Name: Het bestellen van enkele cellen en Single Embryos in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Leer een nieuwe methode voor 3D-celkweek met microholte-arrays om celmorfologie en organel-dynamica te bestuderen. Deze techniek reduceert variabiliteit en verbetert high-content screening voor medicijnontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen L. Brino (IGBMC High Content Screening faciliteit, Illkirch, Frankrijk) voor het verstrekken van ons met de anti-Giantin antilichaam, M. Labouesse Lab. voor C. elegans (IGBMC) en B. Séraphin Lab. voor gist (IGBMC), E. Paluch en A. Hyman voor TL HeLa-cellen (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) en JQ Wu (Ohio State University) voor kernsplijting gistcellen; A. Hoël en F. EVENOU voor experimentele hulp, C. Rick (IBMC, Straatsburg, Frankrijk) voor technische hulp, en JC Jeannot (Femto-st, Frankrijk) voor hulp bij het microfabrication. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het CNRS, de Universiteit van Straatsburg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale en de ci-FRC van Straatsburg.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li>
<li>Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+Micropatterned+Substrates+for+Single+Cell+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies.</a> PLoS ONE. 7, e37548(2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cell+spreading+within+3D-micropatterned+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments.</a> Lab Chip. 11, 805-812 (2010).</li>
<li>Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Engineered+3D+Scaffolds+for+Cell+Culture+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies.</a> Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 12, 458-465 (2013).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat Meth. 7, 969-971 (2010).</li>
<li>Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).</li>
<li>Ochsner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-well+arrays+for+3D+shape+control+and+high+resolution+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells.</a> Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).</li>
<li>Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).</li>
<li>Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotech%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfe%2C+D+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).</li>
<li>Mehling, M., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Biotech%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture.</a> Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).</li>
<li>Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Still+and+rotating+myosin+clusters+determine+cytokinetic+ring+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction.</a> Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+single+cells+identifies+a+rare+subset+of+circulating+tumor+cells+with+malignant+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits.</a> Integr Biol. 6, 388-398 (2014).</li>
<li>Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">The promise of single-cell sequencing.</a> Nat Meth. 11, 25-27 (2014).</li>
<li>Allen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell-free+extracts+of+Xenopus+eggs+and+demembranated+sperm+chromatin+for+the+assembly+and+isolation+of+in+vitro-formed+nuclei+for+Western+blotting+and+scanning+electron+microscopy+%28SEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM).</a> Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).</li>
<li>Robbins, E., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotically+Synchronized+Mammalian+Cells%3A+a+Simple+Method+for+Obtaining+Large+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations.</a> Science. 144, (1964).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein%2C+the+protein+that+binds+the+3%26%2334%3B+end+of+histone+mRNA%2C+is+cell+cycle+regulated+by+both+translational+and+posttranslational+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3&#34; end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Temporal+and+Spatial+Control+of+Cytokinesis+with+a+Myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor.</a> Science. 299, 1743-1747 (2003).</li>
<li>Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoint+kinase+1+%28Chk1%29+is+required+for+mitotic+progression+through+negative+regulation+of+polo-like+kinase+1+%28Plk1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1).</a> Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).</li>
<li>Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRT-1%2FCalreticulin+and+the+E3+Ligase+EEL-1%2FHUWE1+Control+Hemidesmosome+Maturation+in+C.+elegans+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development.</a> Curr Biol. 20, 322-327 (2010).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> JoVE. , e4019(2012).</li>
<li>Saha, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin-related+protein+Mid1p+coordinates+the+assembly+of+the+cytokinetic+contractile+ring+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).</li>
<li>Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Drug+Efficacy+and+Toxicology+in+Three+Dimensions%3A+Using+Synthetic+Extracellular+Matrices+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery.</a> Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).</li>
<li>Futamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphobase%2C+an+Encyclopedic+Cell+Morphology+Database%2C+and+Its+Use+for+Drug+Target+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification.</a> Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Replica vormstuk werd gebruikt om de &#39;eierdopjes&#39; fabriceren. Het fabricageproces niet een schone kamer nodig; het is eenvoudig, hoewel enige oefening vereist zijn. Vooral vrijgeven van de PDMS stempel is de meest kritische stap om een ​​groot gebied van hoge kwaliteit &quot;eggcups &#39;produceren. Daarom speciale zorg moet worden genomen in deze stap. Als deze stap herhaaldelijk faalt, overweeg dan om het plasma schoner parameters voorafgaand aan de silanisatie en plasma binding te optimaliseren. Onvoldoende s...

