Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo's in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening
September 18th, 2016
Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de morfologie en dynamica van cellulaire organellen op een reeks microholtes te observeren die het 3D-milieu nabootsen dat wordt aangetroffen in fysiologische omstandigheden. Voor cellen met stijve wanden, zoals splitsingsgist, kunnen holtes cellulaire structuren ordenen en oriënteren. Dit wordt bereikt door eerst een reeks PDMS-pijlers te fabriceren vanuit een master om een reeks PDMS-microholtes te verkrijgen, aangeduid als eiercups, door replica-maling.
Als tweede stap worden de eiercups gefunctionaliseerd met eiwitten van de extracellulaire matrix en in een buis geïntroduceerd met een cilindrisch, op maat gemaakt plastic stuk, dat het microholte-monster ondersteunt en de introductie van individuele zoogdiercellen op elk van de microholtes mogelijk maakt. Vervolgens worden de met cellen gevulde eiercups verwijderd en geïncubeerd met het medicijn of de verbinding van belang om het fenotype en dynamische processen van cellen in een 3D-beperking te bestuderen. Er worden resultaten verkregen die verschillen in celfenotype en nieuwe dynamische structuren tonen in vergelijking met standaard 2D in vitro-assays op basis van de oriëntatie van cellen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard 2D-celcultuurassays, is dat zoogdiercellen in eiercups een 3D-omgeving ervaren die vergelijkbaar is met de logische micro-omgevingen, maar gerangschikt zijn in een geordende en gestandaardiseerde graad. Orde en oriëntatie zijn ook aanzienlijke verbeteringen in het geval van splitsingsgist. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celskelet en medicijnontdekking, zoals het identificeren van nieuwe en anti-kankermedicijnen met hoog inhoud screening.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een diagnose van multifactoriële ziekten zoals kanker, omdat medicijnscreeningassays gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd en geanalyseerd door middel van eiercups, waardoor deze methode bijzonder interessant is voor gepersonaliseerde geneeskunde. Deze methode kan inzicht bieden in georganiseerde structuren en dynamica in individuele zoogdiercellen en splitsingsgistcellen, en kan ook worden toegepast op het organiseren van studie, ontwikkelende embryo's zoals C. elegans en ri-so-flu-a. In dit protocol wordt een reeks microholtes of eiercups gepatroond op een polydimetylsiloxaan of PDMS-laag die is vastgemaakt op een dekglas door replica-maling.
De eerste stap is de fabricage van de master, die niet zal worden getoond, maar wordt beschreven in het tekstprotocol. Zodra de master is gemaakt, is de volgende stap het fabriceren van de PDMS-replica. Meng in een buis van 50 milliliter de cross-linker en de prepolymer grondig in een verhouding van een op tien gewicht op gewicht of volume op volume voor een totaal van 30 gram.
Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 1.800 keer g om luchtbellen te verwijderen. Laat het PDMS voorzichtig op de master vallen. Als er bellen verschijnen, ontgast u het mengsel.
Plaats het monster in een oven op 65 graden Celsius gedurende vier uur. Nadat het PDMS is uitgehard, gebruikt u een scalpel om voorzichtig het gebied van belang van ongeveer een vierkante centimeter te snijden, dat ongeveer 10 tot de vijfde microholtes of eiercups omvat. Trek de PDMS-stempel voorzichtig af.
Om de procedure voor replica-maling te beginnen, activeert u de PDMS-stempel door middel van zuurstofplasbehandeling gedurende 30 seconden. Bewaar de geactiveerde stempel tijdelijk in een gesloten petrischaal om afzetting van stof te voorkomen. Werk in een afzuigingskast, plaats de geactiveerde PDMS-stempel met de kant met de structuren naar boven of op zijn kop in een petrischaal naast een dop van 15 milliliter.
Vul de dop met 200 microliter trimethylchloorsilaan. Sluit de petrischaal en laat de stempel zeven minuten zout worden. Plaats de PDMS-stempel op de spin coater met de structuren op hun kop.
Doe een kleine druppel vloeibaar PDMS bovenop de structuren. Spin coat bij 1500 RPM gedurende 30 seconden om een dunne laag PDMS bovenop de structuren af te zetten. Plaats de stempel in de oven op 65 graden Celsius gedurende vier uur om de afgezet spin-coated PDMS-laag uit te harden.
Activeer vervolgens de dunne PDMS-laag door de PDMS-stempel op zijn kop samen met een glazen dekglas in een zuurstofplasreiniger gedurende 30 seconden te plaatsen. Plaats de stempel onmiddellijk in contact met het glazen dekglas en druk voorzichtig met behulp van pincetten rondom het oppervlak van de stempel voor de binding. Houd daarna een constante druk op de bovenkant van de stempel gedurende ongeveer 10 seconden.
30 minuten later, trek voorzichtig de stempel uit de dekglas om de eiercups te bevrijden. Wees heel voorzichtig om het monster niet te breken. Spoel de eiercups grondig af met ethanol en droog ze af.
Als PDMS-eiercups zich niet op het glazen dekglas bevinden en tijdens de ontpinnen-stap loskomen, overweeg dan om de instellingen van de plasmareiniger aan te passen en de procedure voor replica-maling opnieuw te starten. Om de manipulatie van het monster later te vergemakkelijken, wordt aanbevolen om een klein stukje uitgehard PDMS aan de rand van het dekglas te lijmen. In het geval van zoogdiercellen die in deze video worden gepresenteerd, moet het PDMS-oppervlak worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten van de extracellulaire matrix.
