Name: Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer hoe je retinale degeneratie en regeneratie induceert bij volwassen zebrafish met MNU-behandeling. Dit protocol combineert optokinetische responsmetingen met histologische en immunohistochemische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Monika Kilchenmann, Federica Bisignani en Agathe Duda voor hun uitstekende technische assistentie.

Alle experimenten gehandeld op grond van de verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek van de Vereniging voor Onderzoek naar Visie en Oogheelkunde (ARVO). 1 Dieren <ol><li> Handhaaf de wildtype zebravis (Danio rerio) van de AB (Oregon) stam onder standaardomstandigheden tussen 6-12 maanden in water met een temperatuur van 26.5 ° C en een 14/10 uur licht / donker cyclus 15. </li><li> Volg het dier zorg richtlijnen van de betrokken instellingen voor de dierproeven na goedkeuring door de kantonrechter Veterinair Bureau. </li></ol> 2 MNU Behandeling <ol><li> Bereid water met 150 mg / l droge stof van N-methyl-N -nitrosourea (MNU). LET OP! MNU is giftig; kan kanker, erfelijke genetische schade of schade toebrengen aan het ongeboren kind. </li><li> Incubeer zebravis in water met het MNU gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Snel met spoelen zebravisvers water en zet de vis naar een nieuw aquarium zonder MNU. Aanvullen vissen onder standaardomstandigheden zo lang als gewenst voor de experimenten. </li></ol> 3 Visual Acuity Meting <ol><li> Start het optomotor systeem, kiest u &#39;testen&#39; in het menu en stel de opties op &quot;Simple Trap&quot;, &quot;Acuity (Freq)&quot; en &quot;Randomized / Aparte&quot; 16. </li><li> Installeer een infuus fles gevuld met 500 ml water op ongeveer 1 m boven de optomotor systeem. </li><li> Plaats een zebravis in het examen kamer en sluit deze aan op de infuuszak. Plaats het onderzoek kamer in de optomotor systeem. </li><li> Start de meting en observeer de oogbeweging in real time op het computerscherm. Daarbij wordt een positief antwoord (&quot;ja&quot;) gedefinieerd als opeenvolgende saccades in de juiste richting, terwijl een negatief antwoord (&#39;nee&#39;) staat voor willekeurige oogbewegingen vergelijkbaar met die waargenomen bij stationary roosters. Als de ogen van de zebravis vertonen drie of meer opeenvolgende optokinetische reacties (OKR), druk op &#39;ja&#39;; zo niet, druk op &#39;nee&#39;. </li><li> Pak de gezichtsscherpte, die is berekend door de software door het bepalen van de drempel van de ruimtelijke frequentie van de optokinetische stimulus, onder &quot;resultaten&quot; in het menu. </li></ol> 4 Histologie <ol><li> Euthanaseren de zebravis door een overdosis van ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (200-300 mg / L) en enucleate de ogen. </li><li> Bevestig de hele ogen in 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C gedurende 12 uur en vervolgens dehydrateren de monsters in een gegradeerde alcohol serie. </li><li> De monsters insluiten in paraffine, gesneden 5 micrometer secties via de oogzenuw (ONH) en monteer ze op een glazen dia&#39;s. </li><li> Vlekken op de deparaffized paraffinecoupes met hemalum voor 4 min en dompel de dia&#39;s twee keer in gedestilleerd water, gevolgd door 0,2% zoutzuur acid en 0,8% ammoniak. Vlekken de secties met eosine voor 3 min na de ontwikkeling van de hemalum kleuring in leidingwater gedurende minstens 10 minuten (H &amp; E). </li><li> De gedroogde dia&#39;s in montage medium insluiten en de dia&#39;s te observeren onder de lichtmicroscoop. </li></ol> 5 Immunohistochemistry <ol><li> Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) <ol><li> Incubeer de gedeparaffineerd secties met 20 ug / ml proteinase K bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was de secties drie keer met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer de secties met 50 ul TUNEL reactiemengsel (10% labelingoplossing en 90% enzymoplossing) in een bevochtigde kamer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Was drie keer met TBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Monteer de dia&#39;s met montage medium met DAPI en de dia&#39;s te observeren onder de fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li><li> Prolifererende celkernantigeen (PCNA) vlekken <ol><li> Kook het ontdaan van paraffine secties antigen retrieval buffer (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) gedurende 3 minuten en was driemaal met TBS gedurende 5 minuten elk. Blokkeer met 100 ui blokkerende oplossing (TBS + 10% normaal geit serum + 1% runderserumalbumine, pH 7,6) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Vlek met anti-PCNA primaire antilichamen in een 1: 200 verdunning in een vochtige kamer bij 4 ° C overnacht. Was drie keer met TBS + Tween 20 gedurende 5 minuten elk. </li><li> Werk de detectie met de geschikte secundaire antilichamen in een 1: 500 verdunning bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Monteer de dia&#39;s met montage medium met DAPI en de dia&#39;s te observeren onder de fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
<li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-N-Nitrosourea+%28MNU%29%3A+A+positive+control+chemical+for+p53%2B%2F-+mouse+carcinogenicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li>
<li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea%3A+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li>
<li>Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).</li>
<li>Tappeiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+rod+regeneration+in+a+novel+zebrafish+retinal+degeneration+model+using+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU).</a> PLOS One. 12, (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Fleisch, C., Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Behavior+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visual Behavior in Zebrafish.</a> Zebrafish. 3, 191-201 (2006).</li>
<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10(2012).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Eerder heeft onze groep de MNU model van fotoreceptor degeneratie overgedragen van knaagdieren in de zebravis systeem 9. De daaropvolgende gebeurtenissen werden beschreven en gevolgd gedurende maximaal 30 dagen. In deze periode volledige retinale degeneratie en morfologische regeneratie trad na de eerste behandeling. Eerst histologie onthult een verminderde staaf celgetal vanaf dag 3 op met een minimum op dag 8 Dienovereenkomstig TUNEL kleuring identificeert apoptose van stang fotoreceptoren 3 dagen na MNU be...

