Name: gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer gDNA-verrijking met transposase-gebaseerde technologie voor NGS-analyse van 11 DNA-herstelgenen, waaronder BRCA1 en BRCA2. Deze methode detecteert genetische variaties efficiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de Ligue contre le Cancer de Côte d’Or en het Centre Georges-François Leclerc voor hun financiële steun. We danken Philip Bastable voor het bewerken van het manuscript.

<ol><li>Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+responsible+for+familial+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Genes responsible for familial breast cancer.</a> Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).</li>
<li>Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+breast+cancer+risk+and+BRCA1%2F2+carrier+probability%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Dis%22%5BJournal%5D)">Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability.</a> Breast Dis. 27, 5-20 (2007).</li>
<li>Cox, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+variants+of+the+BRCA1+wild-type+allele+modify+the+risk+of+breast+cancer+in+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).</li>
<li>Maia, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BRCA2+cis-regulation+in+normal+breast+and+cancer+risk+amongst+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers.</a> Breast Cancer Res. 14 (2), 63(2012).</li>
<li>Anczuków, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+deep+intronic+mutation+causing+activation+of+a+cryptic+exon%3A+opening+toward+a+new+preventive+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy.</a> Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).</li>
<li>Brewster, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fifteen+novel+germline+variants+in+the+BRCA1+3%27UTR+reveals+a+variant+in+a+breast+cancer+case+that+introduces+a+functional+miR-103+target+site%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site.</a> Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).</li>
<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).</li>
<li>Ma, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+evidence+for+the+contribution+of+the+genetic+variations+of+BRCA1-interacting+protein+1+%28BRIP1%29+to+the+genetic+susceptibility+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer.</a> Gene. 524 (2), 208-213 (2013).</li>
<li>Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+need+for+routine+clinical+testing+of+PALB2+c.1592delT+mutation+in+BRCA+negative+Northern+Finnish+breast+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families.</a> BMC Med. Genet. 14, 82(2013).</li>
<li>Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+and+breast+cancer%3A+ready+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation.</a> Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).</li>
<li>Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+and+implementation+issues+in+using+next-generation+sequencing+of+cancers+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice.</a> Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).</li>
<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
<li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240(2011).</li>
<li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li>
<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
<li>Slater, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+mutations+in+European+familial+pancreatic+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families.</a> Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).</li>
<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Het wijdverbreide gebruik van NGS apparaten en technologieën heeft nieuwe mogelijkheden in het onderzoek naar kanker en genetische aandoeningen. Naast whole genome sequencing of RNA sequentie, de analyse van een grote hoeveelheid gDNA geselecteerde sequenties in verschillende patiënten tegelijkertijd biedt grote mogelijkheden in diagnose. Hier ontwikkelden we een specifiek ontwerp (op aanvraag) met Nextera technologie om 11 volledige genen tegelijk bestuderen bij 24 patiënten met een gemiddelde throughput sequencing app...

In 2010, bijna 1,5 miljoen mensen (voornamelijk vrouwen) ontwikkelden borstkanker wereldwijd. Er wordt geschat dat 5 tot 10% van deze gevallen waren erfelijk. Bijna 20 jaar geleden, BRCA1 en BRCA2 zijn geïdentificeerd als die betrokken zijn bij erfelijke borst-en eierstokkanker 1. Sinds ongeveer 15 jaar geleden, BRCA1 en BRCA2 coderende gebieden werden gesequenced om de genetische aanleg voor borstkanker en eierstokkanker bepalen. Veranderingen in BRCA1 en BRCA2 zijn gedetecteerd in 10 tot 20% van de geselecteerde families 2 suggereert dat de analyse van deze gebieden niet voldoende voor doeltreffende screening. Onlangs heeft de analyse van niet-coderende sequenties (promoter, introns, 3-&#39;UTR) van BRCA1 en BRCA2 benadrukt dat nieuwe mutaties / varianten kunnen worden gekoppeld aan een hoger risico op borstkanker 3-6. BRCA1 en BRCA2 eiwitten zijn betrokken bij homologe recombinatie Repair (HHR), dat wordt aangevuld met verschillende partners 7. Terwijl veranderingen in BRCA1 of BRCA2 induceren defecten in DNA herstel, kan de andere partners ook invloed op het risico op borstkanker. Deze hypothese lijkt te zijn gevalideerd sinds BRIP1 8 en 9 PALB2 hebben een bewezen effect op baarmoederhalskanker, borstkanker, respectievelijk. Daarnaast zijn twee andere &quot;matig risico&quot; borstkanker gevoelige genen, ATM en CHEK2, kan ook worden routinematig 10 bestudeerd. In het verlengde van deze studies, hebben we besloten om een protocol tot 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 en TP53) bij 24 patiënten te analyseren ontwikkelen tegelijk met behulp van een zeer eenvoudig en relatief snelle protocol gebaseerd op transposasegen technologie, met verrijking en sequencing op een middelgrote doorvoer apparaat. Thanksdeze techniek we de sequentie volledige genen van het begin van de promoter tot eind 3&#39;-UTR, behalve RAP80, waarvoor een intronische gebied van 2500 bp werd niet onder (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Dit komt neer op een totaal van ongeveer 1.000.300 bp studeerde bij 2.734 sondes. Gewoonlijk worden BRCA1 en BRCA2 exon sequenties geanalyseerd door Sanger sequentiebepaling, die 1,5 maand nodig voor minder dan 20 patiënten. Met de onderhavige protocol (figuur 1), in dezelfde tijd, 11 volledige genen voor meer dan 75 patiënten konden worden geanalyseerd.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Sequencing/medium doorvoer apparaat</td></tr><tr><td>Nextera Enrichment kit</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Transposase gebaseerde technologie</td></tr><tr><td>300 cyclus cartridge</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPure kralen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Magnetische zuiveringskralen</td></tr><tr><td>Magnetische standaard</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96-well Platen</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96-well platen</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Deze afdichting is alleen nodig voor PCR-amplificatie. Andere standaard afdichtingen kunnen gedurende het hele experiment worden gebruikt</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Wordt geleverd met het sequencing apparaat Experiment Manager software Internetadres: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Website van de fabrikant tool</td></tr></tbody></table>

