Name: Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer snelle genotypering van pasgeboren muizen en het opzetten van primaire neuronale culturen op gliacelvoedingslagen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neonataal letale muismodellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de onderzoekers van de Universiteit van Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins en Beverly Davidson voor instructies en nuttige opmerkingen met betrekking tot striatale culturen, en Drs. Kara Gordon, Nicole Bode en Pedro Gonzalez-Alegre voor genotypisatie-assistentie en discussies. We danken ook Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) voor nuttige opmerkingen met betrekking tot tatoeëren, en Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) voor nuttige opmerkingen met betrekking tot de muiscultuur. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association, het Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), de Dystonia Medical Research Foundation, de Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, de National Science Foundation en de Whitehall Foundation (N.C.H.).

OPMERKING: Alle dierlijke procedures uitgevoerd in dit onderzoek werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa. 1. Langdurig Identificatie van Muizen met behulp Tatoeëren de voetzolen <ol><li> Immobiliseren een poot met de poot pad (voetzool) tegenover de experimentator. Houd de poot met de duim en de wijsvinger. Wees voorzichtig de poot niet bekneld raken. OPMERKING: Stabiele immobilisatie is belangrijk dat de tatoeage pigment wordt in de dermis van de poot pad, dus permanent 7. </li><li> Zwabberen de poot pad met 70% ethanol op een gaasje spons of doekje. </li><li> Gelden de huid olie tot een wattenstaafje, en druk de tip tegen het oppervlak van de poot pad meerdere malen. Gebruik slechts een kleine hoeveelheid huidolie; wanneer aanwezig in grote hoeveelheden, zal voorkomen dat de tatoeagepigment de huid bereikt. </li><li> Dompel de uiteinden van de tattoo naalden in de tatoeage inkt net voorafgaandte tatoeëren. Gebruik schone, aseptische en scherpe tatoeage naalden, om de pijn en de mogelijkheid van infectie te verminderen en ook om de tatoeage te verhogen. </li><li> Terwijl de poot pad oppervlak is bedekt met de huid olie, drukt u op de tattoo naald tips verticaal en licht tegen de huid in het midden van de poot pad, en spuit de inkt meerdere keren. Zie tabel van Materialen / Apparatuur voor informatie over elektrische tatoeëren systeem. </li><li> Spray 70% ethanol op een gaas spons, druk hem voorzichtig tegen de poot aan extra tatoeage pigment te verwijderen op het huidoppervlak en inspecteren van de kwaliteit van de tattoo. Controleer of het midden van de poot pad heeft een donkere, ronde plek die afwijkt van de normale pigmentatie van de huid. Als de tatoeage is niet donker of groot genoeg voor gemakkelijk bekijken, herhaalt u de stappen voor het tatoeëren. </li></ol> 2. Genotypering Pasgeboren Muizen Met behulp van een Fast PCR Genotyping Kit <ol><li> Desinfecteren het distale uiteinde van een muis staart met 70% ethanol, gesneden 5 mm of minder van de staarttip en overgebracht naar een buis van een 8-buis strip van de soort gebruikt voor PCR. Gebruik een ongebruikte scheermesje voor elke pup om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen. Alternatief, gebruik een schaar, maar in dit geval, voorzichtig en grondig verwijderen restmateriaal op de bladen met 70% ethanol. Controleer voor bloeden. Als bloeden optreedt, gelden druk om de cut deel van de staart met een gaasje spons tot bloeden is gestopt. </li><li> Voeg 200 ul van DNA extractie-oplossing aan elke PCR buis die een monster. Zie tabel van Materialen / Apparatuur voor de samenstelling en informatie over de kit. </li><li> Plaats de buis contactdoos een PCR thermal cycler en start de DNA extractie met behulp van het volgende programma: 1 cyclus bij 55 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 min, en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: Dit is dezelfde PCR thermische cycler die later wordt gebruikt voor PCR. </li><li> Na de DNA-extractie is voltooid, verwijdert u de buis strip uit het PCR-apparaat eennd omkeren 5 keer. </li><li> Overdracht 4 pl van de oplossing (DNA-extract) van elk monster aan een niet-gebruikte buis van een 8-buis strip, en meng met: 10 ul van 2X PCR Ready Mix II, 2 pl gemengde vooruit en achteruit primers (aanbevolen bij 0,5 uM zie Tabel Materiaal / Apparatuur voor sequenties), en 4 pl nuclease-vrij H2O voor elk specimen. Spin in het kort (bijvoorbeeld, 3 sec) met behulp van een table-top centrifuge. Houd de buizen op ijs te allen tijde behalve het hanteren. </li><li> Voeren