Visie is de meest essentiële zin voor de mens en zijn bijzondere waardevermindering heeft een hoge sociaal-economische impact. In de ontwikkelde wereld, retinale degeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van gezichtsverlies en blindheid bij oudere volwassenen 1. De oorzaak van de meeste degeneratieve retinale ziekten is nog niet duidelijk en therapeutische oplossingen voor verloren gezichtsvermogen herwinnen zeer beperkt. Retinitis pigmentosa is een typisch voorbeeld van een retinale degeneratieve ziekte primaire fotoreceptor verlies 2-3. N-methyl-N -nitrosourea (MNU) induceert retinale degeneratie en wordt daarom veel gebruikt in knaagdieren model ziekten met primaire fotoreceptorcellen celdood 4. Het is een alkylerend middel en leidt tot goedaardige en kwaadaardige tumoren, die meestal verschijnen enkele maanden na blootstelling 5-7. Bovendien veroorzaakt het specifieke lichtgevoelige celdood in een korte observatieperiode. Daarbij, het verlies van de retinale laag structure en significant retinale dunner werden waargenomen bij een concentratie-afhankelijke wijze. Retinale glia cellen geactiveerd, maar geen veranderingen in het retinale pigmentepitheel (RPE) gevonden. Endoplasmatisch reticulum (ER) stressgerelateerde apoptose lijkt de belangrijkste route van MNU actie in de retina 8. We hebben onlangs MNU als een chemisch model naar fotoreceptor degeneratie veroorzaken in de zebravis 9. Onder andere redenen, heeft de zebravis (Danio rerio) belangrijk visueel onderzoek worden als gevolg van de gelijkenissen van zijn visuele systeem met dat van andere gewervelde dieren 10. De buitenste retina bevat fotoreceptoren, die kan bestaan ​​uit vier verschillende types conus met gevoeligheidspieken in het ultraviolet, korte, middellange en lange golflengte van het zichtbare spectrum en een staaf fotoreceptor type. In de binnenste nucleaire laag (INL), worden de cellichamen bipolaire horizontale en amacriene interneuronen vond, als well als de cel soma van Muller gliacellen. In de buitenste plexiform laag (OPL) de synaptische contacten tussen fotoreceptoren en de binnenste netvlies worden gevormd, terwijl de cellaag die het dichtst bij de lens van het ganglion cellaag (GC), welke onderdelen lange axonen, bestaande uit de oogzenuw en het optische-darmkanaal te vormen is . Synaptische contacten tussen de ganglioncellen en de cellen in de binnenste nucleaire laag worden gevormd in het binnenste plexiform laag (IPL) 11. De RPE ligt buiten het neurosensorische netvlies en omringt de fotoreceptor buitenste segmenten met lange apicale microvilli 12. Bovendien is de zebravis zeer regeneratieve en kunnen laesie hersenen, retina, ruggenmerg, hart en andere weefsels 13 teruggroeien. Bij retinale schade ontstaat, cellen in de INL, die vermoedelijk Müller cellen, worden geactiveerd en hebben het potentieel om te differentiëren in verschillende retinale celtypen. Bovendien genereren ze staaf progenitors, die zich in de ONL. Ander zource dat het netvlies van volwassen zebravissen voorziet van nieuwe cellen is de ciliaire marginale zone. Deze bron is nodig om een constante dichtheid van de stang fotoreceptoren bereiken de steeds groeiende zebravisoog 14. De MNU model kan worden gebruikt als een eenvoudige en reproduceerbare degeneratie / regeneratie benadering voor retinale weefsel. Als gevolg van bepaalde overeenkomsten van biologische processen in de zebravis en de mens deze de deuren kon openen om mee celdood paden te identificeren en mogelijke neuroprotectieve drugs screenen. Gebaseerd op een eerdere studie van onze groep, we nu illustreren de werkwijzen van deze MNU geïnduceerde zebravis model van retinale de- en daaropvolgende regeneratie waaronder functionele verandering ten volgens labo&#39;s 9.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>294993</td><td>0,80%</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Denemarken</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI montagemedium</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosine</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>E10521</td><td>Tricaine</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, Zwitserland</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Geit normaal serum</td><td>Dako, Glostrup, Denemarken</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>320331</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>In situ Cell Death Detection Kit</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Zwitserland</td><td>11684795910</td><td>TUNEL Kit</td></tr><tr><td>Mayer's hemalumoplossing</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Methylnitrosoure (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>N4766</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Dako, Glostrup, Denemarken</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-PCNA</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, VS</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus glasplaten</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Duitsland</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris gebufferde zoutoplossing (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Zebravis (Danio rerio) AB (Oregon)-stam</td><td>Universiteit van Fribourg, Afdeling Biologie</td><td>n.v.t.</td><td>Eigen visinstallatie</td></tr></tbody></table>