Hydrofiliseer de eiercups in de zuurstofplasreiniger gedurende 30 seconden. Steriliseer vervolgens de eiercups met ultraviolet licht gedurende vijf minuten. Deponeer een kleine druppel fibronectine-oplossing om het hele eiercupgebied te bedekken en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.
Bescherm het monster tegen uitdroging. Spoel de eiercups voorzichtig af met ongeveer een milliliter PBS, met behulp van een plastic doseerpipet. Herhaal dit in totaal drie keer.
Plaats vervolgens een op maat gemaakte cilindrische plastic stuk in een buis van 50 milliliter. Voeg 13 milliliter celkweekmedium toe aan de buis. Het medium
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw apparaat en methode voor het onderzoeken van cellulaire morfologie en dynamica in een 3D-omgeving. Door gebruik te maken van microcavity arrays kunnen afzonderlijke cellen precies worden gerangschikt, wat een betere oriëntatie van organellen en verminderde variabiliteit mogelijk maakt in vergelijking met standaard assays.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschap
- 3D-celcultuur
Achtergrond
- Het begrijpen van cellulaire dynamica is cruciaal voor biologisch onderzoek.
- Standaard 2D-assays slagen er vaak niet in om fysiologische omstandigheden te repliceren.
- 3D-omgevingen kunnen de studie van het gedrag van organellen verbeteren.
- Microcavity arrays bieden een gecontroleerde setting voor celstudies.
Doel van de studie
- Om de morfologie en dynamica van cellulaire organellen te observeren.
- Om een 3D-omgeving te creëren die fysiologische omstandigheden nabootst.
- Om het celgedrag in 3D te vergelijken met traditionele 2D-assays.
Gebruikte methoden
- Fabricage van PDMS microcavity arrays door middel van replica molding.
- Functionalisering van microcavities met extracellulaire matrixeiwitten.
- Introductie van individuele zoogdiercellen in microcavities.
- Incubatie met geneesmiddelen om cellulaire reacties te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Er werden verschillen in celfenotype waargenomen in 3D-beperking.
- Er werden nieuwe dynamische structuren geïdentificeerd in vergelijking met 2D-assays.
- De methode minimaliseerde de variabiliteit in celorientatie.
- Er werd een betere begrip van de dynamica van organellen bereikt.
Conclusies
- De microcavity array-methode biedt een significante vooruitgang in celstudies.
- 3D-omgevingen zijn essentieel voor nauwkeurige biologische beoordelingen.
- Deze aanpak kan leiden tot verbeterd geneesmiddeltesten en cellulaire analyse.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standard 2D cell culture assays limit phenotypic reproducibility and obscure organelle dynamics due to non-physiological growth conditions. This microcavity array device enables ordered single-cell confinement in a 3D extracellular matrix-mimicking environment, reducing morphological heterogeneity and enhancing detection of subcellular structures and dynamic processes. The improved phenotypic consistency supports more reliable high-content screening and mechanistic de-risking in early drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by normalizing cell position, shape, polarity, and internal organization in a physiologically relevant 3D context.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous cell morphologies, improving confidence in target engagement and pathway modulation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates visualization of organelles such as nucleus and Golgi apparatus and detection of novel dynamic structures like periodic myosin accumulations during cytokinetic ring closure.
- Operational Value: Standardizes cell preparation via centrifugation-based filling, achieving up to 80% occupancy with reproducible viability across mammalian cells, yeast, and embryos.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals drug-induced phenotypes masked in 2D, such as Blebbistatin effects on stress fiber reduction and nuclear orientation, enabling mechanistic de-risking.
- Operational Value: Supports adaptation to diverse model systems including fission yeast, budding yeast, and C. elegans, broadening preclinical relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The device bridges early discovery and lead identification by providing standardized 3D-confined cellular systems that improve assay readiness and data consistency before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through ordered arrays that clarify subcellular dynamics and reduce variability in organelle orientation.
- Screening: Enables assay standardization via uniform microcavity dimensions (105 cavities/cm2) and extracellular matrix functionalization with fibronectin.
- Analytics: Generates quantitative morphological and dynamic readouts (e.g., nucleus sphericity, Golgi compaction, actin/myosin ring dynamics) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical by preserving viability and enabling longitudinal observation of active processes like cytokinetic ring closure.
- Enterprise Reuse: Fabricated via replica molding, allowing rapid preparation (<6 hours) and reuse across multiple cell types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced phenotypic variability and enhanced detection of novel subcellular dynamics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via PDMS microcavity arrays and optimized cell loading protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by unmasking drug effects obscured in 2D cultures, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via reliable organelle-level phenotyping in disease-relevant 3D contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, PDMS handling, and oxygen plasma activation for replica molding.
- Depends on access to centrifuge, plasma cleaner, fluorescence microscopy, and fibronectin for extracellular matrix functionalization.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation, filling optimization, and incubation timing across biology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations for varying cell sizes and wall properties (e.g., mammalian vs. yeast vs. embryo) to maintain loading efficiency.
- Practical limitations include the need for careful handling to avoid PDMS detachment and the requirement to match cavity dimensions to target cell size for optimal ordering.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:29
Microfabrication of 'Eggcups'
6:29
Introducing Cells into the 'Eggcups'
9:31
Observation of Fixed Cellular Organelles in 'Eggcups'
11:22
Results: 'Eggcups' Enable Visualization of Cellular Organelles and Study of Dynamic Cell Processes
13:27
Conclusion