thermische fietsen. Zien Tafel van Materialen / Apparatuur voor de thermische programma. </li><li> Detecteer geamplificeerde DNA-producten. Laad de totale reactieoplossing uit de PCR (20 ul) direct in een putje van een agarosegel. Laad het molecuulgewicht merkers in een aparte goed. Toepassing van een elektrisch veld. </li><li> Verwerven fluorescentie beelden van de banden onder ultraviolet licht. </li></ol> 3. Primaire Cultuur van de hersenen van muizen Neurons op Gliale Feeder Layer OPMERKING: De procedures voor de hersenen dissectie en celdissociatie (3.1) zijn gemeenschappelijk voor alle verdere procedures. De procedures voor muizen glialculturen (3.2), ratten gliale culturen (3.3) en muis neuronale kweken (3,4) worden afzonderlijk daarna beschreven. <ol><li> Brain Dissection en Cellulaire Dissocaiation <ol><li> Offeren een muis of rat pup door onthoofding, het snel verwijderen van de hersenen, en plaats deze in Hanks &#39;oplossing (zie tabel 1 voor de samenstelling) + 20% foetaal serum (FBS) in een schaal van 35 mm (op ijs bewaard). </li><li> Snijd de hersenen door middel van de middellijn in twee hersenhelften. Verwijder het gebied van belang (bijvoorbeeld cerebrale cortex, striatum en hippocampus) van elke hersenhelft. Verwijder de hersenvliezen en grote bloedvaten van het oppervlak. Snijd de hersenen regio in 4-10 dunne plakjes met een chirurgisch mes. </li><li> Spoel de plakjes hersenen in een 15 ml centrifugebuis, eens with Hanks &#39;oplossing + 20% FBS, vervolgens 3 keer met Hanks&#39; oplossing (dus zonder serum) (alle bij 4 ° C). Spoelen, voeg 5-10 ml oplossing, laat de hersenplakken bezinken op de bodem van de buis zuigen de oplossing van boven, en voeg een verse oplossing. Beëindig de spoelen procedure door opzuigen van de oplossing. </li><li> Filtreer 2 ml trypsine bevattende digestie oplossing (zie tabel 1 voor samenstelling) met een 3 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct in de buis met de hersencoupes. Laat de trypsine verlopen gedurende 13 min bij kamertemperatuur. </li><li> Neutraliseer de trypsine oplossing eerst door afzuigen meeste en vervolgens door toevoeging van 7-10 ml Hanks &#39;oplossing + 20% FBS (4 ° C). </li><li> Spoel de hersenen plakjes, tweemaal met Hank&#39;s oplossing + 20% FBS, en vervolgens driemaal met Hanks &#39;oplossing (zonder serum) (alle bij 4 ° C). Beëindig de spoelen procedure door het opzuigen van de solution. </li><li> Filtreer 2 ml van de dissociatie oplossing (zie tabel 1 voor samenstelling) met een 3 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct aan de buis met de hersencoupes. </li><li> Mechanisch dissociëren de cellen door zachtjes wrijven 10-20 maal, totdat zichtbare weefselstukken verdwijnen. Gebruik een katoenen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet en voorkomen dat bellen tijdens het aanwrijven. </li><li> Wacht 3 min voor kleine stukken om te settelen. </li><li> Breng de meerderheid van de oplossing (~ 1.5 ml, waardoor enkele oplossing onderaan) aan een 15 ml centrifugebuis dat 3 ml Hanks &#39;oplossing + 20% FBS oplossing (4 ° C) bevat, met het katoen aangesloten, brand- gepolijste Pasteur pipet. Laat de oplossing niet overdragen omdat de opname van bezinksel op de bodem resulteert typisch in verslechtering van de cultuur. </li><li> Centrifugeer gedurende 13 minuten bij ~ 185 g (~ 1100 rpm) bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant voorzichtigVoeg 1 ml voorverwarmde plaatmedium (37 ° C) om de pellet en resuspendeer door enige malen waarbij katoen aangesloten, vuur gepolijste Pasteur pipet voorzichtig pipetteren. OPMERKING: Drie verschillende types van uitplaatmedia worden gebruikt voor verschillende doeleinden cultuur: plaatmedium-1 van muizen gliacellen, plaatmedium-2 voor muis neuronen en plaatmedium-3 voor ratten neuronen en gliacellen (zie tabel 1 voor samenstellingen) . </li><li> Neem 10 pi van de celsuspensie, mengen met 10 gl 0,4% trypan blauwe oplossing en meet de dichtheid van levende cellen, met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. </li></ol></li><li> Muis glialculturen <ol><li> Was de dekglaasjes te helpen bij het vaststellen gezonde culturen van de muis cellen. <ol><li> Dompel dekglaasjes (rond, 12 mm diameter) in 70% salpeterzuur in een glazen petrischaal. Beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie en plaats deze op een schudapparaat O / N. </li><li> Spoel het glas coverslips in de petrischaal minstens driemaal met gedestilleerd water. Dompel ze in gedestilleerd water. Zet de schaal op een schudapparaat O / N. </li><li> Droog de dekglaasjes op een Whatman 150 mm filter papier in de biologische veiligheid kabinet. </li><li> Autoclaaf de