methyl- (mnu) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Retinale degeneratieve ziekten, zoals retinitis pigmentosa, met de daaruit voortvloeiende schade fotoreceptor maken het merendeel van gezichtsverlies bij de industriële wereld. Diermodellen zijn van cruciaal belang om deze ziekten te bestuderen. In dit verband de fotoreceptor-specifieke toxine N-methyl-N -nitrosourea (MNU) is op grote schaal gebruikt in de knaagdieren om farmacologisch induceren retinale degeneratie. Eerder hebben we een MNU geïnduceerde retinale degeneratie model in de zebravis, een andere populaire modelsysteem visueel onderzoek vastgesteld. Een fascinerende verschil met zoogdieren is de aanhoudende neurogenese in de volwassen zebravissen netvlies en de regeneratie na beschadiging. Om deze waarneming hebben wij gezichtsscherpte metingen die werkzaam zijn in de volwassen zebravissen kwantificeren. Daardoor werd de optokinetische reflex gebruikte functionele mutaties in niet-verdoofde vis volgen. Dit werd aangevuld met histologie en immunohistochemie staining apoptose (TUNEL) en proliferatie (PCNA) de ontwikkeling morfologische veranderingen correleren. Samengevat, apoptose van fotoreceptoren treedt drie dagen na MNU behandeling, gevolgd door een duidelijke vermindering van cellen in de buitenste nucleaire laag (ONL). Daarna wordt proliferatie van cellen in de binnenste nucleaire laag (INL) en ONL waargenomen. Hierin tonen we dat niet alleen een volledige histologisch maar ook een functionele regeneratie plaatsvindt gedurende een tijdsverloop van 30 dagen. Nu illustreren we de methoden te kwantificeren en op te volgen zebravis netvlies de- en regeneratie met behulp van MNU in een video-formaat.

Gezichtsscherpte: De experimentele set-up [ruimtelijke frequentie: 0.042 cirkels / graad (c / d); contrast: 100%; drift snelheid: 20 graden / seconde (d / src); achtergrondverlichting helderheid: 152 cd / m 2] van deze studie mogelijk OKR beoordeling van volwassen zebravissen. De gemiddelde duur van VA meting was ongeveer 5 - 10 minuten per zebravis, dat de procedure goed verdragen. Gezichtsscherpte vóór MNU blootstelling was 0.577 ± 0.014 cycli / graad (c / d). Figuur 1</...

