steriele glazen kraaltjes. Laat de plaat drogen gedurende ongeveer 10 minuten ondereen biologisch veiligheidskabinet. </li><li> Verzamel een zichtbare hoeveelheid bacteriën op een pipet. Steek de pipet in de gedroogde TSA plaat. OPMERKING: Meer dan een producent stam kan worden gestoken in een enkele TSA plaat. Het is belangrijk dat de ruimte steken zodat verkregen halos niet overlappen. <ol><li> Indien mogelijk, omvatten bekende bacteriocine producent als positieve controle en de stam voor gebruik in de overlay als een negatieve controle. OPMERKING: Positieve en negatieve controles werden eerder gepubliceerd en zijn beschikbaar op aanvraag 10 beschikbaar. </li></ol></li><li> Incubeer TSA plaat met meerdere steken bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 6 uur. </li></ol> 2 Het maken van glycerol voorraden van de Overlay Strain <ol><li> Bereid glycerol voorraden (kweken gekweekt tot mid-exponentiële fase en vervolgens bij -80 ° C na toevoeging van glycerol) vóór de dag van de overlay test. Inoculeren 5-10 kolonies van pneumokokken strain te worden getest op gevoeligheid of feromoon secretie in Todd-Hewitt medium met 0,5% gistextract (THY). OPMERKING: De bouw van BlpC induceerbare verslaggevers is eerder beschreven 2 en stammen zijn beschikbaar op aanvraag. </li><li> Incubeer 5-10 kolonies in glazen buisjes met 5 ml van THY met goed gesloten deksels in een 37 ° C waterbad zonder schudden. </li><li> Incubeer kweken bij 37 ° C totdat ze bij een OD 620 van 0,3 tot 0,5. OPMERKING: Dit duurt ongeveer 4-5 uur duren, afhankelijk van de gebruikte stam. <ol><li> Keer de buis een paar keer voorafgaand aan het meten van de OD. </li></ol></li><li> Indien de proef niet dezelfde dag worden uitgevoerd of de virusstam meerdere keren worden gebruikt in de toekomst te glycerol voorraden en verdere experiment later. Voor glycerol voorraden voeg glycerol te kweken tot een uiteindelijke concentratie van 20%. Aliquot culturen in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C. OPMERKING: Monsters kunnen s zijneerd voor maanden bij -80 ° C. Als niet het maken van glycerol voorraden, gebruikt samples direct voor overlay test. </li></ol> 3 Overlay Assay <ol><li> Net voor het aanbrengen overlay, meng de overlay componenten. In een 15 ml conische buis, voeg 5 ml THY, 3000-4000 U katalase, en 200 ul van de stam overlay kweek die ofwel werd gekweekt die dag of een glycerol stock van de cultuur werd bij kamertemperatuur ontdooid. Als u de reporter stam, voeg 50 ul van X-gal (40 mg / ml) aan het mengsel overlay. Gebruik een conische buis per plaat. </li><li> Equilibreer overlay mengsel bij kamertemperatuur voorafgaand aan toevoeging van TSA gesmolten. </li><li> Verwijder TSA plaat met gestoken stam van incubator. Smelt solide TSA in de magnetron en blijf bij 55 ° C waterbad tot gebruik. Voeg 3 ml gesmolten TSA 1,5% agar afgekoeld tot 55 ° C aan mengsel overlay. <ol><li> Bereid de overlay mengsel onmiddellijk voor pipetteren, zal het mengsel begint te zeer stollensnel. OPMERKING: Als de overlay begint te stollen voordat plating, zullen de resultaten te interpreteren zijn. </li></ol></li><li> Meng de overlay mengsel door en neer te pipetteren meerdere malen met een 5 ml pipet en let niet te bellen introduceren in het mengsel. Langzaam pipet overlay mengsel direct op de gestoken TSA plaat. Laat de plaat op de benchtop paar minuten zodat de agar uitharden. <ol><li> Laat de plaat om de overlay mengsel verdelen niet draait, zal dit de groei van de gestoken cultuur trekken in de overlay. </li></ol></li><li> Plaats voorzichtig TSA plaat met overlay op 37 ° C incubator met 5% CO 2 O / N (ongeveer 16-18 uur). </li><li> Let op de borden na een nacht groei. De platen moeten ondoorzichtige van de groei van de overlay stam verschijnen, behalve in gebieden waar remming of feromonen signalering heeft plaatsgevonden. Deze verschijnen als ofwel helder of blauw zones rond de stam gestoken, respectievelijk. OPMERKING: Hoewel MEASURements van de diameter van blauw of clearing kan worden vastgesteld kwantitatieve beoordeling verschillen in de diameter kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid bacteriën die is gestoken in de plaat. De overlay test is een kwalitatieve test, geen kwantitatieve evaluatie moet met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Zichtbare clearing in vergelijking met de negatieve controle beschouwd als activiteit. </li></ol>

