Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt
September 3rd, 2014
Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.
Het algemene doel van deze procedure is om subcellulair fractionering van hersenweefsel aan te tonen met behulp van een discontinue sucrosegradiënt om eiwitten uit de synaptische membranen en postsynaptische dichtheden te verrijken. Dit wordt bereikt door eerst het hersenweefsel te homogeniseren met een gemotoriseerde homogenisator. Vervolgens is er een reeks centrifugatiestaps om ruwe membraaneiwitextracten te bereiden.
De membraanextracten worden vervolgens op een discontinue sucrosegradiënt geplaatst voor ultracentrifugatie. De laatste stap is het verzamelen van de eiwitten uit de gradiënt. Uiteindelijk kunnen de resultaten veranderingen in synaptische eiwitniveaus laten zien door middel van Western blot-analyse.
Dit is een goed gevestigde techniek die al meer dan 40 jaar door neurowetenschappers wordt gebruikt. We gebruiken het in ons laboratorium om te begrijpen hoe de eiwitsamenstelling van de synaps verandert wanneer we verschillende neurotransmittersystemen verstoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals per call-gradiënten of continue sucrosegradiënten, is dat discontinue sucrosegradiënten gemakkelijker met de hand te bouwen zijn.
Dit protocol maakt gebruik van een motoraangedreven glas-teflonhomogenisator, vervang altijd de stamper tussen monsters en spoel en droog af. De homogenisator eerst, laad het gedissecteerde weefsel in een 13 milliliterbuis met vier milliliter 0,32 molaire HEPA-gebufferde sucrose-oplossing. Breng het weefsel vervolgens over naar een schone glazen homogenisator.
Stel de motor in op 900 RPM en homogeniseer het monster met 12 slagen gedurende 30 seconden met minder dan vier gram weefsel om een goede fractionering te garanderen, breng het monster terug in de buis en bewaar een 100 microliter aliquot bij minuus 80 graden Celsius voor eiwitanalyse. Scheid vervolgens het nucleaire materiaal door het homogenaat 10 minuten bij 900 G te centrifugeren. Bij vier graden Celsius, breng de supernatant over naar een nieuwe 15 milliliterbuis.
De supernatant bevat de ruwe membraanfractie. Nu om de ruwe synaptosoomcentrifuge te verrijken, centrifugeer de supernatant bij 10.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, verwijder de supernatant. De pellet bevat de ruwe synaptosoomfractie Resus.
Suspensieer het in één milliliter 0,32 molaire sucrose-oplossing. Breng vervolgens nog eens drie milliliter oplossing toe aan de suspensie, centrifugeer de ruwe fractie gedurende 15 minuten bij 10.000 G bij vier graden Celsius, verwijder de supernatant. Spuit nu snel de pellet, resuspendeer de pellet in een milliliter zuiver water.
Voeg vervolgens nog eens drie milliliter water snel toe. Breng dit over naar de homogenisator. Doe drie slagen met de hand en breng het terug naar de 13 milliliterbuis.
Pas het monster snel aan op vier millimolair HEAs met een toevoeging van 16 microliters van één molaire HEAs en meng het door inversie. Plaats nu het monster gedurende een half uur op een rotator bij vier graden Celsius. Om de monsterlyse te garanderen, voltooit u de fractionering door de Lysed P twee prime-fractie te pellen.
Centrifugeer het bij 25.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius, verwijder de supernatant, resuspendeer de pellet in een milliliter sucrose-oplossing. Dit bevat de verrijkte synap episomale membranen. Meet eerst de buffers vooraf om een discontinue sucrosegradiënt te maken.
Laad drie buizen als volgt, één met exact 3,5 milliliter van 1,2 molaire hoop gebufferde sucrose-oplossing. Een andere met precies drie milliliter 1,0 molaire oplossing en de derde met drie milliliter 0,8 molaire oplossing. Breng vervolgens met een glazen pesterpipet de 1,2 molaire sucrose-oplossing over naar een 12 milliliter polymeerultracentrifugebuis.
Met een nieuwe pipet, plaats zorgvuldig de 1,0 molaire oplossing op de 1,2 molaire oplossing. Verontrust de 1,2 molaire oplossing niet of breng geen luchtbellen in met de pipet. Gebruik dezelfde techniek om de 0,8 molaire oplossing er bovenop te plaatsen.
