Name: In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer de in vitro synthese van gemodificeerde mRNA voor eiwitexpressie in menselijke cellen. Deze methode omvat PCR-amplificatie, transcriptie en transfectie zonder genoomintegratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd door het Europees Sociaal Fonds in Baden-Wuerttemberg, Duitsland.

1. Vergroting van plasmiden die Vereiste codering van DNA-sequenties (CDS) <ol><li> Voorverwarmen SOC medium, dat is opgenomen in de transformatie kit, tot kamertemperatuur en de LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline bij 37 ° C. Equilibreer het waterbad tot 42 ° C. </li><li> Dooi een flacon van chemisch component E. coli op ijs. </li><li> Voeg 1-5 ul van het plasmide (10 pg tot 100 ng) met de CDS in de flacon met chemisch component E. coli en meng voorzichtig. Laat de cellen niet meng door pipetteren. Na het toevoegen van plasmiden, meng door het buisje te tikken. </li><li> Incubeer het mengsel op ijs gedurende 30 min. </li><li> Heat-shock de E. coli gedurende 30 seconden bij 42 ° C in een waterbad zonder schudden. </li><li> Plaats de flacon op ijs gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg 250 ul voorverwarmde SOC medium om de E. coli en schud de bacteriën horizontaal bij 300 rpm gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bacteriële incubator. </li><li><html> Spread 100 ui en 150 ui van transformatiemengsel op voorverwarmd LB agarplaten, de platen om en incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Nadat kolonies zichtbaar, enten een enkele kolonie van elke plaat in een 15 ml kweek buis met 5 ml LB-medium met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer ze een nacht bij 37 ° C onder schudden bij 300 rpm tot cultuur in late log of stationaire fase. </li><li> Voor de lange termijn opslag van getransformeerde E. coli Pipetteer 75 ul 100% glycerol in het cryovial. Voeg 225 ul van de bacteriecultuur (ingevroren voorraad zal 25% glycerol), goed mengen en opslaan van de cryovial bij -80 ° C. </li><li> Isoleer de plasmiden die de gewenste CDS met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Bepaal de plasmideconcentratie met een spectrofotometer. </li><li> Aliquots van 20 pl en opgeslagen bij -20 ° C gedurende langere tijd. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Versterking van plasmide Inserts en toevoegen van Poly T-tail door Polymerase Chain Reaction (PCR) <ol><li> Opmerking: Om de DNA-matrijs voor de in vitro transcriptie (IVT), de CDS van belang hier eGFP, wordt geamplificeerd met behulp van PCR verkregen. Tegelijkertijd wordt een poly T-staart van 120 thymidinen (T) op het insert toegevoegd onder gebruikmaking van een reverse primer met een T 120 extensie. Waarbij de aangemaakte mRNAs verkrijgen van een poly A-staart met een gedefinieerde lengte na IVT. </li><li> Bereid PCR mengsel zoals beschreven in tabel 1. </li><li> Meng de reactie mix grondig. OPMERKING: PCR product kan worden gebruikt in 4-5 IVT reacties. Om het DNA template bedrag voor IVT verhogen, kan totale volume van het PCR mengsel worden verhoogd. Verschillende PCR buisjes die elk 100 pi PCR mengsel worden gebruikt om een ​​voldoende opbrengst aan PCR product. </li><li> Plaats de PCR buizen in een thermocycler en laat de PCR met de PCR cycling protocol (Tabel 2). </li><li> Het schoonmaken van de PCR reactie met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant en elueer het DNA met 20 ul nuclease-vrij water. </li><li> Meet de concentratie van het DNA met een spectrofotometer. OPMERKING: De gedetecteerde DNA-concentratie is ongeveer 300 pg / ml. Derhalve dient de verwachte totale ~ 6 ug. De hoeveelheid van DNA van andere eiwitten kan afhankelijk van de lengte van CDS, hoeveelheid plasmide gebruikt voor PCR, annealing temperatuur van primers en cyclusnummer. </li><li> Bevries het DNA bij -20 ° C gedurende een lange tijd of zodanig gebruikt voor IVT. </li></ol> 3. Controle Stap: Kwaliteit van de PCR-product <ol><li> De kwaliteit van het PCR product door gel elektroforese DNA. </li><li> Meng de gewenste hoeveelheid agarose met 1x TBE in een kolf. Voor een 1% agarose gel, voeg 0,5 g agarose 50 ml 1x TBE. </li><li> Magnetron tot de agarose is opgelost. Laat