Huidige in vitro op cellen gebaseerde assays zijn tweedimensionale (2D). Deze configuratie is niet natuurlijk voor zoogdiercellen en dus niet fysiologisch relevant 1; cellen vertonen een diversiteit aan vormen, maten en heterogene fenotypes. Zij presenteren op ernstige beperkingen bij toepassing op screening toepassingen, zoals een wanordelijke verdeling binnen het vliegtuig en extreme fenotypes van cellulaire organellen (stress vezels, in het bijzonder). Dit is vooral belangrijk bij klinische proeven voor het testen van geneesmiddelen, waarbij hoge budgetten jaarlijks worden uitgegeven. De meeste van deze geneesmiddelen echter niet wanneer toegepast op diermodellen vanwege de kunstmatige 2D kweekomstandigheid in een vroege drug discovery. Bovendien gegevens geven specifieke celorganellen kan niet goed zichtbaar, zoals cytokinetic actomyosine ring tijdens celmitose en algemeen structuren die evolueren in het vlak loodrecht op het vlak van waarneming. sommigenieuwe 2D assays zijn om te overwinnen de bovengenoemde nadelen en belangrijke inzichten cytoskelet organisatie waargenomen 2,3 voorgesteld. Echter, deze testen nog onderhavige serieuze beperking: cellen vertonen een fenotype spreiding in tegenstelling tot wat wordt waargenomen in vivo, waarbij cellen vormen een 3D architectuur. Deze artefacten in verband met de kweekmethode kan niet-fysiologische functies te sturen, zoals verhoogde stress-vezels 1,4,5. Driedimensionale celcultuur assays om talrijke voordelen ten opzichte van 2D omgevingen 6,7. Ze zijn fysiologisch relevanter en resultaten zijn daarom zinvol. Als voorbeeld, cellen ingebed in hydrogels tonen 3D-structuren maar hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere 8,9. Echter, hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere, waarbij het screenen bemoeilijkt. Een alternatieve strategie is om insluiten enkelcellen in microfabricated holten 10,11. Cell positie, vorm, polariteit en de interne organisatie cel kan vervolgens genormaliseerd worden. Naast het verstrekken van 3D-achtige architectuur aan cellen, microcaviteiten maakt het ook mogelijk voor high-gehalte screening studies 10,12-14; enkele cellen kunnen worden besteld in microarrays en cellulaire organellen en hun evoluties kunnen parallel worden waargenomen. Deze regelmaat biedt goede statistieken met een gering aantal cellen en betere temporele / ruimtelijke resoluties. Bruikbare verbindingen zijn gemakkelijker betrouwbaar te identificeren. In deze studie tonen we de fabricage en toepassing van een nieuwe 3D-achtige enkele cellen kweeksysteem voor high-content-screening toepassingen 10,12,13. De inrichting bestaat uit een matrix van elastomeer microcavities (10 holten 5 / cm 2), bedacht &#39;eierdopjes (EC). Afmetingen en de totale omvang van de EC in dit werk zijn geoptimaliseerd om de typische volume van één NIH3T3 en HeLa-cellentijdens de celdeling. Morfologie van de holten - cilindrische - is geselecteerd goed oriënteren celvorm voor de visualisatie van actieve processen. Replica gieten wordt gebruikt voor het patroon van een array van de EG op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een glazen dekglaasje 15,16. De cellen worden in de EG geïntroduceerd door centrifugeren. Wij rapporteren hier observatie en normalisatie van cellulaire organellen (actine stressvezels, Golgi-apparaat en nucleus) in 3D (EG) in vergelijking met dezelfde cellen 2D (vlakke) oppervlakken. Wij rapporteren ook de waarneming van actieve dynamische processen zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic actomyosine celmitose 17. Tot slot laten we resultaten van deze methodologie op andere systemen met vaste wanden, zoals gist, splijtgist en C. elegans embryo&#39;s die de toepasbaarheid van onze methodologie bevestigt aan een breed scala van modelsystemen. We naast een gedetailleerd en uitputtend pROTOCOL om te fabriceren en de &#39;eierdopjes &quot;3D microfabricatie toepassing. Onze benadering is eenvoudig en vereist geen schone ruimte nodig. We verwachten dat deze nieuwe methode met name interessant voor drug screeningstesten en gepersonaliseerde geneeskunde zal zijn, ter vervanging van petrischaaltjes. Tenslotte zal ons apparaat bruikbaar voor het bestuderen van de verdelingen van cellen reacties op externe stimuli, bijvoorbeeld kanker 18 en fundamenteel onderzoek 19 zijn.