<ol><li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li>
<li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+enterocin+W%2C+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).</li>
<li>Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteriocins+and+activity+spectrum+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae.</a> J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).</li>
<li>Reichmann, P., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+a+peptide-inducible+two-component+system+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae.</a> FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).</li>
<li>Saizieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+a+novel+Streptococcus+pneumoniae+regulon+controlled+by+an+autoinduced+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide.</a> J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).</li>
<li>Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production%2C+purification%2C+characterization+and+mechanism+of+action+of+salivaricin+9+lantibiotic+produced+by+Streptococcus+salivarius+NU10%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10.</a> PLoS One. 8 (10), 77751(2013).</li>
<li>Wladyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+biochemical+characterization%2C+and+cloning+of+a+bacteriocin+from+the+poultry-associated+Staphylococcus+aureus+strain+CH-91%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).</li>
<li>Shea, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactofencin+a%2C+a+new+type+of+cationic+bacteriocin+with+unusual+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity.</a> 4 (6), 00498-00413 (2013).</li>
<li>Son, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mutations+in+the+pneumococcal+bacteriocin+transporter+gene%2C+blpA%2C+result+in+a+complex+population+consisting+of+producers+and+cheaters%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li>
<li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li>
<li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic%2C+lichenicidin%2C+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze overlay test is een snelle manier om het bereik van activiteit bacteriocine producenten bepalen en competitieve interacties die kunnen optreden onder pneumococcen stammen tonen. De overlay test kan worden aangepast om te gebruiken voor het screenen van meerdere stammen voor bacteriocineproductiekinetiek op een enkele plaat. We hebben met succes grote stam verzamelingen deze assay gescreend met een 48-pin replicator SBA platen enten van een helft van een 96-well plaat. Na een nacht incubatie wordt de groei naar de T...

Streptococcus pneumoniae, een gemeenschappelijke kolonisator van het polymicrobiële gemeenschap van de neus-keelholte, is in staat om te concurreren met andere pneumokokken en nauw verwante soorten door de productie van bacterieel geproduceerd antimicrobiële peptiden (bacteriocins). Elke volledig gesequenced pneumokokken soort tot op heden onderzocht bevat een versie van de b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bacteriocine productie door pneumococcen is aangetoond belang bij de uitkomst van zowel in vitro als in vivo competitie 1-4 zijn. Concurrentiedynamiek worden beïnvloed door de expressie van diverse bacteriocinen samen met verwante immuniteit eiwitten in antwoord op een specifieke peptide feromoon. Inductie van de BLP locus wordt bestuurd door een quorum sensing systeem waarin een peptide feromoon BlpC, bindt aan de sensor kinase, BlpH en initieert een signalerende cascade resulteert in detranscriptie van het BLP locus 5,6. Er zijn vier allelische varianten van BlpC die elk binden aan het verwante BlpH 6. Voor de cel om de effecten van zijn eigen bacteriocine overleven, zijn de genen die immuniteit verwante eiwitten coderen getranscribeerd op hetzelfde operon als elke bacteriocine genen. Killing treedt op als een concurrent stam niet in staat is de BLP locus upregulate in reactie op exogene feromoon of, indien de spanning niet over de specifieke immuniteit gen nodig voor bescherming. De transporteur complex, BlpAB vereist voor uitscheiding en verwerking van het peptide feromoon en bacteriocine peptiden 2,4. Onlangs is aangetoond dat een aanzienlijk deel van de pneumokokken stammen zijn &quot;bedriegers&quot;, wat betekent dat ze een geconserveerde mutatie in het blpA gen dat maakt ze niet in staat om feromonen en bacteriocins 1,2 afscheiden. Deze stammen zijn in staat om te reageren op exogene BlpC 2 afgescheiden door hinnikenboring stammen waardoor de productie van immuniteit eiwitten. Hoewel ruwe preparaten van bacteriocinen uit supernatanten kunnen worden bereid uit productiestammen middels biochemische methoden stappen om zuiverheid te bereiken, is deze benadering niet nuttig voor het screenen van grote verzamelingen isolaten en wanneer het niveau van bacteriocine expressie laag in bouillon gekweekte kweken 2,7- 9. De overlay assay wordt gebruikt als een snelle manier om de competitieve dynamiek tussen stammen die kunnen bestaan ​​in vitro onderzoeken. Hiervoor een pneumococcen stam vooraf geïnoculeerd op een agarplaat en mag groeien lokale bacteriële concentratie voldoende voor inductie van de BLP locus bereiken. Een tweede stam wordt vervolgens geïnoculeerd in een gesmolten zachte agar oplossing die vervolgens via pre-geïnoculeerde stam testen op gevoeligheid wordt toegepast. Om evalueren activiteit van de BLP locus (onafhankelijk van remmende activiteit) kunnen stammen worden bedekt met een reeks three eerder beschreven BlpC reporter stammen. Deze stammen werden gebouwd op een van de drie verschillende blpH allelen die inspelen op de drie meest voorkomende BlpC feromonen afgescheiden door de pneumokokken bevatten. De reporter stammen hebben een geïntegreerde lacZ gen dat onder controle van een BlpH afhankelijke promoter en dragen een deletie in het gen dat blpC zelfstimulatie 10,11 voorkomt.

