Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Het algemene doel van het volgende experiment is om een eiwitreceptorinteractie aan te tonen met behulp van oppervlakteplasma en resonantie. Dit wordt bereikt door de nikkelionen te injecteren over het nitro tri-azijnzuur of NTa-matrix. Vervolgens wordt een van de eiwitten, het ligand genoemd, geïmmobiliseerd op de sensorchip na een blanco injectie.

Het tweede eiwit, het analiet genoemd, wordt geïnjecteerd over het geïmmobiliseerde ligand. Om een interactie tussen de twee eiwitten te detecteren, laten de resultaten zien dat de twee eiwitten tijdelijk interacteren, het analiet associeert en dissocieert van het ligand. De affiniteit van de interactie kan worden berekend op basis van de gemeten dissociatie- en dissociatiesnelheden van de twee eiwitten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals pull down of immunoprecipitatie, is dat het tijdelijke of laag-affiniteit interacties kan identificeren die vaak van groot biologisch belang zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biochemie, zoals of het eiwit van belang bindt aan een ander eiwit of een ander klein molecuul, de aard van de interactie kan worden bepaald en de affiniteit kan worden gemeten. Om de monster voor te bereiden, verwijdert u alle aggregaten uit het gezuiverde eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bereid de loopbuffer voor en filter alle buffers en eiwitmonsters met behulp van 0,22 micron filters. Zorg ervoor dat de filters vooraf compatibel zijn met eiwitten voordat u de loopbufferfles aansluit op de pompinlaat. Bewaar 10 milliliter van de loopbuffer apart in een aparte buis.

Verdun vervolgens de monsters tegen de loopbuffer om bufferongelijkheden te voorkomen. Als vuistregel geldt: gebruik voor stabiele liganddemobilisatie lage ligandconcentraties met langere injecties bij lage stroomsnelheid in tegenstelling tot hoge ligandconcentraties met kortere injecties bij hoge stroomsnelheid. Verdun de geconcentreerde ligandstockoplossing in loopbuffer tot een eindconcentratie van ongeveer 20 microgram per milliliter. Verdun tenslotte het analiet in de loopbuffer tot de gewenste concentratie.

Voor een systeem met onbekende affiniteit, test een reeks analietconcentraties van 10 micromolar tot 10 anomolar in tienvoudige verdunning. In deze demonstratie wordt een NTA-gekoppelde chip die geschikt is voor het vangen van eiwitten met een oli histidine-tag, hergebruikt. Nadat de opgeslagen chip uit de buffer is genomen, spoelt u deze grondig met dubbel gedestilleerd water, droogt u deze voorzichtig en plaatst u deze in zijn oorspronkelijke schede.

Om de chip op het SPR-instrument te plaatsen, opent u de sensorchipdeur en plaatst u de chip in zijn schede. Sluit de deur en druk op chip docken. Stel de chipceltemperatuur in op 25 graden Celsius.

Stel het monstercompartiment in op zeven graden Celsius om het eiwit gedurende het hele experiment stabiel te houden. Nadat u de oplossingen voor laden en strippen hebt voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol, primet u het SPR-instrument met loopbuffer. Voor de volgende stap, stelt u de stroomsnelheid in op 50 microliter per minuut.

Definieer de stroompaden en referentie-aftrek om de hier beschreven resultaten te verkrijgen. Stel de paden in op flowcel nummer één en flowcel nummer twee en flowcel nummer één, afgetrokken van flowcel nummer twee, na het selecteren van het geschikte monsterrek, slaat u het resultatenbestand op voordat u met het experiment begint, zodat de gegevens tijdens de uitvoering worden opgeslagen. Elk experiment bestaat uit cycli.

Houd een duidelijk overzicht bij van de injecties die in elke cyclus zijn gedaan en scheid de liganden, de blanco injectie van het buffer en de analietinjectie in verschillende cycli. Cyclus één is chipvoorbereiding en nikkelbelasting. Zorg ervoor dat de stroom en paden zijn ingesteld en injecteer vervolgens 350 millimolar EDTA gedurende één minuut om resterende moleculen weg te spoelen.

Stel vervolgens de stroomsnelheid in op 10 microliter per minuut. Injecteer vervolgens 0,5 millimolar nikkelchloride gedurende twee minuten. Nu is de chiphars bedekt met nikkelionen.

Cyclus twee is ligand-immobilisatie. Stel de stroomsnelheid in op 15 microliter per minuut en stel het stroompad in op flowcel. Injecteer ligand A tot het bereiken van responswaarden of R ru-waarden die 10 tot 20 keer de molecuulgewicht van het ligand zijn.

Laad bijvoorbeeld een ligand van 50 kilodalton tot tussen 501.000 ru. Houd een record bij van de bereikte RU-waarde. Stel vervolgens de stroomsnelheid in op 15 microliter per minuut en het stroompad op flowcel nummer één, injecteer controle-ligand B tot dezelfde RU-waarde als die van ligand a, bewaak de aftrek, sensori Graham online om te helpen bij het beheersen van de injectielengte.

Stel vervolgens de stroomsnelheid in op 50 microliter per minuut en het stroompad op flowcel nummer één en flowcel. Ga door met het wassen van het systeem gedurende vijf tot twintig minuten totdat de basislijn zich stabiliseert. Cyclus drie is de blanco injectie.

Deze injectie dient voor blanco aftrek. Bevat daarom alle componenten die met het analiet zullen worden geïnjecteerd, behalve het analiet zelf. De injectielengte kan variëren afhankelijk van de tijd die nodig is om het evenwicht te bereiken.

Stel de stroomsnelheid in op 15 microliter per minuut en stel het stroompad in op flowcel nummer één en flowcel nummer twee, en flowcel nummer één, afgetrokken van flowcel. Voer de gewichtsopdracht gedurende 30 seconden in om een stabiele basislijn te bereiken. Injecteer vervolgens de loopbuffer gedurende 13 seconden.

Wacht 120 tot 600 seconden om de dissociatiefase op te nemen. De lengte van deze stap varieert afhankelijk van de kd. Hoe langzamer de dissociatie, hoe langer deze stap moet zijn.

Cyclus vier is analietinjectie. Kopieer en plak de exacte voorwaarden die in cyclus drie zijn gebruikt, zodat deze twee injecties later kunnen worden afgetrokken. Verander de locatie van de sleuf