Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo's in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening
18 september 2016
Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de morfologie en dynamica van cellulaire organellen op een reeks microholtes te observeren die het 3D-milieu nabootsen dat wordt aangetroffen in fysiologische omstandigheden. Voor cellen met stijve wanden, zoals splitsingsgist, kunnen holtes cellulaire structuren ordenen en oriënteren. Dit wordt bereikt door eerst een reeks PDMS-pijlers te fabriceren vanuit een master om een reeks PDMS-microholtes te verkrijgen, aangeduid als eiercups, door replica-maling.
Als tweede stap worden de eiercups gefunctionaliseerd met eiwitten van de extracellulaire matrix en in een buis geïntroduceerd met een cilindrisch, op maat gemaakt plastic stuk, dat het microholte-monster ondersteunt en de introductie van individuele zoogdiercellen op elk van de microholtes mogelijk maakt. Vervolgens worden de met cellen gevulde eiercups verwijderd en geïncubeerd met het medicijn of de verbinding van belang om het fenotype en dynamische processen van cellen in een 3D-beperking te bestuderen. Er worden resultaten verkregen die verschillen in celfenotype en nieuwe dynamische structuren tonen in vergelijking met standaard 2D in vitro-assays op basis van de oriëntatie van cellen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard 2D-celcultuurassays, is dat zoogdiercellen in eiercups een 3D-omgeving ervaren die vergelijkbaar is met de logische micro-omgevingen, maar gerangschikt zijn in een geordende en gestandaardiseerde graad. Orde en oriëntatie zijn ook aanzienlijke verbeteringen in het geval van splitsingsgist. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celskelet en medicijnontdekking, zoals het identificeren van nieuwe en anti-kankermedicijnen met hoog inhoud screening.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een diagnose van multifactoriële ziekten zoals kanker, omdat medicijnscreeningassays gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd en geanalyseerd door middel van eiercups, waardoor deze methode bijzonder interessant is voor gepersonaliseerde geneeskunde. Deze methode kan inzicht bieden in georganiseerde structuren en dynamica in individuele zoogdiercellen en splitsingsgistcellen, en kan ook worden toegepast op het organiseren van studie, ontwikkelende embryo's zoals C. elegans en ri-so-flu-a. In dit protocol wordt een reeks microholtes of eiercups gepatroond op een polydimetylsiloxaan of PDMS-laag die is vastgemaakt op een dekglas door replica-maling.
De eerste stap is de fabricage van de master, die niet zal worden getoond, maar wordt beschreven in het tekstprotocol. Zodra de master is gemaakt, is de volgende stap het fabriceren van de PDMS-replica. Meng in een buis van 50 milliliter de cross-linker en de prepolymer grondig in een verhouding van een op tien gewicht op gewicht of volume op volume voor een totaal van 30 gram.
Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 1.800 keer g om luchtbellen te verwijderen. Laat het PDMS voorzichtig op de master vallen. Als er bellen verschijnen, ontgast u het mengsel.
Plaats het monster in een oven op 65 graden Celsius gedurende vier uur. Nadat het PDMS is uitgehard, gebruikt u een scalpel om voorzichtig het gebied van belang van ongeveer een vierkante centimeter te snijden, dat ongeveer 10 tot de vijfde microholtes of eiercups omvat. Trek de PDMS-stempel voorzichtig af.
Om de procedure voor replica-maling te beginnen, activeert u de PDMS-stempel door middel van zuurstofplasbehandeling gedurende 30 seconden. Bewaar de geactiveerde stempel tijdelijk in een gesloten petrischaal om afzetting van stof te voorkomen. Werk in een afzuigingskast, plaats de geactiveerde PDMS-stempel met de kant met de structuren naar boven of op zijn kop in een petrischaal naast een dop van 15 milliliter.
Vul de dop met 200 microliter trimethylchloorsilaan. Sluit de petrischaal en laat de stempel zeven minuten zout worden. Plaats de PDMS-stempel op de spin coater met de structuren op hun kop.
Doe een kleine druppel vloeibaar PDMS bovenop de structuren. Spin coat bij 1500 RPM gedurende 30 seconden om een dunne laag PDMS bovenop de structuren af te zetten. Plaats de stempel in de oven op 65 graden Celsius gedurende vier uur om de afgezet spin-coated PDMS-laag uit te harden.