Hierin tonen we kwantificering van retinale de- en regeneratie en de impact ervan op de visuele functie met behulp van N-methyl-N -nitrosourea in de volwassen zebravissen. Verlies van gezichtsscherpte en verminderde fotoreceptor nummers volgde proliferatie in de binnenste kernlaag. Compleet morfologische en functionele regeneratie trad 30 dagen na de eerste behandeling.

Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Het algemene doel van deze procedure is om retinale degeneratie en daaropvolgende regeneratie in de volwassen zebravis te induceren met behulp van n methyl en nitro ueaa. Dit wordt bereikt door wilde zebravissen eerst te incuberen in water dat N methyl N nitroso ureum, of MNU, bevat. Vervolgens wordt de visuele functie gekwantificeerd door de optokinetische respons of OKR te meten en de visuele scherpte op verschillende tijdstippen te berekenen.Na de behandeling worden de zebravissen geëuthanaseerd en worden de ogen genucleeerd voor histologische onderzoeken met behulp van h en e kleuring om morfologische veranderingen in het retinale weefsel te observeren. Ten slotte worden cellulaire veranderingen in de retina gevisualiseerd met specifieke kleuring voor celdood en proliferatie. Uiteindelijk worden meting van visuele scherpte en kwantificering van morfologische en cellulaire veranderingen gebruikt om retinale degeneratie en regeneratie te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van dit farmacologische model is dat het eenvoudig en snel te gebruiken is en betrouwbare regionale degeneratie en regeneratie induceert bij volwassen zebravissen. Om NM methyl n nitroso ureum of MNU behandeling uit te voeren, begint u met het bereiden van water dat 150 milligram per liter droge MNU bevat. Wees voorzichtig bij het werken met nm methyl en nitroso ureum, omdat het giftig is en kanker, erfelijke genetische schade of schade kan veroorzaken. Houd een ongeboren kind in stand met type AB-stam, zebravissen zes tot 12 maanden oud onder standaard omstandigheden.Breng zebravissen over in het MNU-water en incubeer ze gedurende 60 minuten op kamertemperatuur. Gebruik vervolgens vers water om de vissen snel af te spoelen voordat u ze overbrengt naar een nieuwe vissentank zonder MNU. Houd de vissen onder standaard omstandigheden zolang als gewenst voor experimenten.Bereid u voor om visuele scherptemetingen te nemen door het motorsysteem te starten. Kies vervolgens uit het menu testen en stel de opties in op eenvoudige trap. Installeer een infuusfles gevuld met 500 milliliter water ongeveer een meter boven het motorsysteem.Plaats een zebravis in de onderzoekskamer en verbind hem met de infuusfles. Plaats vervolgens de onderzoekskamer in het automotive systeem. Start vervolgens de meting en observeer de oogbeweging in realtime op het computerscherm.Een positief antwoord of ja, wordt gedefinieerd als opeenvolgende seconden in de juiste richting, terwijl een negatief antwoord of nee willekeurige oogbewegingen vertegenwoordigt, vergelijkbaar met die waargenomen bij stationaire rasters. Als de ogen van de zebravis drie of meer opeenvolgende optokinetische reacties of OKR's vertonen, drukt u op ja. Als dat niet het geval is, drukt u op nee.Onder resultaten in het menu, extraheer de visuele scherpte, die is berekend door de software door het bepalen van de drempel van de ruimtelijke frequentie van het optisch kinetische stimulus om histologische analyse uit te voeren. Na het euthanaseren van de zebravis volgens het tekstprotocol en in nucleerende, gebruik 4% formaldehyde in PBS om de intacte ogen gedurende 12 uur te fixeren bij vier graden Celsius voordat u een gegradeerde alcoholreeks gebruikt om de monsters te dehydrateren, de monsters in paraffine in te bedden en vervolgens vijf micrometer secties door de hoofdnerf of ONH te snijden en ze op glazen platen te monteren. Gebruik vervolgens Alam om de gedecarboniseerde secties vijf minuten te kleuren voordat u de platen twee keer in gedestilleerd water doopt, gevolgd door 0,2% zoutzuur en 0,8% ammoniak.Verplaats de platen gedurende ten minste 10 minuten in kraanwater. Breng de secties na het wassen en dehydratatie van de platen met een ethanolreeks gedurende drie minuten in eosin. Gebruik montagemedium om ze in te bedden en een lichtmicroscoop om de monsters te observeren voor terminaal, de oxy nucleotide transferase, DUPT Nick n-labeling of tunnel.Voeg 20 microgram per milliliter pronase K toe om secties te depariseren en incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Na het wassen van de secties drie keer gedurende vijf minuten elk met tris-gebufferd zoutwater, voegt u 50 microliter van het tunnelreactiemengsel toe aan de secties en incubeer ze in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 60 minuten. Zodra de monsters zijn gewassen en triss drie keer gedurende vijf minuten elk, gebruik montagemedium met dappy om de platen te monteren voordat u ze onder een fluorescentiemicroscoop gebruikt om proliferating cell nuclear antigen of PCNA kleuring uit te voeren.Plaats de monsters in antigeenretrieval, buffer en kook gedurende drie minuten voordat u ze drie keer gedurende vijf minuten elk in TBS wast met behulp van blokkeringsbuffer, incubeer de monsters gedurende een uur bij kamertemperatuur. Vervolgens met een verdunning van 1 op 200 van anti-PC NA.Primaire antilichamen, incubeer de monsters in een bevochtigde kamer gedurende een nacht bij vier graden Celsius na het wassen van de monsters met TBS plus twee keer gedurende vijf minuten elk. Gebruik een verdunning van 1 op 500 van secundaire antilichamen om de monsters een uur bij kamertemperatuur te incuberen.Zodra de platen zijn gemonteerd met montagemedium dat dpi bevat, observeer ze onder de fluorescentiemicroscoop. Deze figuur toont het verloop van de visuele scherpte voor volwassen zebravissen na de toediening van 150 microgram per liter MNU. Beginnend met dag één, toonden de metingen een merkbare afname van de visuele scherpte, die op dag drie minimale waarden bereikte vóór een toename van de waarden.Geprocedeerd op dag acht en bereikte een volledige herstel op dag 30 zoals te zien is door histologische analyse van de retinale degeneratie van het oog van de zebravis, die gedurende 30 dagen na MNU-behandeling werd gevolgd, inclusief verstoring van de INL met holtevorming van de ONL beginnend op dag drie, en met maximale verlies van Rod ONL waargenomen op dag acht door positieve tunnelkleuring in verschillende lagen van de sensorische retina. Het werd waargenomen dat retinale degeneratie na MNU-behandeling werd veroorzaakt door apoptose met de meeste tunnel-positieve cellen gevonden in de ONL op dag drie. Echter, stervende cellen werden ook gezien in de INL op hetzelfde tijdstip.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Meerdere lichte schade protocollen zijn beschreven schade fotoreceptoren en dientengevolge een netvlies regeneratie respons bij volwassen zebravissen induceren. Dit protocol beschrijft een verbeterde werkwijze die kan worden gebruikt in gepigmenteerde dieren en beschadigt de meeste staafjes en kegeltjes fotoreceptoren over de gehele retina.