<table><tbody><tr><td>Trypticase Soy Agar met 5% Schapenbloed</td><td>Fisher</td><td>B21261X</td><td>Voor groei uit vrieserculturen</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100-500mg</td><td>4.741 eenheden per plaat</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Bouillon + Gist Extract (THY)</td><td>Fisher</td><td>DF0492-17-6&nbsp;</td><td>30 g THB, 5 g gist extract, 1 L ddH2O autoclave</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Bouillon + Agar platen (TSA)</td><td>Fisher</td><td>B11768&nbsp;</td><td>30 g TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave</td></tr><tr><td>5-broom-4-chloor-3-indolyl &beta;-D-galactopyranosid (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>Oplossen in dimethylformamide</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td></td><td></td><td>Meet de OD620 van culturen</td></tr><tr><td>37 &deg;C waterbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C incubator met 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml kegelbuis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van de overlay test om kwalitatief meet bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken bacteriocines

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae koloniseert de zeer diverse polymicrobiële gemeenschap van de nasopharynx waar het moet concurreren met residente organismen. We hebben aangetoond dat door bacteriën geproduceerde antimicrobiële peptiden (bacteriocinen) de uitkomst van deze competitieve interacties bepalen. Alle volledig gesequencede pneumokokkenstammen bevatten een bacteriocine-like peptide (blp) locus. Het blp locus codeert voor een reeks diverse bacteriocinen en alle hoog geconserveerde componenten die nodig zijn voor hun regulatie, verwerking en secretie. De diversiteit van de bacteriocinen die in de bacteriocine-immuniteitsregio (BIR) van het locus worden gevonden, is een belangrijke bijdrager aan pneumokokkenconcurrentie. Samen met de bacteriocinen worden immuniteitsgenen in de BIR gevonden en zijn nodig om de produceerde cel te beschermen tegen de effecten van zijn eigen bacteriocine. De overlay-assay is een snelle methode om een groot aantal stammen te onderzoeken op competitieve interacties gemedieerd door bacteriocinen. De overlay-assay maakt ook karakterisering van bacteriocine-specifieke immuniteit mogelijk, evenals detectie van uitgescheiden quorum sensing-peptiden. De assay wordt uitgevoerd door een agarplaat vooraf te inoculeren met een stam die moet worden getest op bacteriocineproductie, gevolgd door aanbrengen van een zachte agar-overlay die een stam bevat die moet worden getest op bacteriocinegevoeligheid. Een klaringszone rond de prik geeft aan dat de overlay-stam gevoelig is voor de bacteriocinen die door de vooraf geïnoculeerde stam worden geproduceerd. Als er geen klaringszone wordt waargenomen, is de overlay-stam ofwel immuun voor de geproduceerde bacteriocinen of de vooraf geïnoculeerde stam produceert geen bacteriocinen. Om te bepalen of het blp locus functioneel is in een bepaalde stam, kan de overlay-assay worden aangepast om peptideferomoonsecretie door de vooraf geïnoculeerde stam te evalueren. In dit geval worden een reeks van vier lacZ-reporterstammen met verschillende feromoonspecificiteit gebruikt in de overlay.