dekglaasjes. </li><li> Plaats de dekglaasjes in 24-well cultuur schotel. </li></ol></li><li> Label en genotype pasgeboren muizen volgens de stappen 1 en 2. </li><li> Haal de hersencellen van de muizen pups, volgens stap 3.1. LET OP: Het gebruik van de cerebrale cortex is typerend voor de voorbereiding van de muis gliale feeder-laag. Echter, andere hersengebieden, zoals hippocampus en striatum zal werken en na correctie van celdichtheid door verschillende aantallen en opbrengsten van cellen uit verschillende gebieden. </li><li> Voeg ~ 4 ml voorverwarmde plaatmedium-1 aan de uiteindelijke celsuspensie (~ 1 ml). Voor voorverwarmen kweekmedia, plaats de oplossing in de incubator (5% CO2 -95% O2, 37 ° C) O / N teHierdoor kan de temperatuur en de pH te stabiliseren. </li><li> Breng de celsuspensie om een ​​niet-gecoate T25 kolf, met behulp van de katoen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet. Plaats de kolf in de incubator. </li><li> 1 dag in vitro (DIV), spoel de gekweekte cellen in de T25 kolf tweemaal met plaatmedium-1 (4 ° C). Plaats de kolf terug in de incubator. Voer spoelen door opzuigen het medium in de hals is met een Pasteur pipet toevoegen ~ 5 ml vers medium en voorzichtig kantelen van de kolf meerdere keren in een wervelende beweging. </li><li> Bij 6-9 DIV, (dat wil zeggen, een dag voor trypsinisatie en plating op dekglaasjes, in stappen 3.2.8-3.2.13), plaats 100 ul van het bekledingsmateriaal met extracellulaire matrix eiwitten (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor opmerkingen over het deklaagmateriaal) op de dekglaasjes in een kweekschaal, en zet de kweekschaal in de incubator. </li><li> 7-10 DIV, wanneer de cellen 20-40% samenvloeiing (ruimtelijk continue), trypsinize hen. <ol><li> Spoel de kolf eenmaal door afzuigen alle vloeistof in de kolf en het toevoegen van ~ 13 ml Hanks &#39;oplossing (4 ° C), voorzichtig kantelen de kolf meerdere keren in een wervelende beweging en volledig zuig de oplossing. </li><li> Voeg 40 ul DNase oplossing (eindconcentratie 750 eenheden / ml) aan 4 ml trypsine-EDTA-oplossing, laat de oplossing door een 0,2 urn spuitfilter en voeg het filtraat direct op de cellen in de kolf. </li><li> Laat de trypsine verlopen gedurende 13 min bij 37 ° C in de incubator. </li><li> Neutraliseer de trypsine-oplossing door toevoeging van 2 ml van 100% FBS (4 ° C) aan de kolf. </li><li> Breng de cellen getrypsiniseerd een 15 ml centrifugebuis met een 5- tot 10 ml pipet ~ 4 ml Hanks &#39;oplossing + 20% FBS (4 ° C), centrifugeer bij ~ 185 g en 4 ° C gedurende 13 min en zuig het supernatant. </li></ol></li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml vooraf Warmed plaatmedium-1. </li><li> Meet de dichtheid van de cellen volgens stap 3.1.13. </li><li> Zuig het bekledingsmateriaal volledig uit de dekglaasjes en plaat ~ 50 ul van de geresuspendeerde gliale cellen op dekglaasjes. OPMERKING: Deze cellen zullen de gliale feeder-laag vast te stellen. </li><li> Plaats de cultuur schotel met dekglaasjes in de couveuse. </li><li> 20-60 min later, voeg 1 ml voorverwarmde plaatmedium-1 aan elk putje, en zet de schaal terug in de incubator. Opmerking: Als het plateren medium wordt toegevoegd, zal het nuttig zijn om een ​​pipet om druk de omtrek van het dekglaasje (waar geen geplateerd cellen), zodat het dekglaasje niet drijven in het medium. </li><li> Op 1 DIV van de gliale feeder layer (dat is op de glazen dekglaasje), het medium vervangen door 1 ml voorverwarmde plaatmedium-1, door opzuigen alle oplossing in een goed en vervolgens vullen met vers medium. </li><li> 2-3 DIV van de gliale feeder-laag als de CELls zijn 80-100% confluent, voeg Antimitoticum (10 pl van een mengsel van 5-fluor-2&#39;-deoxyuridine + uridine; eindconcentraties van 81,2 en 204,8 uM, respectievelijk) aan elk putje, DNA replicatie en derhalve remmen onderdrukken gliale-celproliferatie. </li><li> Bij 7-9 DIV, wanneer de cellen 90-100% confluent (1-2 uur voor uitplaten neuronen op de gliale feeder layer), vervang het kweekmedium met voorverwarmd plaatmedium-2 (37 ° C). OPMERKING: Neuronen worden verzilverd op dezelfde dag, met behulp van stap 3.4. </li></ol></li><li> Rat glialculturen <ol><li> Coat een T25 kolf met dezelfde coating materiaal. Opmerking: Dit is nodig voor latere verwijdering van niet-hechtende cellen in stap 3.3.5. <ol><li> Voeg 2,0 ml van het bekledingsmateriaal aan de kolf en plaats de kolf in de incubator. </li><li> Na 2-3 uur, zuig het bekledingsmateriaal volledig, zodat de bodem van de kolf droog. </li></ol></li><li> Het verkrijgen van de cellenvan het jonge ratten, volgens stap 3.1. OPMERKING: De CA3-CA1 regio van de hippocampus wordt gebruikt voor het bereiden van de rat gliale