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrapuur)</td><td>Millipore</td><td>-</td><td>Gebruik altijd vers water.</td></tr><tr><td>Parafilm (kunststoffolie)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Hecht Parafilm aan het laboratoriumblad met enkele waterdruppels en zorg voor een perfect vlakke oppervlakte.</td></tr><tr><td>Fotomasker</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="RANGE!D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Siliconen wafer</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 fotoresist</td><td>MicroChem</td><td>2000 serie</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp;</a></td></tr><tr><td>Werken in een afzuipkast is vereist; raadpleeg de gegevensbladen van de fabrikant voor meer informatie.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 ontwikkelaar</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp;</a></td></tr><tr><td>Werken in een afzuipkast is vereist; raadpleeg de gegevensbladen van de fabrikant voor meer informatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp;region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp;region=CA</a></td></tr><tr><td>Beschikbaar bij meerdere bedrijven.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (siliconiseringsreagens)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp;region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp;region=FR&nbsp;</a></td></tr><tr><td>Schadelijk, werken in een afzuipkast is vereist; raadpleeg de gegevensbladen van de fabrikant voor meer informatie.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorot rimethylsilaan (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&amp;region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS veroorzaakt acute inhalatie- en dermale toxiciteit, en is zeer ontvlambaar (met mogelijkheid tot ontstekingsfeedback over aanzienlijke afstanden), daarom moet het in een afzuigkast worden gebruikt, weg van ontstekingsbronnen</td></tr><tr><td>Nitrilhandschoenen</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>Beschikbaar bij meerdere bedrijven.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes #0</td><td>Knittel glass</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Zeer kwetsbaar. Voorzichtig hanteren.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scherpe rechte pincetten</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>50 ml buis</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Beschikbaar bij meerdere bedrijven.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 kit</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN&nbsp;</a></td></tr><tr><td>De verpakking bevat zowel PDMS-basis als uithardingsmiddel. Vergelijkbare elastomeren zijn verkrijgbaar bij meerdere bedrijven.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoop glasplaatjes</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Beschikbaar bij meerdere bedrijven.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoog-glucose medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&amp;keyWord=41965-039&amp;store=Scientific&amp;nav=0&amp;offSet=0&amp;storeId=10652&amp;langId=-1&amp;fromSearchPage=1&amp;searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&amp;keyWord=41965-039&amp;store=Scientific&amp;nav=0&amp;offSet=0&amp;storeId=10652&amp;langId=-1&amp;fromSearchPage=1&amp;searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Rund kalfs serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp;region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp;region=CA</a></td></tr><tr><td>0.25% Trypsine-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp;store=Scientific&amp;nav=0&amp;offSet=0&amp;storeId=10652&amp;langId=-1&amp;fromSearchPage=1&amp;searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp;store=Scientific&amp;nav=0&amp;offSet=0&amp;storeId=10652&amp;langId=-1&amp;from

het bestellen van enkele cellen en single embryo&#39;s in 3d opsluiting: een nieuw apparaat voor high content screening