gdna verrijking door een-transposase gebaseerde technologie voor ngs analyse van de hele reeks van brca1, brca2, en 9 genen betrokken bij dna-schade te herstellen

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Het wijdverbreide gebruik van Next Generation Sequencing heeft opengesteld nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar kanker en de diagnose. NGS zal enorme hoeveelheden nieuwe gegevens over kanker, en in het bijzonder de genetica van kanker te brengen. De huidige kennis en toekomstige ontdekkingen maken het noodzakelijk om een ​​groot aantal genen die betrokken kunnen zijn bij een genetische aanleg voor kanker te bestuderen. In dit opzicht hebben we een Nextera ontwerp om 11 volledige genen betrokken bij DNA schade herstel bestuderen. Dit protocol is ontwikkeld om veilig te studeren 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 en TP53) van promotor tot 3&#39;-UTR bij 24 patiënten tegelijk. Dit protocol, gebaseerd op transposasegen technologie en gDNA verrijking, geeft een groot voordeel in termen van tijd voor de genetische diagnose dankzij multiplexing proeven. Dit protocol kan veilig gebruikt worden met bloed gDNA.

Voorbeeld QC resultaten Het vermogen van deze methode om sequenties van doelgenen te bepalen is gebaseerd op de kwaliteit van de gDNA (Figuur 2A) en de kwaliteit van de tagmentation stap. Als de tagmentation onvoldoende (Figuur 2B, bovenste paneel), de sequentiebepaling niet bevredigend. Zoals hierboven vermeld, na de tagmentation zuivering, de gDNA worden tagmented in fragmenten van 150 bp tot 1000 bp met de meeste fragmenten ongeveer 300 bp (Figuur 2B...