Activeer vervolgens de dunne PDMS-laag door de PDMS-stempel op zijn kop samen met een glazen dekglas in een zuurstofplasreiniger gedurende 30 seconden te plaatsen. Plaats de stempel onmiddellijk in contact met het glazen dekglas en druk voorzichtig met behulp van pincetten rondom het oppervlak van de stempel voor de binding. Houd daarna een constante druk op de bovenkant van de stempel gedurende ongeveer 10 seconden.
30 minuten later, trek voorzichtig de stempel uit de dekglas om de eiercups te bevrijden. Wees heel voorzichtig om het monster niet te breken. Spoel de eiercups grondig af met ethanol en droog ze af.
Als PDMS-eiercups zich niet op het glazen dekglas bevinden en tijdens de ontpinnen-stap loskomen, overweeg dan om de instellingen van de plasmareiniger aan te passen en de procedure voor replica-maling opnieuw te starten. Om de manipulatie van het monster later te vergemakkelijken, wordt aanbevolen om een klein stukje uitgehard PDMS aan de rand van het dekglas te lijmen. In het geval van zoogdiercellen die in deze video worden gepresenteerd, moet het PDMS-oppervlak worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten van de extracellulaire matrix.
Hydrofiliseer de eiercups in de zuurstofplasreiniger gedurende 30 seconden. Steriliseer vervolgens de eiercups met ultraviolet licht gedurende vijf minuten. Deponeer een kleine druppel fibronectine-oplossing om het hele eiercupgebied te bedekken en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.
Bescherm het monster tegen uitdroging. Spoel de eiercups voorzichtig af met ongeveer een milliliter PBS, met behulp van een plastic doseerpipet. Herhaal dit in totaal drie keer.
Plaats vervolgens een op maat gemaakte cilindrische plastic stuk in een buis van 50 milliliter. Voeg 13 milliliter celkweekmedium toe aan de buis. Het medium
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw apparaat en een methode voor het onderzoeken van cellulaire morfologie en dynamiek in een 3D-omgeving. Door gebruik te maken van microcavity-arrays kunnen individuele cellen nauwkeurig worden geordend, wat zorgt voor een betere oriëntatie van organellen en een verminderde variabiliteit in vergelijking met standaardassays.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- 3D-celkweek
Achtergrond
- Het begrijpen van cellulaire dynamiek is cruciaal voor biologisch onderzoek.
- Standaard 2D-assays slagen er vaak niet in om fysiologische condities te repliceren.
- 3D-omgevingen kunnen de studie van het gedrag van organellen verbeteren.
- Microcavity-arrays bieden een gecontroleerde setting voor celstudies.
Doel van de studie
- Om de morfologie en dynamiek van cellulaire organellen te observeren.
- Om een 3D-omgeving te creëren die fysiologische omstandigheden nabootst.
- Om het celgedrag in 3D te vergelijken met traditionele 2D-assays.
Gebruikte methoden
- Fabricage van PDMS-microcavity-arrays via replica molding.
- Functionalisatie van microcavities met extracellulaire matrixeiwitten.
- Introductie van individuele zoogdiercellen in de microcavities.
- Incubatie met geneesmiddelen om cellulaire responsen te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Verschillen in het celphenotype werden waargenomen bij opsluiting in 3D.
- Nieuwe dynamische structuren werden geïdentificeerd in vergelijking met 2D-assays.
- De methode minimaliseerde de variabiliteit in de celoriëntatie.
- Er werd een verbeterd inzicht in de organeldynamiek bereikt.
Conclusies
- De methode met microcavity-arrays biedt een aanzienlijke vooruitgang in celstudies.
- 3D-omgevingen zijn essentieel voor nauwkeurige biologische beoordelingen.