Er zijn twee mogelijke uitkomsten in de overlay test. Het moet mogelijk zijn om de groei van de stam gestoken nadat nacht incuberen. In figuur 1A, de overlay stam gevoelig voor de bacteriocines geproduceerd. Een zone kan worden gevisualiseerd rondom de stam gestoken. Bovendien wervelen van de gestoken zeef in de overlay mengsel mogelijk is te zien in de figuur 1A. In figuur 1B, de overlay stam is immuun voor de bacteriocins worden uitgescheiden zoals opgemerkt door een ...

Concurrentie in Streptococcus pneumoniae wordt gemedieerd door bacteriocine, kleine antimicrobiële peptiden met remmende activiteit tegen pneumokokken en andere verwante soorten.  Hier beschrijven we een geoptimaliseerde bacteriële overlay-assay die de karakterisering van bacteriocine-activiteit en remmingsspectrum, bacteriocine-specifieke immuniteit en detectie van uitgescheiden quorum sensing-peptiden mogelijk maakt.

Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Het algemene doel van deze procedure is om de bacteriën en activiteit van streptococcus pneumonia te visualiseren met behulp van de overlay-assay. Dit wordt bereikt door eerst de produceerstam op een A TSA-plaat te prikken. In de tweede stap wordt het overlay-stammenmengsel bereid en vervolgens langzaam gepipetteerd op de TSA-plaat die de gestapte produceerstam bevat.In de laatste stap wordt de bacteriële activiteit beoordeeld. Uiteindelijk kan de overlay-assay worden gebruikt om de inactiviteit van bacteriën of de productie van feromonen door de betreffende prikte stam te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de directe zuivering van Bacterin, is dat deze methode een snelle manier is om een reeks bacteriën, inactiviteit vast te stellen en om meerdere stammen te screenen op bacterieproductie.De procedure wordt gedemonstreerd door Natalie Marchek, een afstudeerstudent in mijn laboratorium Om de bacteriën in de produceerder voor te bereiden, begint u door de pneumokokkenstam van belang op een 5% schapenbloed TSA-plaat te strijken en de plaat een nacht lang bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide te incuberen. De volgende ochtend pipet 3000 tot 4.000 eenheden katalysatoren op platen met 25 milliliter TSA en gebruik steriele glazen kralen om de katalysatoren over de platen te verspreiden. Laat de platen ongeveer 10 minuten drogen onder een biologisch veiligheidskabinet, verzamel een zichtbare hoeveelheid bacteriën op een pipettepunt en prik de pipettepunt in de gedroogde TSA-plaat.Voeg indien mogelijk een bekende bacterie in produceerder toe als positieve controle en de stam die in de overlay moet worden gebruikt als negatieve controle, en zorg voor voldoende ruimte tussen de prikken zodat de groeikhalveringen elkaar niet overlappen. Vervolgens worden de prikculturen gedurende zes uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide geïncubeerd de dag voor de overlay-assay, worden vijf tot tien kolonies van de te testen pneumokokkenstam geïnoculeerd in glazen buisjes met vijf milliliter THY-medium met 0,5% gistextract. Sluit vervolgens de deksels van deze glycerol-stamculturen en incubeer ze in een waterbad van 37 graden Celsius zonder te schudden.Na vier tot vijf uur draait u de buisjes een paar keer voorzichtig om en meet u vervolgens de OD. Wanneer de culturen een OD twee 60 van 0,3 tot 0,5 hebben bereikt, voegt u glycerol toe tot een eindconcentratie van 20% en verdeelt u de culturen vervolgens in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes en bewaart u de buisjes op min 80 graden Celsius. De volgende ochtend ontdooit u een aliquot glycerolvoorraad op kamertemperatuur.Dan, net voor de overlay-toepassing, mengt u vijf milliliter THY 3000 tot 4.000 eenheden katalysator en 200 microliter van de glycerolvoorraad in een 15 milliliter conische buis. Voor reporter-bacteriestammen voegt u 50 microliter Xcel toe aan de overlay-mix met één conische buis per plaat. Plaats de overlay-mix bij kamertemperatuur terwijl de mix in evenwicht is, smelt vaste TSA in een magnetron en plaats het vervolgens in een waterbad van 55 graden Celsius.Wanneer de gesmolten TSA is afgekoeld tot 55 graden Celsius, voegt u snel drie milliliter TSA toe aan de overlay-mix en pipetteerde u verscheidene malen op en neer met een vijf milliliter pipette. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen introduceert en pipet de overlay-mix vervolgens langzaam direct op de geprikte TSA-plaat. Nadat de plaat na een paar minuten is uitgehard en zonder de plaat te draaien, plaatst u de overgedekte prikcultuur voorzichtig terug in de incubator voor een nachtcultuur.De volgende ochtend observeert u de nachtelijke groei. De platen moeten ondoorzichtig lijken door de groei van de overlay-stam, behalve op de plaatsen waar remming of feromoonsignalering heeft plaatsgevonden. Er zijn twee mogelijke uitkomsten voor de overlay-assay in dit representatieve experiment.Na nachtcultuur werd een klaringszone waargenomen rond de geprikke stam, wat aangeeft dat deze overlay-stam gevoelig is voor de bacteriën die worden geproduceerd. Merk ook het wervelen van de geprikke stam in de overlay-mix op. In dit experiment was de overlay-stam immuun voor de gesecreteerde bacterine, zoals blijkt uit het ontbreken van een halo rond de prik.Het is ook mogelijk dat de geprikke stam geen bacterine secreteert voor de signaleringsassay. Er zijn twee verschillende resultaten mogelijk. In dit experiment secreteerde de geprikke stam een feromoon dat interacteerde met de histidinekinase van de overlay-stam, zoals waargenomen door de blauwe zone die de afbraak van xal in deze afbeelding aangeeft.Als het feromoon de transcriptie van de BLP-locus in de reporter-stam niet activeert, of als de geprikke stam geen feromoon secreteert, zal de afbraak van X-schaal niet optreden zoals waargenomen in deze afbeelding. Volg deze procedure. Andere methoden zoals mutatieanalyse of sequencing kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of enige waarneembare remmende activiteit kan worden toegeschreven aan de BLP-locus of een gebrek aan activiteit als gevolg van een mutatie in het transportgen.

