Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om het retrograde axonale transport van hersenafgeleide neurotrofe factor of BDNF door live beeldvorming te volgen. Dit wordt bereikt door eerst microfluïdische kamers te assembleren op met polylysine gecoate dekglasjes. In de tweede stap worden gedissocieerde E 18 rattenhippocampale neuronen gedissecteerd en geplaatst in het cellichaamcompartiment van de microfluïdische kamer.

Vervolgens worden de neuronen gekweekt om de extensie van de axonen over de microgroeven in het axonale compartiment van de kamer mogelijk te maken. In de laatste stap wordt quantum dot gelabeld BDNF toegevoegd aan het axon compartiment. Uiteindelijk kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de BDNF beweging binnen de axonen van het hippocampale neuron te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals B-D-F-E-G-I-P of BDFM cherry labeling is dat het labelen van BDF met quantum dot het lichtbeeld van een enkele BDF dimeer binnen de axonen mogelijk maakt, wat aantoont dat de procedure zal zijn, zal zijn. Trek een punt na mijn linker drie, Begin met het handmatig wassen van de microfluïdische kamers in 1%aox, gevolgd door drie 30 minuten wasbeurten in milli Q water. Na het handmatig wassen van de kamers in 70%ethanol, leg ze uit om te drogen op param in een laminaire stromingskast, steriliseer beide kanten van de kamers onder UV licht gedurende 20 minuten en bewaar vervolgens de bestraalde kamers in een steriele 15 centimeter schaal, afgedicht met param op kamertemperatuur.

Leg vervolgens 24 bij 40 millimeter. Nummer één glasdekglasjes in 10% zoutzuur een nacht op een rotator gevolgd door drie 30 minuten wasbeurten met water na de laatste wasbeurt. Steriliseer elk dekglas met een duik in 100%ethanol, gevolgd door vlammen over een Bunsen-brander en bewaar ze droog in een steriele petrischaal op kamertemperatuur.

Om de dekglasjes te coaten, leg ze in een 15 centimeter kweekschaal en bedek ze vervolgens ieder met 0,7 milliliter 0,01% poly L lysine. Na een incubatie van een uur in de weefselkweekkast, spoel de dekglasjes drie keer opnieuw met steriel water en droog ze vervolgens met een vacuüm en plaats ze in een zes centimeter kweekschaal. Plaats vervolgens een van de gesteriliseerde kamers met de microgroefzijde naar beneden op een met poly L lysine gecoat dekglas.

Zorg ervoor dat de microgroeven niet worden aangeraakt en gebruik een micropipettip om voorzichtig op de kamer te drukken en de geassembleerde microfluïdische kamer goed af te sluiten. Plaats nu twee E 17 tot E 18 ratten Hippo Campi in een 15 milliliter conische buis met twee milliliter dissectiebuffer en spoel de weefsels drie keer met vijf milliliter dissectiebuffer per keer. Vervolgens verwijdert u zoveel mogelijk van het wasmiddel en voegt u 900 microliters verse dissectiebuffer toe om het weefsel te verteren.

Voeg vervolgens 100 microliters van 2,5% trypsine toe aan de weefsels en plaats de buis in een waterbad van 37 graden Celsius. Na 10 minuten vertering, voeg 100 microliters DNA een toe en gebruik een met vuur gepolijste PE glaspipet om de weefsels voorzichtig vijf tot tien keer op en neer te trirateren direct na het mengen. Quench de tryin met twee milliliters platingmedium en laat het puin vijf minuten op de bodem van de buis bezinken in de weefselkweekkast.

Overbreng vervolgens voorzichtig twee milliliter supernatant naar een schone steriele 15 milliliter conische buis en centrifugeer de celresuspende. Suspendeer de pellet in 50 microliters platingmedium en laad na het tellen 15 tot 20 microliters van de celsuspensie in één compartiment van de microfluïdische kamer. Incubeer de kamer gedurende 10 minuten om de cellen aan het dekglas te laten hechten en voeg vervolgens meer platingmedium toe om beide compartimenten van de kamer te vullen.

Na een dag incubatie, vervang het platingmedium door onderhoudsmedium in zowel het cellichaam- als het axoncompartiment. Op dag drie beginnen de axonen van de hippocampale neuronen de microgroeven over te steken en bereiken het axoncompartiment tussen dag vijf en zeven. Gedurende deze tijd vervangt u elke 24 tot 48 uur de helft van het kweekmedium door vers onderhoudsmedium voorafgaand aan live beeldvorming van het quantum gelabelde BDNF Axonale Transport.

Spoel beide compartimenten van de microfluïdische kamer gedurende twee uur elke 30 minuten grondig met BDNF-vrij serumvrij neuro basale media tijdens de BDNF-depletie, incubeer 50 nanomolar mono biotinyleerd BDNF dimer met 50 nanomolar quantum. Doe 6 5 5 strippin conjugaten in neuro basale media op ijs gedurende 60 minuten. Vervolgens vervangt u het medium in het axoncompartiment met 300 microliters van quantum dot gelabeld BDNF gedurende vier uur bij 37 graden Celsius om de diffusie van quantum dot gelabeld BDNF in het cellichaamcompartiment te minimaliseren.

Het is erg belangrijk om altijd een hoger niveau van medium in het cellichaamcompartiment te handhaven dan in het axoncompartiment aan het einde van de incubatie, opwarmen en omgekeerde microscoop, uitgerust met een 100 x olie objectief en een omgevingskamer op een constante temperatuur van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide terwijl de apparatuur opwarmt. Was het ongebonden quantum dot gelabelde BDNF af van de microfluïdische kamer en gebruik vervolgens een set Texas red excitatie en emissie cubes om het quantum dot 6 5 5 signaal te visualiseren. Gebruik tenslotte een CCD camera om tijdsverloopbeelden binnen de middelste axonen te maken met een snelheid van één frame per seconde voor een totaal van twee minuten.

Gebruik microgroeven zonder axonen die geen QD hebben als controle voor infiltratie en analyseer het BDNF transport met behulp van de juiste beeldanalysesoftware in tijdsverloopbeeldvorming van quantum dot gelabeld BDNF signaaltransport, quantum dot signalen worden waargenomen in de meeste microgroeven met axonen, terwijl er geen quantum signaal wordt gezien in de microgroeven zonder axonen, wat aangeeft dat er weinig tot geen diffusie van het quantum dot signaal is van het axon