Name: Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer de retrograde axonale transport van BDNF volgen in primaire rat hippocampusneuronen met behulp van microfluidische kamers en quantum dot-labeling. Deze methode biedt inzicht in neurotrofine dynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Yue (Pauline) Hu, Rachel SINIT bedanken voor hun technische bijstand. Het onderzoek wordt ondersteund door NIH-subsidie ​​(PN2 EY016525) en door de financiering van het syndroom van Down Research and Treatment Foundation en de Larry L. Hillblom Foundation.

Chirurgische en dier procedures worden uitgevoerd strikt volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle experimenten met het gebruik van dieren worden goedgekeurd door UCSD Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1 plasmideklonering, Expressie en zuivering van Mono-gebiotinyleerd BDNF (mBtBDNF) OPMERKING: Construct pre-proBDNFavi en BirA cDNA in pcDNA3.1 vector en coexpress in HEK293FT cellen 10. Zuiver mBtBDNF gebruik van Ni-NTA korrels volgens eerder gepubliceerde werkwijze voor het produceren volwassen en biologisch actieve monobiotinylated nerve growth factor (mBtNGF) 10. 2 Voorbereiding van Microfluidic Chambers Microfluïdische neuron kweken apparaat maakt het mogelijk fluïdisch isoleren axonen van neuron cellichamen. Assembleren kamers met vers gecoate dekglaasjes vlak voor elke dissectie. Microfluïdische kamers gebruiktIn dit protocol zijn de winkel heb gekocht (zie materialen en tafel apparatuur&#39;s). Handwas en hergebruikt in de winkel gekochte kamers tot 5-6x. <ol><li> Handwas microfluïdische kamers in 1% Alconox. Spoel driemaal met Milli-Q water gedurende 30 minuten elk. Handwas kamers weer in 70% ethanol. </li><li> Indeling kamers te drogen op Parafilm in de laminaire stroming kap. Uitstralen en steriliseren beide zijden van de kamers voor 20 min onder UV. WINKEL gesteriliseerd kamers in een steriele 15 cm schaal met Parafilm afgesloten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats 24 x 40 mm nummer 1 dekglaasjes in een glazen container. Week de dekglaasjes in 35% zoutzuur overnachten op een rotator. Op de volgende dag, spoel de dekglaasjes driemaal gedurende 30 min elk met water. </li><li> Steriliseer de dekglaasjes voor een door dompelen elk dekglaasje in 100% ethanol en vlammen op een Bunsen brander. Bewaar droge dekglaasjes in een steriele petrischaal en bewaar deze op kamertemperatuur tot coating. </li><li> Lag out de dekglaasjes in een 15 cm kweekschaal. Coat elk dekglaasje met 0,7 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) en incubeer in de kap bij kamertemperatuur. </li><li> Na 1 uur, spoel de dekglaasjes driemaal met steriel water. Droog coverslips met vacuum en plaats elke dekglaasje in een 6 cm cultuur schotel. </li><li> Om de microfluïdische kamer monteren, plaatst u de kamer met microgroove kant aan de onderkant op de PLL gecoat dekglaasje voorzichtig de microgroeven niet aan te raken. Voorzichtig ingedrukt de kamer met een pipet tip om ervoor te zorgen de kamer werd goed afgesloten. </li></ol> 3 Dissectie van neuronale Cultuur en plaat op Chambers <ol><li> Plaats twee E17-E18 ratten hippocampus (een brain) ontleed in een 15 ml conische buis met 2 ml dissectie buffer (HBSS, zonder calcium, geen magnesium, met 1% pen / strep en 10 mM HEPES. Spoel de weefsels met 3x 5 ml dissectie buffer elke keer. Verwijder de dissectie buffer zoveel mogelijk en voeg 900 ul vers dissection buffer. </li><li> Om het weefsel te verteren, voeg 100 ul van 10x trypsine (2,5%) in de dissectie buffer 1x werkconcentratie maken. Plaats de conische buis in een 37 ° C waterbad. Na 10 min digestie, voeg 100 ul van 10 mg / ml DNase I bij een eindconcentratie ongeveer 1 mg / ml. </li><li> Met een brand gepolijste Pasteur pipet glas voorzichtig vermaal het weefsel met en neer te pipetteren 5-10x. Direct na tritureren, doven de trypsine