using-overlay-assay-to-qualitatively-measure-bacterial-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Hockett, K. L., and Baltrus, D. A. Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for detecting bacteriocin-mediated killing by spotting supernatant from an antibiotic-induced donor strain onto a soft agar overlay containing a test strain. Clear zones formed after incubation indicate bacterial inhibition.

Soft Agar Overlay Assay for Detecting Bacteriocin-Mediated Killing in Pseudomonas syringae

This video demonstrates the detection of bacteriocin-producing lactic acid bacteria derived from mouse fecal matter. The assay determines the antimicrobial activity of bacteriocin on specific bacterial strains.

Assessing the Antimicrobial Potential of Bacteriocin-Producing Murine Fecal Bacterial Isolates

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Unlike die gezien eukaryoten, er een gebrek aan studies die details membraan depolarisatie en ionenconcentratie veranderingen in bacteriën, vooral als hun kleine formaat maakt conventionele meetmethoden moeilijk. Hier hebben we detail protocollen voor toezicht op dergelijke gebeurtenissen in de grote Gram-positieve ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae met behulp van fluorescentie technieken.

Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

In vitro kan hechting assays worden gebruikt om de hechting van Streptococcus pneumoniae onderzoeken naar cel monolagen epitheliale en mogelijke acties zoals het gebruik van probiotica voor het remmen pneumococcal kolonisatie onderzoeken.

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay

Plaque-assays zijn de gouden standaard voor virale kwantificering, waarbij overdekken met gevangenisoverlagen op hostcellulaire monolagen worden gebruikt om virale titers te bepalen. Hoewel traditioneel verschillende semi-solide overlagen zijn gebruikt, tonen we hier plaque-technieken die semi-solide overlagen vergelijken met een nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose onder verschillende families van virussen.

Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

De uitgestelde groeiremtest kan worden gebruikt om het competitie-effect door één bacterieel isolaat op een ander te beoordelen. Remmen wordt gekwantificeerd door de zone van opruiming rond het remmer-producerende isolaat te meten, of kwalitatief beoordeeld door de zichtbare mate van remming te bepalen.

Latente Groei Remming Assay aan de kwantificering van bacteriën afgeleide Antimicrobials over het mededingingsbeleid

We beschrijven een eenvoudige methode voor het screenen van bacterieculturen op de productie van verbindingen die remmend werken op andere bacteriën.

Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

Deze opsonophagocytic doden test wordt gebruikt om te vergelijken het vermogen van fagocytische immuuncellen reageren op en doden van de bacteriën op basis van verschillende behandelingen en/of voorwaarden. Klassiek, dient deze bepaling als de gouden standaard voor het beoordelen van effector functies van antilichamen tegen een bacterie als opsonin aan de orde gesteld.

Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

Leer de overlay-assay om bacteriocine-activiteit en quorum sensing van Streptococcus pneumoniae te visualiseren. Deze methode biedt een snelle screening van meerdere stammen voor antimicrobiële interacties.

Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines

Meer video's verkennen