feeder-laag. Echter, andere hersengebieden, zoals de cerebrale cortex en striatum, werkt na correctie voor verschillen in celdichtheid door verschillende aantallen en opbrengsten van cellen uit verschillende gebieden. </li><li> Voeg ~ 4 ml voorverwarmde plaatmedium-3 aan de uiteindelijke celsuspensie (~ 1 ml). </li><li> Breng de celsuspensie in de gecoate T25 kolf, met behulp van de katoen aangesloten, brand gepolijst Pasteur pipet. Plaats de kolf in de incubator (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C). </li><li> 2-3 DIV, wanneer cellen 20-40% confluent, verwijder niet-klevende of zwak hechtende cellen, door het sluiten van het deksel stevig schudden van de kolf krachtig ~ 10 keer, opzuigen van de oplossing en toevoeging van 4-5 ml plating middellange-3 (bij 4 ° C). Herhaal eenmaal deze procedure. Onderzoek de gekweekte cellen in de hele fles vloer (bvmet fasecontrastmicroscoop) bevestigen dat die neuronale (dwz waarvoor de buitenrand van het cellichaam weergegeven fase-heldere weergegeven) geheel verwijderd. Herhaal de procedure zo vaak als nodig is om deze cellen te verwijderen, en dan terug de kolf naar de incubator. OPMERKING: De kracht en het totale aantal &quot;shakes&quot; noodzakelijk kunnen verschillen tussen individuele onderzoekers. Het belangrijkste is niet om het totaal aantal shakes te houden aan een bepaald aantal, maar om te bevestigen dat neuron-achtige cellen worden geëlimineerd. </li><li> 6-8 DIV, wanneer cellen 90-100% confluent, passage de gliacellen door hen trypsinizing als in stap 3.2.8. </li><li> Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C), voeg 10 ml plaatmedium-3 (4 ° C) en breng de cellen getrypsiniseerd een ongecoate T75 kolf en kweken ervan in de incubator. OPMERKING: Rat gliacellen zal twee keer worden gepasseerd; daarentegen de muis gliacellen are gepasseerd eenmaal omdat ze ongezond na meerdere passages. Rat gliale cellen worden doorgekweekt in T75 kolven die niet zijn bekleed met een bekledingsmateriaal. De coating geeft rat gliacellen te snel groeien en leveren vele haarcellen (vermeende ependymale cellen), waarbij de neuronale kweekomstandigheid later zal verslechteren. </li><li> Op 17-19 DIV van gliale cultuur in een kolf (dwz 11 dagen na de passage en een dag voor trypsinisatie en plating op dekglaasjes door stappen 3.3.9-3.3.14), plaats 100 ul van het bekledingsmateriaal op ongewassen dekglaasjes ( rond, diameter 12 mm) in een kweekschaal, en zet de kweekschaal in de incubator. LET OP: Voor rat glialculturen, werd geen verschil opgemerkt in de kweekresultaten met of zonder het wassen van de dekglaasjes. </li><li> Bij 18-20 DIV gliale cultuur in een kolf (dwz 12 dagen na passage), bereid de gliale feeder-laag door trypsinizing de gekweekte cellen, volgens step 3.2.8. </li><li> Tijdens centrifugeren volledig zuig het bekledingsmateriaal van de dekglaasjes. </li><li> Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C), en meet de celdichtheid, volgens stap 3.1.13. </li><li> Pas de gliale dichtheid 10 4 levende cellen / ml, en plaat 100 pl gliale celsuspensie op het beklede dekglaasjes. OPMERKING: Deze cellen zullen de gliale feeder-laag vast te stellen. </li><li> Plaats de cultuur schotel met dekglaasjes in de incubator voor 20-60 min. </li><li> Voeg 1 ml plaatmedium-3 (4 ° C) aan elk putje, en zet de schaal terug in de incubator. </li><li> 3-4 DIV van de gliale feeder-laag, wanneer de cellen op het dekglaasje zijn 40-80% confluent, voeg 1 ml van de voorverwarmde kweekmedium (zie tabel 1 voor samenstelling) die cytosine β-D-arabinofuranoside bevat ( AraC, eindconcentratie van 4 uM) aan gliale-celproliferatie stoppen. Plaat neurons bij 7-9 DIV van de gliale feeder-laag wanneer de cellen 60-80% confluent met stap 3.4. </li></ol></li><li> Muis neuronale kweken <ol><li> Label en genotype pasgeboren muizen volgens de stappen 1 en 2. </li><li> Gebruik de muis pups voor stap 3.1. </li><li> Pas de densiteit levend celsuspensie ~ 2,0 x 10 5 cellen / ml met voorverwarmd plaatmedium-2 voor plateren op muis gliacellen, of middels plaatmedium-3 voor laag op ratten gliacellen. </li><li> Plaat de cellen op de gliale feeder layer, door voorzichtig toevoegen van de celsuspensie aan het kweekmedium van elk putje. Opmerking: Het volume van de celsuspensie worden toegevoegd, wordt bepaald door het vereiste aantal cellen in een kweek ook. Zo plaat ~ 60 ul van celsuspensie tot 12.000 cellen te bereiken / goed. </li><li> Merk op dat er geen oplossing veranderingen zijn nodig na de neuronen worden verzilverd. Wees voorzichtig verdampen van de oplossing uit de putjes voorkomen in de loop van de cultuur, door bevochtiging van de binnenkant of de incubator. </li></ol></li></ol>