het niet koken. Zorg ervoor dat de agarose volledig in oplossing. </li><li> Voeg 5 gl nucleïnezuur gel vlek 50 ml agarose gel. </li><li> Giet de gel in een agarosegel doos, zet de kam, en wacht ongeveer 1 uur totdat de gel gestold. </li><li> Verwijder de kam en plaats de doos gel in een gel lade. </li><li> Meng 2 pl (200 ng) van 80-10,000 bp DNA ladder en 200 ng PCR-product met elk 2 pl 6x laadbuffer in een totaal volume van 12 pl. </li><li> Laden DNA monsters voorzichtig in de putjes van de agarose gel. </li><li> Met behulp van 1x TBE als running buffer, lopen de agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur. </li><li> Visualiseren DNA banden op een beeldvormingssysteem (figuur 2). </li></ol> 4. In vitro transcriptie (IVT) <ol><li> OPMERKING: Na PCR werd het plasmide inserts worden geamplificeerd en een poly T-staart toegevoegd. Tijdens de IVT wordt genetische informatie getranscribeerd van DNA naar RNA. De gegenereerde mRNA transcript wordt gebruikt om eiwitten in cellen. </li><li> Reinig de werkruimte en pipetten met een RNase decontamination oplossing. Gebruik PCR schoon en steriel dual-filter pipet tips en vaak veranderen handschoenen om besmetting te minimaliseren van de reactie vermengt met RNases. </li><li> Bereid de NTP / cap analoog mengsel als beschreven in Tabel 3. </li><li> Meng de NTP / dop analoge mengsel goed door vortexen en spin down kort. </li><li> Monteer de IVT reactiemengsel zoals beschreven in Tabel 4. </li><li> Meng de IVT reactiemengsel grondig door de pipet voorzichtig op en neer. Centrifugeer de PCR-buis kort het mengsel verzamelen op de bodem van de buis. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur in een thermomixer. OPMERKING: De optimale incubatietijd afhankelijk van de lengte van de inserties en transcriptionele efficiëntie van template gegeven. Voor korte inzetstukken (&lt;500 nt), kan een langere incubatietijd voordelig zijn. Een tijdsverloop experiment kan worden gedaan om de optimale incubatietijd voor een maximale opbrengst te bepalen. Daarom zetten IVT reacties, voor example, 1, 2, 3, 4, 6 uur en overnacht incubatie en bepalen de hoeveelheid mRNA. De kinetiek van de in vitro transcriptie voor het genereren van eGFP mRNA wordt getoond in figuur 3. </li><li> Om het matrijs-DNA te verwijderen, 1 gl DNase (2 U / pl) aan de IVT reactiemengsel mengen en incubeer 15 min bij 37 ° C. </li><li> Zuiver het reactiemengsel met een RNA zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Elueer het gemodificeerde mRNA van de spinkolom membraan tweemaal met 40 ul nuclease-vrij water. OPMERKING: De gedetecteerde RNA-concentratie is ongeveer 1500 pg / ml. Derhalve dient de verwachte totale ~ 120 ug. De hoeveelheid mRNA gesynthetiseerde andere eiwitten kan afhankelijk van de lengte van CDS en de hoeveelheid PCR product voor IVT. </li></ol> 5. Behandeling van gezuiverde mRNA met Antarctische Phosphatase <ol><li> OPMERKING: De gegenereerde mRNA behandeld met fosfatase verwijderen 5 &#39;trifosfaten, die kunnen worden herkend door RIG-I en tot immuunactivatie. Bovendien is de fosfatase behandeling voorkomt opnieuw circularization als zelfstandige ligatiereactie. </li><li> Voeg 9 ul van 10x reactiebuffer Antarctische fosfatase tot 79 pl gezuiverd mRNA oplossing. Voeg vervolgens 2 pl Antarctische fosfatase (5 U / ul) en het monster wordt zachtjes mengen. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Zuiver het reactiemengsel met een RNA zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Elueer het gemodificeerde mRNA van de spinkolom membraan tweemaal met 50 ul nuclease-vrij water. </li><li> Meet de concentratie van het gemodificeerde mRNA met een spectrofotometer. Controleer dat de verhouding van de absorptie bij 260 nm / 280 nm (A260 / A280) is ≥ 1,8 en de verhouding A 260 / A 230 is 2,0, wat aangeeft zuiverheid. OPMERKING: De verwachte totale opbrengst moet ongeveer 90 ug te zijn, dat is sufficient ongeveer 36 mRNA transfecties. </li><li> Stel de concentratie van mRNA tot 100 ng / pl door toevoeging van nuclease-vrij water. </li><li> Aliquot het gemodificeerde mRNA in single-aliquots vereist voor transfecties en bewaar bij -80 ° C. Vermijd meerdere bevriezen en ontdooien cycli. Goed voorbereid en