- Deze aanpak zou kunnen leiden tot verbeterde drugstesten en cellulaire analyse.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Standaard 2D-celkweekassays beperken de fenotypische reproduceerbaarheid en maskeren organeldynamiek vanwege niet-fysiologische groeiomstandigheden. Dit microcavity-array-apparaat maakt geordende opsluiting van individuele cellen mogelijk in een omgeving die een 3D-extracellulaire matrix nabootst, waardoor morfologische heterogeniteit wordt verminderd en de detectie van subcellulaire structuren en dynamische processen wordt verbeterd. De verbeterde fenotypische consistentie ondersteunt betrouwbaardere high-content screening en mechanistische risicoreductie in de vroege fasen van geneesmiddelenontwikkeling.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch O&O
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de celpositie, vorm, polariteit en interne organisatie te normaliseren in een fysiologisch relevante 3D-context.
- Operationele waarde: Vermindert biologische ruis door heterogene celmorfologieën, waardoor de betrouwbaarheid van read-outs voor target-engagement en pathway-modulatie wordt verbeterd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de visualisatie van organellen zoals de nucleus en het Golgi-apparaat en de detectie van nieuwe dynamische structuren, zoals periodieke myosinaccumulaties tijdens de sluiting van de cytokinetische ring.
- Operationele waarde: Standaardiseert de celpreparatie via centrifugatie-gebaseerde vulling, waarbij een bezetting tot 80% wordt bereikt met een reproduceerbare levensvatbaarheid bij zoogdiercellen, gist en embryo's.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Onthult door geneesmiddelen geïnduceerde fenotypes die in 2D gemaskeerd blijven, zoals de effecten van Blebbistatin op de reductie van stressvezels en nucleaire oriëntatie, wat mechanistische risicoreductie mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt adaptatie aan diverse modelsystemen, waaronder fissiegist, buddinggist en C. elegans, waardoor de preklinische relevantie wordt verbreed.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het apparaat slaat de brug tussen vroege ontdekking en lead-identificatie door gestandaardiseerde 3D-beperkte cellulaire systemen te bieden die de assay-gereedheid en dataconsistentie verbeteren voorafgaand aan compound-screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests via geordende arrays die subcellulaire dynamiek verduidelijken en variabiliteit in de oriëntatie van organellen verminderen.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via uniforme microcaviteitsafmetingen (105 caviteiten/cm2) en functionalisering van de extracellulaire matrix met fibronectine.
- Analytics: Genereert kwantitatieve morfologische en dynamische readouts (bijv. nucleus sfericiteit, Golgi-compactie, actin/myosine-ringdynamiek) voor vergelijkende analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft continuïteit van ontdekking naar preklinisch onderzoek door viabiliteit te behouden en longitudinale observatie van actieve processen, zoals de sluiting van de cytokinetische ring, mogelijk te maken.
- Enterprise hergebruik: Gefabriceerd via replica-molding, wat snelle preparatie (<6 uur) en hergebruik over meerdere celtypen en screeningcampagnes mogelijk maakt.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door verminderde fenotypische variabiliteit en verbeterde detectie van nieuwe subcellulaire dynamiek.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via PDMS-microcavity-arrays en geoptimaliseerde protocollen voor cellading.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het onthullen van drugseffecten die in 2D-culturen verborgen bleven, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering via betrouwbare fenotypering op organelniveau in ziekterelevante 3D-contexten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfabricage, de omgang met PDMS en zuurstofplasma-activatie voor replica-gieten.
- Is afhankelijk van toegang tot een centrifuge, plasmareiniger, fluorescentiemicroscopie en fibronectine voor functionalisering van de extracellulaire matrix.
- Noodzaakt cross-team standaardisatie van celpreparatie, vullingsoptimalisatie en incubatietijden tussen de groepen biologie en assay-ontwikkeling.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan variërende celgroottes en wandeigenschappen (bijv. zoogdieren versus gist versus embryo) om de laadefficiëntie te behouden.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van zorgvuldige hantering om loslating van PDMS te voorkomen en de vereiste om caviteitsafmetingen af te stemmen op de doelcelgrootte voor een optimale ordening.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
2:29
Microfabrication of 'Eggcups'
6:29
Introducing Cells into the 'Eggcups'
9:31
Observation of Fixed Cellular Organelles in 'Eggcups'
11:22
Results: 'Eggcups' Enable Visualization of Cellular Organelles and Study of Dynamic Cell Processes
13:27
Conclusion