met 2 ml plaatmedium (Neurobasal met 10% FBS, 2 mM GlutaMax, 2% B27). </li><li> Laat het monster in de kap 5 minuten om vuil van de weefsels laten beneden naar de bodem. Verwijder voorzichtig 2 ml supernatans in een schone steriele 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Resuspendeer de pellet in 50 ul plating media </li><li> Tel de cellen met hemocytometer. Load 15-20 pi celsuspensie (~ 40.000 cellen) in een compartiment van de microfluïdische kamer. Plaats de kamerin de incubator gedurende 10 minuten om de cellen te hechten aan het dekglaasje. Na 10 min, voeg meer plating media te vullen beide compartimenten van de kamer. </li><li> Op de tweede dag van dissectie, volledig vervangen van de beplating media onderhoudsmedium (Neurobasal met 2 mM GlutaMax, 2% B27) in zowel het cellichaam en axon compartiment. Axonen van de hippocampus neuronen beginnen om de microgroeven steken in dag 3 en bereikt de axon compartiment tussen dag 5-7. Gedurende deze periode, vervangt de helft van de kweekmedia met vers onderhoudsmedium elke 24 ~ 48 uur. </li></ol> 4 Axonale Vervoer van QD-BDNF <ol><li> Voorafgaand aan wonen beeldvorming van QD-BDNF axonale transport, afbrekende BDNF van zowel het cellichaam en axon compartimenten van de microfluïdische kamer door grondig spoelen beide compartimenten met BDNF-vrij, serum vrije Neurobasal media elke 30 min gedurende 2 uur. </li><li> Tijdens BDNF uitputting, bereiden de QD-BDNF conjugaten. Meng 50 nM van mono-gebiotinyleerde BDNF dimeer met 50 nM QD655-streptavidine conjugaten in Neurobasal media en incubeer op ijs gedurende 60 minuten. </li><li> Verwijder media in de axon compartiment en voeg 300 ul QD-BDNF met een eindconcentratie van 0,25 nM gedurende 4 uur bij 37 ° C. De verspreidende van QD-BDNF in het cellichaam compartiment minimaliseren, is het zeer belangrijk om altijd een hoger media in het cellichaam compartiment onderhouden dan in de axon compartiment. Afwassen ongebonden QD-BDNF na incubatie voor live-imaging. </li><li> Uitvoeren van live-imaging van QD-BDNF transport met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met een 100X olie objectief. Verwarm de reikwijdte en de klimaatkamer verbonden aan een constante temperatuur (37 ° C) en CO2 (5%). Gebruik een set van Texas rood excitatie / emissie kubussen de QD655 signaal visualiseren. </li><li> Verwerven en vastleggen van time-lapse beelden binnen het midden axonen met de snelheid van 1 frame / sec voor een totaal van 2 min met behulp van een CCD-camera. Gebruik microgroeven zonder axonen that hebben geen QD en dus geen signaal als controle voor infiltratie. </li><li> Analyseer BDNF transport met behulp van een software voor beeldanalyse of NIH ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptors%3A+roles+in+neuronal+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li>
<li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li>
<li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon%3A+a+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li>
<li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor%3A+a+slow+route+to+the+signaling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li>
<li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li>
<li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li>
<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In deze studie rapporteren we de ontwikkeling van een nieuwe techniek om biologisch actieve produceren monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) die kunnen worden gebruikt axonaal transport van BDNF sporen. Door het combineren van het eiwit aan quantum dot streptavidine, en met behulp van een microfluïdische kamer, de methode maakt het mogelijk om axonale transport van BDNF in primaire neuronen met &#39;single molecule gevoeligheid, in real-time en met ruimtelijke en temporele resoluties te detecteren. De instrumenten hierin gebr...

Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen waarvan de lange en vaak zeer uitgewerkte processen zijn essentieel voor het opzetten en onderhouden van de structuur en functie van neurale circuits. Het axon speelt een vitale rol bij het uitvoeren vracht naar en van synapsen. Eiwitten en organellen gesynthetiseerd cel soma moeten worden getransporteerd door axonen in de presynaptische terminal bereikt neuronale functie ondersteunen. Dienovereenkomstig ontvangen signalen bij het distale axons moeten worden getransduceerd en overgebracht naar de soma. Deze processen zijn essentieel voor neuronale overleving, differentiatie en onderhoud. In dat axonaal transport in sommige neuronen worden uitgevoerd door middel afstanden meer dan 1000 maal de diameter van het cellichaam, is de mogelijkheid gemakkelijk beoogd dat zelfs kleine tekorten aanzienlijk kunnen beïnvloeden neuronale en circuitfunctie. Hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), een lid van de neurotrofine familie van groeifactoren, aanwezig in ma isny gebieden van de hersenen, inclusief de hippocampus, cerebrale cortex en basale voorhersenen. BDNF speelt een cruciale rol in cognitie en geheugenvorming door ondersteuning van de overleving, differentiatie en functie van neuronen die deelnemen aan cognitieve circuits. BDNF bindt aan zijn receptor, het tyrosine kinase TrkB bij het axon terminal waar activeert TrkB-gemedieerde signaalwegen inclusief mitogeen geactiveerde proteïne kinase / extracellulair signaalgereguleerde proteïne kinase (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) en fosfolipase C-gamma (PLCy). De eiwitten die deelnemen aan deze signaalroutes verpakt op endocytische vesiculaire structuren om de BDNF / TrkB signalering endosoom 1-6 die vervolgens retrograde getransporteerd naar de neuronale soma vormen. De microfluïdische cultuur kamer is een zeer nuttig platform voor het bestuderen van axonale biologie onder normale omstandigheden als in de setting van letsel en ziekte 7,8. Door het isoleren van axonenuit de cel lichamen, heeft het apparaat mag een tot vervoer specifiek bestuderen in axonen 8-10. De PDMS microfluïdische gebaseerde platforms met 450 urn microgroove belemmeringen die in deze studie werden commercieel aangeschaft (zie Materialen tabel). Om BDNF vervoer te onderzoeken, ontwikkelden we een nieuwe technologie om monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) produceren. We hebben geprofiteerd van de biotine acceptor peptide, AP (ook bekend als AviTag). Het is een 15 aminozuursequentie die een lysine-residu die specifiek een biotine kan worden geligeerd door het Escherichia coli enzym biotine ligase, BirA bevat. We gefuseerd de AviTag de C-terminus van het muis vooraf proBDNF cDNA door PCR (Figuur 1A). Het construct werd gekloneerd in de zoogdier expressievector pcDNA3.1 myc-vector zijn. We gekloneerd ook BirA bacterieel DNA in de pcDNA3.1 myc-vector zijn. De twee plasmiden werden transiënt gecotransfecteerd in HEK293FT cellen beide eiwitten tot expressie. BirA gekatalyseerde de ligatie van biotin het bijzonder de lysine in de AviTag bevinden bij de C-terminus van BDNF bij een 1: 1 verhouding produceren monobiotinylated BDNF monomeer. Gebiotinyleerde, volwassen BDNF met een molecuulgewicht van ~ 18 kDa werd teruggewonnen en gezuiverd van media met Ni-hars (figuur 1C). De biotinylering van BDNF was voltooid, zoals beoordeeld door het onvermogen om ongemodificeerde BDNF detecteren door immunoblotting (figuur 1D). Streptavidine geconjugeerde quantum dots, QD 655, werden gebruikt om mBtBDNF labelen naar QD-BDNF maken. De aanwezigheid van de AviTag niet interfereert met de activiteit van BDNF als het mBtBDNF kon gefosforyleerd TrkB (figuur 1E) activeren en stimuleren uitgroei van neurieten (figuur 1F) voor zover van recombinant humaan BDNF (rhBDNF). Immunokleuring aangetoond dat QD-BDNF colocalized met TrkB in de hippocampus axonen, wat aangeeft dat QD-BDNF is bioactieve (figuur 1G). Om het transport BDNF bestuderen, werd QD-BDNF toegevoegd aan distale axon compartiment vanmicrofluidic kweken die E18 rat hippocampale neuronen (Figuur 2A). QD-BDNF retrograde transport binnen axonen werd gevangen genomen door real-time live imaging van de rode fluorescerende tag (Ondersteunende video&#39;s S1, S2). Door het analyseren van de kymograaf gegenereerd, werd QD-BDNF waargenomen retrogradely worden vervoerd bij een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec (Figuur 3A). GFP of mCherry-gelabeld BDNF zijn gebruikt om axonale verkeer van BDNF te volgen. De belangrijkste nadelen zijn dat ze niet helder genoeg voor single molecule studies. Ook de aanwezigheid van zowel anterograde en retrograde BDNF bewegingen maakt het moeilijk te beoordelen of de retrograde getransporteerd BDNF was een neurotrophin / receptorcomplex. In deze video tonen we de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken. De ultrabrightness en uitstekende fotostabiliteit van quantum dots makes het mogelijk om lange termijn volgen van BDNF transport voeren. Deze technieken kunnen worden benut om de studies van axonale functie te verbeteren in AD, HD, en andere neurodegeneratieve aandoeningen.