opgeslagen mRNA stabiel gedurende vele jaren. Tijdens het werken, altijd de gewijzigde mRNA op ijs. </li></ol> 6. Controle Stap: Kwaliteit van Gesynthetiseerd Gemodificeerde mRNA <ol><li> Controleer de kwaliteit van gemodificeerde mRNA door RNA gelelektroforese. </li><li> Meng de gewenste hoeveelheid agarose met 1x TBE in een kolf. Voor een 1% agarose gel, voeg 0,5 g agarose 50 ml 1x TBE. </li><li> Magnetron tot de agarose is opgelost. Laat het niet koken. Zorg ervoor dat de agarose volledig in oplossing. </li><li> Voeg 5 gl nucleïnezuur gel vlek 50 ml agarose gel. </li><li> Giet de gel in een agarosegel doos, zet de kam, en wacht ongeveer 1 uur totdat de gel is solidified. </li><li> Verwijder de kam en plaats de doos gel in een gel lade. </li><li> Meng 3 pl (3 ug) van 0,5-10 kb RNA Ladder en 200 ng mRNA gesynthetiseerd gemodificeerd met elk 7 ul loading buffer in een totaal volume van 10 pl. De samenstelling van de laadbuffer wordt beschreven in Tabel 5. </li><li> Denatureren de ladder en het mRNA monsters bij 70 ° C gedurende 10 min. </li><li> Laadt de ladder en de mRNA monsters op 1% agarose gel zorgvuldig. </li><li> Voer elektroforese bij 100 V gedurende 1 uur met 1x TBE als loopbuffer. </li><li> Visualiseren ladder en mRNA banden op een UV transilluminator en foto met een gel documentatiesysteem (figuur 4). </li></ol> 7. Voorbereiding van Cellen voor transfectie <ol><li> Plaat 2 x10 5 cellen (HEK293 cellen) per putje van 12-well plaat. </li><li> Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C in een cel incubator. OPMERKING: Op de dag van transfectie, moet de cellen hebben reached 80-90% samenvloeiing. </li></ol> 8. Het uitvoeren van mRNA Transfectie van Cellen <ol><li> Ontdooi de gewijzigde mRNA. </li><li> Genereren lipoplexen voor transfectie. </li><li> Voeg 25 pl (2,5 ug) van gemodificeerde mRNA en 2 pl kationisch lipide transfectie reagens 473 ul Opti-MEM (minimaal essentieel medium) I gereduceerd serum medium om de transfectie mengsel voor transfectie van een putje van een 12-wells plaat genereren. Opschalen volumes volgens het aantal putten te transfecteren. Als negatieve controle, bereiden een transfectie mengsel zonder mRNA. </li><li> Meng de componenten voorzichtig door pipetteren. Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 min lipoplexen voor transfectie genereren. OPMERKING: De transfectie mengsel bevat geen antibiotica. Dus, zorg om de steriliteit te waarborgen en tegelijkertijd de behandeling van de cellen. </li><li> Was de cellen met 500 gl DPBS / putje. </li><li> Voeg 500 ul transfectie mengsel een putje van een 12-well plaTE. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Zuig het transfectie mengsel en voeg 1 ml volledig celkweekmedium aan de cellen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de cel incubator. </li><li> Voer fluoriscentiemicroscopische analyseert met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 5). OPMERKING: Om de expressie van andere eiwitten in cellen, die worden geproduceerd door transfectie met andere mRNA dan eGFP codering mRNA te onderzoeken, kunnen de cellen worden gekweekt op dekglaasjes. Dan de transfectie kan worden uitgevoerd en de cellen worden gekleurd met geschikte antilichamen en door fluorescentiemicroscopie geanalyseerd. </li></ol> 9. Flowcytometrische Analyses van eGFP Expressie in cellen <ol><li> Verwijderen celkweekmedium uit de putjes en spoel elk putje met 1 ml DPBS (zonder calcium en magnesium). Voeg 500 ul trypsine / EDTA per putje om de cellen los van het oppervlak van celkweek platen. Voeg vervolgens 500gl per putje TNS trypsine te inactiveren. </li><li> Centrifugeer de losgemaakte cellen gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant zodat alleen de pellet. Resuspendeer de celpellet in 150 ui cel fixatie oplossing en breng de celsuspensie in een flowcytometrie buis. </li><li> Analyseer het percentage van eGFP expressie brengende cellen en de fluorescentie-intensiteit met Geo Mean (geometrisch gemiddelde fluorescentie-intensiteit) (Figuur 6). </li></ol> 10. Meting van Protein Expression Over Time <ol><li> Voer mRNA transfectie van cellen in 3 wells van een 12-well plaat zoals beschreven in stap 8. Bovendien incubeer 3 putjes van HEK293 cellen met de transfectie mengsel zonder toevoeging van mRNA. </li><li> Meet de expressie van eGFP 1, 2 en 3 dagen na transfectie met de duur van eiwitexpressie (figuur 7) te evalueren. </li></ol>