De auteur (Zhengmin Huang) is de president van EZ BioResearch LLC die reagentia produceert die in dit artikel worden beschreven.

Het hier gepresenteerde protocol omvat procedures voor het tatoeëren om muizen te labelen/identificeren, voor het genotyperen van muizen uit staartpunten en voor het kweken van muizenhersenneuronen op lage dichtheid. In één ronde van experimenten met 6-8 pups vereisen deze procedures typisch ~0,5 uur, ~4 uur en ~2 uur, respectievelijk, met een totaal van 6-7 uur. Dit maakt het praktisch voor een enkele onderzoeker om alle noodzakelijke procedures te voltooien vanaf het moment van de geboorte van de pups tot het aanleggen...

Knaagdiermodellen van genetische ziekten nuttig bij het vaststellen van de normale fysiologische functies van eiwitten en nucleïnezuren, en de pathofysiologische gevolgen van defecten in deze bewezen. Voorbeelden omvatten muizen deficiënt voor eiwitten die betrokken zijn bij essentiële cellulaire functies, evenals muismodellen van aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. Toch kunnen bepaalde genetische manipulaties leiden tot neonatale sterfte kort of een paar dagen na de geboorte. In deze gevallen primaire celculturen een belangrijk instrument omdat levende cellen kunnen worden verkregen uit de embryonale of neonatale pups voor sterfte kunnen zij gedurende ten minste enkele weken in vitro, en gedurende deze tijd vroege neuronale ontwikkeling kan worden gevolgd door biochemische, functionele en morfologische experimenten. Voor de primaire kweken, kan het voordelig zijn de neuronen bij lage dichtheid plaat; dit maakt het mogelijk de individuele cellichamen, dendrieten, axonale assen en zenuw beëindiging visualiserennals bij hoge ruimtelijke resolutie. De overleving en differentiatie van neuronen bij lage dichtheid vereist gewoonlijk dat ze uitgeplaat op een gliale feeder layer, samen gekweekt met gliale cellen in afwezigheid van fysiek contact met hen, of gekweekt in medium geconditioneerd door glia 1. De oprichting van lage dichtheid neuronale culturen gliale feeder lagen kan afhankelijk snelle en betrouwbare genotypering vooraf zijn - binnen een paar uur in tegenstelling tot een paar dagen. Snelheid is vooral belangrijk wanneer de neuronale genotype moet worden aangepast aan die van een gliale feeder layer vooraf voorbereid. Als een praktisch voorbeeld, kan het nodig zijn om te beslissen welke pups waarvan genotype voor gebruik in het genereren culturen, de efficiëntie van een experiment optimaliseren. Hier laten we zien het werken protocol dat is gebruikt voor een snelle, eenvoudige en betrouwbare muis genotypering in eerdere publicaties 2-6. Muis staarten eneen commercieel verkrijgbare kit gebruikt. Dit protocol omvat één fase extractie van nucleïnezuren uit het weefsel, en vereist noch een nucleïnezuur zuiveringsstap noch het gebruik van een buffer beëindigd (&quot;stop solution). De betrouwbaarheid van deze genotyperingsmethode illustreert waarin de resultaten van een reeks proeven bij verschillen wordt geïntroduceerd ten opzichte van het uitgangsbedrag van de specimens, de leeftijd van de dieren en de lengte van de PCR amplicons. Deze kit biedt de voordelen van geautomatiseerde extractie en betrouwbaarheid. Omwille van zijn uitgebreid, wordt het gebruik van tatoeage voor identificatie van het genotype muizen lange termijn eveneens aangetoond. Tatoeage wordt bereikt door tatoeage inkt naar de dermis van de huid (onder de epidermis) 7. Een werkwijze wordt beschreven voor het tatoeëren de voetzolen van pasgeboren of 1 dag oude muizen, hoewel tatoeages kunnen worden toegepast op andere delen van het lichaam, zoals staarten en tenen, en Animals van alle leeftijden. Bovendien zullen procedures worden aangetoond plateren en kweken muis neuronen bij een lage dichtheid, gebaseerd op geoptimaliseerde bereiding van verschillende gliale feeder lagen 2,8. We maken gebruik van een genetische muismodel van de erfelijke neurologische aandoening DYT1 dystonie - een autosomaal-dominante stroming aandoening veroorzaakt door een mutatie in het gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Het gecodeerde eiwit, Torsina, behoort tot de &quot;ATPasen geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten&quot; (AAA +) familie van eiwitten, waarvan de leden doorgaans uitgevoerd chaperone-achtige functies, assisteren in: eiwitontvouwende, eiwit-complex demontage, membraantransport en vesikel fusie 10-13. De mutatie leidt tot een in-frame deletie van een codon voor glutaminezuur, en kan leiden tot manifestatie van &quot;early-onset algemene geïsoleerd dystonie &#39;14,15. De padophysiological mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze aandoening blijven slecht begrepen. In een knock-in muismodel, de mutant allel is Tor1a tm2Wtd, hierna genoemd als Tor1a AE. Heterozygote AE-Torsina knock-in muizen zijn levensvatbaar en genetisch bootsen menselijke patiënten met DYT1 dystonie, terwijl homozygote knock-in muizen na de geboorte sterven 16,17, met de latency tot postnatale dood beïnvloed door genetische achtergrond 18. De vroege dood van homozygote knock-in muizen noodzakelijk dat zowel de genotypering van dieren en de instelling van neuronale kweken snel voltooid. Als een ander voorbeeld van genotypering, Tfap2a (transcriptiefactor AP-2α activerende enhancer bindend eiwit 2α) gebruikt. De proteïne gecodeerd door dit gen is belangrijk bij het ​​reguleren meerdere cellulaire processen, zoals proliferatie, differentiatie, overleving en apoptose 19.