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biologische cellen worden gewoonlijk waargenomen op vlakke (2D) oppervlakken. Deze voorwaarde is niet fysiologische en fenotypes en vormen zijn zeer variabel. Screening op basis van cellen in dergelijke omgevingen hebben dus ernstige beperkingen: celorganellen tonen extreme fenotypes cel morfologie en grootte zijn heterogeen en / of specifieke celorganellen niet goed zichtbaar is. Bovendien, cellen in vivo in een 3D-omgeving; in deze situatie cellen vertonen verschillende fenotypen vooral door hun interactie met de omringende extracellulaire matrix van het weefsel. Om standaardiseren en genereren orde van enkele cellen in een fysiologisch relevante 3D omgeving voor cel-gebaseerde testen, beschrijven we hier de microfabricage en toepassingen van een inrichting voor in vitro 3D celkweek. Deze inrichting bestaat uit een 2D reeks microcavities (gewoonlijk 10 5 holten / cm 2), elk gevuld met losse cellen of embryo&#39;s. cel positie, vorm, polariteit en de interne organisatie van de cel worden dan genormaliseerd met een 3D-architectuur. We gebruikten replica molding patroon een reeks van microcaviteiten, &#39;eierdopjes&#39;, op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een dekglaasje. Holtes waren bedekt met fibronectine hechting vergemakkelijken. Cellen werden ingebracht door centrifugeren. Vervullingspercentage werd geoptimaliseerd voor elk systeem waardoor tot 80%. Cellen en embryo levensvatbaarheid werd bevestigd. Wij pasten deze methode voor de visualisatie van cellulaire organellen zoals kern en Golgi apparaat en actieve processen, zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic celmitose bestuderen. Dit apparaat kon de identificatie van nieuwe functies, zoals periodieke ophopingen en inhomogeniteiten van myosine en actine tijdens de cytokinetic ring sluiting en verdicht fenotypes voor Golgi en de kern uitlijning. Wij karakteriseerden de werkwijze voor zoogdiercellen, splijtgist, gist, C. elegans wide specifieke aanpassing in elk geval. Tenslotte, de kenmerken van dit apparaat worden bijzonder interessant voor screeningstesten voor geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde.

De &#39;eierdopjes&#39; (EC) zijn een nieuwe high content-screening methodiek die de visualisatie van georiënteerde cellen en embryo&#39;s mogelijk maakt in een 3D omgeving. Daarnaast is een aantal cellulaire processen, die moeilijk te observeren standaard 2D (plat) culturen waar te nemen van deze nieuwe werkwijze. Figuur 1a toont een samenvatting van de procedure voor de EC microfabricatie (zie paragraaf 1 in het hierboven beschreven protocol ). De methode is eenvoudig, snel, efficiënt en zonder vereis...

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de morfologie en dynamica van cellulaire organellen op een reeks microholtes te observeren die het 3D-milieu nabootsen dat wordt aangetroffen in fysiologische omstandigheden. Voor cellen met stijve wanden, zoals splitsingsgist, kunnen holtes cellulaire structuren ordenen en oriënteren. Dit wordt bereikt door eerst een reeks PDMS-pijlers te fabriceren vanuit een master om een reeks PDMS-microholtes te verkrijgen, aangeduid als eiercups, door replica-maling.Als tweede stap worden de eiercups gefunctionaliseerd met eiwitten van de extracellulaire matrix en in een buis geïntroduceerd met een cilindrisch, op maat gemaakt plastic stuk, dat het microholte-monster ondersteunt en de introductie van individuele zoogdiercellen op elk van de microholtes mogelijk maakt. Vervolgens worden de met cellen gevulde eiercups verwijderd en geïncubeerd met het medicijn of de verbinding van belang om het fenotype en dynamische processen van cellen in een 3D-beperking te bestuderen. Er worden resultaten verkregen die verschillen in celfenotype en nieuwe dynamische structuren tonen in vergelijking met standaard 2D in vitro-assays op basis van de oriëntati

ordering-single-cells-single-embryos-3d-confinement-new-device-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Leer een nieuwe methode voor 3D-celkweek met microholte-arrays om celmorfologie en organel-dynamica te bestuderen. Deze techniek reduceert variabiliteit en verbetert high-content screening voor medicijnontwikkeling.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo's in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Meer video's verkennen