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Het doel van het volgende experiment is om de sequentie van 11 genen gelijktijdig te analyseren met een zeer eenvoudig en relatief snel protocol op basis van transposase-gebaseerde technologie. Dit wordt bereikt door de werking van een transposase om 300 base pair DNA-fragmenten direct te ligueren met adapters. De eerste capture met behulp van specifieke sondes verrijkt monsters in regio's van belang.Deze stap wordt nog eens herhaald om alleen doelsequenties te verkrijgen. Vervolgens wordt PCR-amplificatie uitgevoerd om de hoeveelheid materiaal te verhogen om te sequentiëren. De resultaten tonen genetische variaties in genen op basis van sequentie-alignering en bioinformatica-analyse. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Sanger-sequencing is de grote capaciteit die ons in staat stelt om 24 passies voor 11 volledige genen in minder dan twee weken te analyseren.Het demonstreren van de procedure zal door Sandy worden gedaan, een technicus voor mijn laboratorium. Om te beginnen, bereid alle reagentia van het DNA-verrijkingskit voor. Wanneer u klaar bent, voegt u ongeveer 50 nanogram genomisch DNA toe aan elke put van een 96-puttenplaat. Begin de mentatie door 25 microliter TD-buffer en vervolgens vijf microliter TDE een-buffer toe te voegen.Stel de pipet in op 50 microliter en pipet voorzichtig het gehele volume 10 keer op en neer. Centrifugeer kort en plaats de plaat vervolgens in een thermocycler wanneer u klaar bent. Vortex de ST-oplossing en voeg 15 microliter toe aan elke put met monster.Stel de pipet in op 65 microliter en pipet voorzichtig het gehele volume 10 keer op en neer. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur voordat u centrifugeert. Voeg vervolgens 52 microliter van eerder gemengde magnetische zuiveringskralen toe aan elke put, meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voordat u centrifugeert. Na het wassen van de kralen met ethanol, verwijdert u de plaat van de magnetische standaard en voegt u 22,5 microliter RSB-buffer toe.Na het mengen, plaatst u de plaat op de magnetische standaard en incubeert u gedurende twee minuten. Zorg ervoor dat het supernatant volledig helder is. Breng voorzichtig 20 microliter van de snat over naar een nieuwe 96-puttenplaat.Om de eerste ronde van PCR-amplificatie te beginnen, voegt u 20 microliter LP PMM en vijf microliter van elk index één en index twee toe aan elk putje. Meng en dek de plaat af met een zelfklevende Micros EAL-folie. Na centrifugatie plaatst u de plaat in de Thermocycler en voert u programma één uit.Na het zuiveren en bepalen van de opbrengst uit de eerste ronde van PCR, begint u met de eerste hybridisatie door maximaal 12 monsters te trekken. In de nieuwe 96-puttenplaat zorgt u ervoor dat het eindvolume van elk pool niet meer dan 40 microliter bedraagt. Meng de NCT een-oplossing grondig en voeg 50 microliter toe aan elke put. Na het toevoegen van 10 microliter CSO, meng en sluit de plaat af.Na centrifugatie plaatst u de plaat in een thermocycler en voert u het programma twee uit. Voor de eerste hybridisatiewas verwijdert u de plaat uit de thermocycler en centrifugeert u. Verwijder kort de zelfklevende deksel heel voorzichtig.Breng 100 microliter reactiemengsel over van de plaat naar een nieuwe MIDI 96-puttenplaat en voeg 250 microliter SMB-oplossing toe. Meng en sluit de plaat af voordat u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incubeert. Na het wassen en weggegooien van het supena, voegt u 200 microliter van de gemengde WS twee-oplossing toe aan putten met kralen en meng grondig. Trans overbreng het hele volume naar een nieuwe 96-puttenplaat.Sluit de plaat af en plaats deze in een thermocycler. Start de thermocycler bij 42 graden Celsius gedurende 30 minuten. Zodra dit voltooid is, plaatst u de plaat onmiddellijk gedurende twee minuten op de magnetische standaard.Zorg ervoor dat het supernatant volledig helder is. Verwijder de afdichting en gooi onmiddellijk al het supernatant weg. Verwijder de plaat van de magnetische standaard.Voeg 200 microliter van de gemengde Ws drie-oplossing toe aan putten met kralen en meng grondig. Na het wassen en verwijderen van het supinate, sluit de plaat af en centrifugeer kort om resterend supine-sediment naar beneden te trekken. Plaats de plaat twee minuten op de magnetische standaard.Gooi het resterende supinate weg. Verwijder vervolgens de plaat van de magnetische standaard. Voeg 23 microliter van het eerder bereide mengsel toe.Na het mengen, sluit de plaat af en laat deze vijf minuten bij kamertemperatuur staan voordat u centrifugeert. Na het overbrengen van 21 microliter sate naar een nieuwe 96-puttenplaat, voegt u vier microliter ET twee-oplossing toe aan elk putje. Meng en sluit de plaat af voordat u centrifugeert.Om de tweede hybridisatie te beginnen, verwijdert u de zelfklevende film en voegt u 50 microliter NCT een, 10 microliter CSO en 15 microliter PCR Grade water toe aan de 25 microliter bibliotheek. Na centrifugatie plaatst u de plaat in een thermocycler en voert u programma twee uit. In een nieuwe 96-puttenplaat mengt u 20 microliter van de evolutie uit de vorige stap.Met 25 microliter T-C-P-M-M en vijf microliter PPC sluit u de plaat na het mengen en centrifugeert u. Plaats vervolgens de plaat in een thermocycler en voert u programma drie de volgende dag uit. Centrifugeer de plaat en was de kralen met ethanol. Verwijder de plaat van de magnetische standaard en voeg 30 microliter RSB-buffer toe.Meng en incubeer de plaat gedurende twee minuten. Plaats de 96-puttenplaat bij kamertemperatuur op de magnetische standaard en incubeer gedurende vijf minuten of totdat het S-supernatant volledig helder is. Breng voorzichtig 28 microliter van de snat over naar een nieuwe 96-puttenplaat.De laatste stap is

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

Werkwijze voor het identificeren van onbekende oorzaken van kanker met een objectieve benadering beschreven. De methode maakt gebruik van...

Identificatie van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Mensen met BRCA1-mutaties hebben een hoger risico op het ontwikkelen van kanker, wat een nauwkeurige evaluatie van de functie van BRCA1-varianten garandeert. Hierin beschreven we een protocol voor functionele beoordeling van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gemedieerde cytosinebasiseditors die gerichte C:G naar T:A-conversie in levende cellen mogelijk maken.

Functionele beoordeling van BRCA1-varianten met CRISPR-gemedieerde basiseditors

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.

Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Leer gDNA-verrijking met transposase-gebaseerde technologie voor NGS-analyse van 11 DNA-herstelgenen, waaronder BRCA1 en BRCA2. Deze methode detecteert genetische variaties efficiënt.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen (Video) | JoVE Journal

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

Meer video's verkennen