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS - tattooing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine Cleanser</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Dit wordt gebruikt om de naalden en de houder na het tatoeëren schoon te maken.</td></tr><tr><td>Machine Drying Agent</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>Dit wordt gebruikt om de naalden en houder na het schoonmaken te drogen.</td></tr><tr><td>Neonate Tattoo Black Pigment</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Skin Prep Applicator</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Q-tip.</td></tr><tr><td>Skin Prep solution</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Deze reagent levert een dunne laag olie die de efficiëntie van het tatoeëren verbetert en tatoeage vervagen voorkomt, door (informatie van de verkoper): 1) het voorkomen dat niet-getatoeëerde huid tijdelijk wordt bevlekt, waardoor de kwaliteit van een pootkussentatoeage gemakkelijk kan worden beoordeeld voordat de pup naar zijn thuiskooi wordt teruggezet &ndash; het bevlekte huidoppervlak kan worden verward met de getatoeëerde huid, 2) het verminderen van huidbeschadiging tijdens het tatoeëren &ndash; het verzachten van de huid en het smeren van de naald helpt de naald de huid te penetreren zonder huidbeschadiging te veroorzaken, en 3) het voorkomen dat moleculair zuurstof de huid binnendringt, waardoor ontstekingsreacties op reactieve zuurstofsoorten die kunnen worden gegenereerd, worden verminderd.</td></tr><tr><td>REAGENTS - genotyping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Een rode, laadkleurstof voor elektroforese is opgenomen in de 2X PCR Ready Mix oplossing.</td></tr><tr><td>Tissue Lysis Solution A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Bereid de DNA Extractie Oplossing door 20 &micro;l van Tissue Lysis Solution A en 180 &micro;l van Tissue Lysis Solution B per monster te mengen.</td></tr><tr><td>Tissue Lysis Solution B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Bereid de DNA Extractie Oplossing door 20 &micro;l van Tissue Lysis Solution A en 180 &micro;l van Tissue Lysis Solution B per monster te mengen.</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>We gebruiken 2% agarose gels in TAE buffer met de SYBR Safe DNA gel stain (10.000 keer verdund) of ethidiumbromide (0,5 &micro;g/ml gelvolume).</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>Gebruik pipettenpunten die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Voor alle stappen waarbij DNA betrokken is, gebruik gefilterde pipettenpunten om kruisbesmetting te voorkomen.</td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Gebruik pipettenpunten die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Voor alle stappen waarbij DNA betrokken is, gebruik gefilterde pipettenpunten om kruisbesmetting te voorkomen.</td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Gebruik pipettenpunten die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Voor alle stappen waarbij DNA betrokken is, gebruik gefilterde pipettenpunten om kruisbesmetting te voorkomen.</td></tr><tr><td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>We gebruiken een van deze drie molecuulgewicht markers.</td></tr><tr><td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Gebruik buisjes die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase. Een strip met 8 buisjes is gemakkelijker te hanteren en om de monsters te groeperen dan individuele buisjes.</td></tr><tr><td>PCR tubes, Ultraflux Individual&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Gebruik buisjes die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase.</td></tr><tr><td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Gebruik buisjes die steriel zijn en vrij van DNA, RNase en DNase.</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tor1a gene in &Delta;E-torsinA knock-in mice</td><td></td><td></td><td>5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) en 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (referentie 18). Deze primers werden gebruikt bij een eindconcentratie van 1,0 ng/&micro;l (~0,16 &micro;M) (referentie 2).</td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td><td></td><td></td><td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) voor de 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) voor de 983-bp amplicon, en 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3