<table><tbody><tr><td>Platinum pfx DNA polymerase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT cells</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resins</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors cocktail</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;S8820</td><td></td></tr><tr><td>Silver staining kit&nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chambers</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 glass coverslips&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp;&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptavidin conjugates</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>anti-Avi tag antibody</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-agarose beads&nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>&nbsp;SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptavidin&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>anti-pTrkB antibody</td><td>a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TrkB antibody</td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time beeldvorming van axonale vervoer van quantum dot-label bdnf in primaire neuronen

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF speelt een belangrijke rol in diverse aspecten van neuronale overleving, differentiatie en functie. Structurele en functionele tekorten in axonen worden steeds meer gezien als een vroeg kenmerk van neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Huntington (HD). Vooralsnog onduidelijk is het mechanisme (s) van die axonale letsel wordt veroorzaakt. We meldden de ontwikkeling van een nieuwe techniek om biologisch actieve produceren monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) die kunnen worden gebruikt axonaal transport van BDNF sporen. Quantum dot-gelabeld BDNF (QD-BDNF) werd geproduceerd door het vervoegen van quantum dot 655 tot mBtBDNF. Een microfluïdische apparaat werd gebruikt om de axonen van neuron cellichamen isoleren. Toevoeging van QD-BDNF het axonale compartiment toegestane levende beeldvorming van BDNF transport in axonen. We hebben aangetoond dat QD-BDNF verhuisde in wezen uitsluitend retrogradely, met zeer weinig pauzes, op een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec. Dit systeem kan worden gebruikt om me onderzochtchanisms van verstoorde axonale functie AD of HD, en andere degeneratieve aandoeningen.

Productie en zuivering van biologisch actieve Mono-gebiotinyleerde BDNF De expressievector van BDNF gefuseerd met een sequentie AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) werd gecre volgens een eerder gepubliceerd protocol 10. De molecuulmassa van de volledige lengte fusie-eiwit werd voorspeld ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) Monobiotinylated rijpe BDNF met een voorspelde molecuulmassa van 18 kDa (Fi...

Axonale transport van BDNF, een neurotrofe factor, is van cruciaal belang voor de overleving en functie van verschillende neuronale populaties. Sommige degeneratieve stoornissen worden gekenmerkt door verstoring van axonale structuur en functie. We toonden de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken.

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Het algemene doel van deze procedure is om het retrograde axonale transport van hersenafgeleide neurotrofe factor of BDNF door live beeldvorming te volgen. Dit wordt bereikt door eerst microfluïdische kamers te assembleren op met polylysine gecoate dekglasjes. In de tweede stap worden gedissocieerde E 18 rattenhippocampale neuronen gedissecteerd en geplaatst in het cellichaamcompartiment van de microfluïdische kamer.Vervolgens worden de neuronen gekweekt om de extensie van de axonen over de microgroeven in het axonale compartiment van de kamer mogelijk te maken. In de laatste stap wordt quantum dot gelabeld BDNF toegevoegd aan het axon compartiment. Uiteindelijk kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de BDNF beweging binnen de axonen van het hippocampale neuron te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals B-D-F-E-G-I-P of BDFM cherry labeling is dat het labelen van BDF met quantum dot het lichtbeeld van een enkele BDF dimeer binnen de axonen mogelijk maakt, wat aantoont dat de procedure zal zijn, zal zijn. Trek een punt na mijn linker drie, Begin met het handmatig wassen van de microfluïdische kamers in 1%aox, gevolgd door drie

real-time-imaging-axonal-transport-quantum-dot-labeled-bdnf-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Dit protocol gaat in op de live-dissectie van...

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a live-imaging technique using differential interference contrast (DIC) microscopy to observe real-time axonal branching in cortical neurons. Time-lapse videos capture the effects of netrin-1 treatment, a signaling molecule that induces localized exocytosis and cytoskeletal rearrangements in...

Real-Time In Vitro Imaging of Axonal Branching in Mouse Cortical Neurons

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt op een kosteneffectieve manier geproduceerd in HEK293 cellen en wordt gezuiverd door affiniteitschromatografie. BDNFavi wordt dan direct mono-biotinylated met het enzym BirA in een buis. BDNFavi en mono-biotinylated BDNFavi behouden hun biologische activiteit in vergelijking met commercieel verkrijgbaar BDNF.

Een verbeterd protocol om te zuiveren en direct Mono-Biotinylaat Recombinant BDNF in een tube voor cellulaire trafficking studies in neuronen

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

Leer de retrograde axonale transport van BDNF volgen in primaire rat hippocampusneuronen met behulp van microfluidische kamers en quantum dot-labeling. Deze methode biedt inzicht in neurotrofine dynamica.

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

Meer video's verkennen