Wees voorzichtig. Kleine trillingen van een bankvortex of microcentrifuge zijn voldoende om de integriteit van de gradiënt te verstoren. Het is belangrijk om de gradiënten zorgvuldig en efficiënt op te bouwen.
Als het te lang duurt of als de gradiënt wordt blootgesteld aan trillingen, kunt u de synaptische membranen in de latere stappen niet herstellen. Nu plaatst u met een andere pastorpipet de verrijkte synap episomale membraanfractie op de voorbereide gradiënt. Breng de gradiënt precies in balans in een ultracentrifuge in een schommelende emmerrotor.
Centrifugeer het vervolgens gedurende twee uur bij 150.000 G bij vier graden Celsius. Wees heel voorzichtig bij het verwijderen van de gradiënt uit de emmer na de centrifugatie, er zouden duidelijke banden van sucrose-oplossing moeten zijn. Met eiwitfracties bij elke interface en een pellet, mogen de fracties niet diffuus zijn.
Gebruik een 18 gauge naald en een 1 milliliter spuit om het laagste deel van de 1,2 molaire interface te doorboren en de witte band van eiwit te trekken, die de synaptische plasmamembranen bevat. Noteer het volume van deze laag. Breng de laag over naar een 3,5 milliliter dikke wand ultracentrifugebuis.
Voeg exact 2,5 volumes van vier millimolair HEAs toe. Bereid vervolgens een balanceerbuis voor met 0,32 molaire HEAs gebufferde sucrose-oplossing in een vaste hoekrotor, ultracentrifugeer het monster bij 200.000 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Gooi vervolgens de Senna weg en resuspendeer het synaptische plasmamembraanpellet.
In 300 microliters 50 millimolair HEAs twee millimolair EDTA-oplossing. De postsynaptische dichtheidsfractie of PSD-fractie kan nu worden verzameld door verder gebruik van dezelfde technieken. De stappen zijn duidelijk beschreven in het tekstprotocol.
Er werd een western blot uitgevoerd met een totaal eiwit, de synaptische plasmamembraan en eerste postsynaptische dichtheidsproteïnefracties. De PSD-fractie onderging slechts een detergentbehandeling en het weefsel was van muis striatum. Presynaptische eiwitten zoals de dopaminetransporter zijn verrijkt in de SPM-fractie, maar worden geë
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met het synaptische plasmamembraan door middel van ultracentrifugeren op een discontinu sucrosegradiënt. De procedure demonstreert subcellulair fractionering van hersenweefsel om eiwitten uit synaptische membranen en post-synaptische dichtheden te verrijken.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische eiwitniveaus is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Synaptische membranen en post-synaptische dichtheden spelen een sleutelrol in neuronale communicatie.
- Ultracentrifugeren is een standaardtechniek voor eiwitverrijking.
- Western blotting en 2D DIGE zijn veelgebruikte methoden voor eiwitanalyse.
Doel van Studie
- Om eiwitten uit synaptische membranen en post-synaptische dichtheden te verrijken.
- Om eiwitextracten voor te bereiden die geschikt zijn voor verdere analyse.
- Om de effectiviteit van een discontinu sucrosegradiënt in eiwitverrijking aan te tonen.
Gebruikte Methoden
- Homogenisatie van hersenweefsel met behulp van een gemotoriseerde homogenisator.
- Reeks centrifugatiestaps om ruwe membraaneiwitextracten voor te bereiden.
- Lagen van membraaneiwitextracten op een discontinu sucrosegradiënt.
- Ultracentrifugeren om eiwitten uit de gradiënt te verzamelen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle verrijking van synaptische plasmamembraaneiwitten.
- Voorbereiding van post-synaptische dichtheideiwitten voor analyse.
- Resultaten kunnen veranderingen in synaptische eiwitniveaus aangeven.
- Geschikt voor Western blot-analyse en 2D DIGE.
Conclusies
- De methode verrijkt effectief eiwitten uit synaptische membranen.
- Biedt een basis voor het bestuderen van synaptische eiwitdynamiek.
- Kan worden toegepast op verschillende neurowetenschappelijke onderzoeksvragen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