snelle genotypering van dieren gevolgd door vaststelling primaire culturen van neuronen in de hersenen

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Hoge-resolutie analyse van de morfologie en functie van zoogdierneuronen vereist vaak de genotypering van individuele dieren, gevolgd door de analyse van primaire kweken van neuronen. We beschrijven een reeks procedures voor: het labelen van pasgeboren muizen worden gegenotypeerd, snelle genotypering, en tot oprichting van een lage dichtheid culturen van neuronen in de hersenen van deze muizen. Individuele muizen worden gelabeld door tatoeëren, die zorgt voor langdurige identificatie blijvend in de volwassenheid. Genotypering van het beschreven protocol is snel en efficiënt en maakt geautomatiseerde extractie van nucleïnezuur goede betrouwbaarheid. Dit is nuttig in omstandigheden waarin voldoende tijd conventionele genotypering niet beschikbaar, bijvoorbeeld in muizen die lijden neonatale sterfte. Primaire neuronale culturen worden gegenereerd bij een lage dichtheid, die beeldvorming experimenten mogelijk maakt bij een hoge ruimtelijke resolutie. Deze cultuur methode vereist de voorbereiding van gliale feeder lagen voorafgaand aan neuronale plating. De pROTOCOL wordt toegepast in zijn geheel een muismodel van de bewegingsstoornis DYT1 dystonie (AE-Torsina knock-in muizen) en neuronale culturen worden bereid uit de hippocampus, cerebrale cortex en striatum van deze muizen. Dit protocol kan worden toegepast op muizen met andere genetische mutaties, alsmede dieren van andere soorten. Verder kunnen de afzonderlijke componenten van het protocol worden gebruikt voor geïsoleerde deelprojecten. Zo zal dit protocol hebben brede toepassingen, niet alleen in de neurowetenschappen, maar ook in andere gebieden van de biologische en medische wetenschappen.