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.

Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de door de galgangen gestuurde leverregeneratie bij zebravis te helpen beoordelen, hebben we een leverbeschadigingsmodel opgesteld waarin de nitroreductase-expresserende hepatocyten genetisch worden afgebroken na behandeling met metronidazol. In dit protocol beschrijven we hoe we op bekwame wijze hepatocytenafbraak en door galgangen gestuurde leverregeneratie kunnen manipuleren, bewaken en analyseren.

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Blootstelling aan teratogens kan geboorteafwijkingen veroorzaken. Zebravis zijn nuttig voor het bepalen van het teratogeen potentieel van chemicaliën. We demonstreren het nut van zebravis embryo's door blootstelling aan verschillende niveaus van nitriet en ook op verschillende tijden van blootstelling. We tonen aan dat nitriet giftig zijn en ernstige ontwikkelingsstoornissen.

Zebravis als een model om de teratogene potentie van nitriet Assess

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Voor de evaluatie van nieuwe stamcellen therapieën is het belangrijk om niet-invasief spoor de geïnjecteerde cellen in vivo. Deze video toont u hoe de menselijke mesenchymale en embryonale stamcellen met ijzeroxide gebaseerde contrastmiddelen label in vivo voor latere MR imaging in vivo.

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

Acute nierschade (AKI) bij de mens is een veel voorkomend klinisch probleem wordt veroorzaakt door schade aan de epitheliale cellen die de nieren nefronen bevatten, en de AKI wordt geassocieerd met een hoge sterfte van...

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Leer hoe je retinale degeneratie en regeneratie induceert bij volwassen zebrafish met MNU-behandeling. Dit protocol combineert optokinetische responsmetingen met histologische en immunohistochemische analyses.

Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Meer video's verkennen