Als voorbeeld van de toepassing van dit protocol, worden representatieve resultaten getoond voor het labelen van muizen door tatoeëren, betrouwbare genotypering onder verschillende experimentele omstandigheden, en tot vaststelling van primaire neuronale culturen op gliale feeder lagen. Tatoeëren Pasgeboren pups werden bestempeld op de voetzolen met een tatoeage systeem (&#39;Newborn&#39; in figuur 1). De etiketten blijft zichtbaa...

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Het algemene doel van deze procedure is om pasgeboren muizen te genotyperen en lagedichtheid neuroneculturen te genereren op een gliale feederlaag. Dit wordt bereikt door eerst snel pasgeboren muizen te genotyperen met behulp van hun staartpunten in de tweede stap. Op dezelfde dag worden de hersenen gedisseceerd en gekweekt als gliale feederlagen.Vervolgens worden na een paar weken een andere groep pasgeboren muizen snel gegenotypeerd en worden neuronale cellen gegenereerd uit de hersenen van het dier voor cultuur op de voorafgaande gliale feederlagen. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt voor snelle en betrouwbare genotypering, evenals voor het genereren van gezonde neuronen en gliacellen. Er zijn twee belangrijke voordelen van dit protocol.Eén is dat we gezonde neuronen in een zeer lage dichtheid kunnen kweken voor beeldvormingsexperimenten door ze op een gliale foetale laag te plaatsen. Het tweede voordeel is dat pasgeboren muizen in enkele uren kunnen worden gegenotypeerd, waardoor de genotypen van de neuronen en de gliale foetale laag kunnen worden gekoppeld. Ik ben onderzoeksassistent in het Harta-lab.Ik zal de procedures voor genotypering en culturen demonstreren. B

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

The video demonstrates a technique for culturing primary astrocytes from the rat cortex. The cortex is mechanically dissociated to obtain a homogeneous glial cell suspension, which is then plated on polypeptide-coated plates to promote selective proliferation of astrocytes. Subsequently, the astrocytes are enzymatically dissociated from the plates and transferred to fresh media, allowing the culture of pure astrocytes.

Generating a Primary Culture of Astrocytes from a Rat Pup Brain

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

De oorzaken van degeneratie van dopaminerge neuronen in de middenhersenen tijdens de ziekte van Parkinson zijn niet volledig begrepen. Cellulaire kweeksystemen bieden een essentieel hulpmiddel voor de studie van de neurofysiologische eigenschappen van deze neuronen. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol dat kan worden gebruikt voor in vitromodellering van neurodegeneratie.

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.

Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Leer snelle genotypering van pasgeboren muizen en het opzetten van primaire neuronale culturen op gliacelvoedingslagen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neonataal letale muismodellen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Meer video's verkennen