<ol><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+%26%2334%3Bgene+therapy%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &#34;gene therapy&#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li>
<li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+Optimized+Wilms%26%2334%3B+Tumor+1+%28WT1%29+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Design of an Optimized Wilms&#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).</li>
<li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized%2C+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li>
<li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+drug+discovery+%26+development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De mRNA therapie enorm potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, behandeling van ziekten en vaccinatie. In deze video tonen we de productie van een gestabiliseerd, gemodificeerd mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen. Met dit protocol kunnen andere gewenste mRNA gegenereerd. De in vitro synthese van gemodificeerde mRNA kan de transfectie van cellen met gewenste mRNA expressie van doeleiwitten induceren. Daardoor wordt het gewenste eiwit transiënt tot expressie gebracht onder fysiologische...

In cellen de transcriptie van messenger RNA (mRNA) en de volgende translatie van mRNA in de gewenste eiwitten de goede werking van de cellen. Erfelijke of verworven genetische aandoeningen kan leiden tot onvoldoende en disfunctionele synthese van eiwitten en ernstige ziekten. Dus een nieuwe therapeutische benadering voor de produktie van ontbrekende of defecte eiwitten induceren exogene levering van synthetisch gemodificeerde mRNA in cellen, die codeert voor het gewenste eiwit. Daardoor worden cellen geactiveerd om functionele eiwitten, die ze normaal niet produceert of zou uiteraard niet moeten synthetiseren. Met deze benadering kunnen genetische aandoeningen worden gecorrigeerd door het inbrengen van mRNA dat codeert voor de defecte of ontbrekende eiwit 1. De mRNA therapie kan ook worden gebruikt voor vaccinatie eiwit antigenen die worden uitgedrukt door tumorcellen of pathogenen synthetiseren. Daardoor kan gastheerimmuunsysteem worden geactiveerd om effectief elimineren tumorcellen of Infe voorkomenCTIES 2,3. Bovendien afgelopen jaren mRNA succes gebruikt geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) genereren. Hiertoe werden fibroblasten getransfecteerd met mRNA induceren de expressie van herprogrammering factoren 4-6 en om te zetten in iPSCs met een enorm potentieel regeneratieve geneeskunde. Eerder is het gebruik van conventionele mRNA geassocieerd met lage stabiliteit en sterke immunogeniciteit. Aldus klinische toepassingen van conventionele mRNA beperkt. De vervanging van cytidine en uridine van 5-methylcytidine en pseudouridine in het mRNA-molecuul door Kariko en collega rendered mRNA-moleculen stabiel in biologische vloeistoffen en drastisch verminderd immuunactivatie 7-10, die nu kan de klinische toepasbaarheid van gemodificeerde mRNA. Met synthetisch geproduceerde gemodificeerde mRNA, kan gewenst gen transcripten tijdelijk worden geleverd in vivo 11of in vitro om eiwitexpressie te induceren. De geïntroduceerde mRNA wordt vertaald onder fysiologische omstandigheden door de cellulaire translatie machinerie. Wegens gebrek aan integratie in het gastheergenoom opzichte virale gentherapie vectoren, is het risico van oncogenese voorkomen 12,13. Zo zal de behandeling met behulp van gemodificeerde synthetische mRNA krijgen betere klinische acceptatie in de toekomst. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de productie van gemodificeerde mRNA (figuur 1), transfectie van cellen met mRNA en de evaluatie van eiwitexpressie in getransfecteerde cellen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Celcultuur</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS zonder calcium en magnesium&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Trypsin / 0,03% EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Trypsin Neutralizing Solution, 0,05% trypsine-inhibitor in 0,1% BSA</td></tr><tr><td>HEK-293 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Tissucuur platen, 12-well&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur fles (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase-en RNase-vrije 1,5 ml steriele microcentrifuge buisjes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml conische buisjes&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR schone en steriele epT.I.P.S. dualfilter pipettenpunten&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &micro;l: 022491202; 100 &micro;l: 022491237; 1.000 &micro;l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml polypropyleen ronde bodem buis voor bacteriecultuur&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasmidversterking en zuivering</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemisch component Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Steriele water (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Los op 25 g L-1 in steriele water.</td></tr><tr><td>LB agar (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Los op 40 g L-1 in steriele water.</td></tr><tr><td>Ampicillin Ready Made Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mRNA productie</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5&acute;-trifosfaat&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>Pseudouridine-5&acute;-trifosfaat&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNA cap structuur analoog&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro;l&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&micro;l (van MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap oplossing&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfectie</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Cationic lipid transfectiereagens</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Verbeterd Minimum Essentieel Medium (MEM) dat een vermindering van Foetale Rundserum (FBS) suppletie mogelijk maakt&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Gelelektroforese</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10.000x in water&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow cytometry analyses</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentraat&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Primer voor insertversterking en poly (T) staart PCR</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC-grade) 10 &micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&acute;</td></tr><tr><td>Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&acute;</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Cel incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO2 (5%) en O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>CASY celteller&nbsp;</td><td>Sch&auml;rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele werkbank&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterie incubator&nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop spectrofotometer&nbsp;</td><td>Analytic Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf

in vitro synthese van gemodificeerde mrna voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

De afgifte van exogene coderende synthetische messenger RNA (mRNA) voor inductie van eiwitsynthese in gewenste cellen enorm potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, fundamentele celbiologie, behandeling van ziekten en herprogrammering van cellen. We beschrijven hier een stapsgewijze protocol voor het genereren van gemodificeerde mRNA met verminderde immuunactivatie en potentieel verhoogde stabiliteit, kwaliteitscontrole van geproduceerde mRNA, transfectie van cellen met mRNA en verificatie van de eiwitexpressie geïnduceerd door flowcytometrie. Tot 3 dagen na een transfectie met eGFP mRNA, de getransfecteerde HEK293 cellen eGFP. In deze video artikel, wordt de synthese van eGFP mRNA beschreven als een voorbeeld. Echter, de procedure worden toegepast voor de productie van andere gewenste mRNA. Met de synthetische gemodificeerde mRNA, kunnen cellen worden geïnduceerd om de gewenste eiwitten, die zij normaal gesproken niet tot expressie transient expressie.

Met een pcDNA 3.3 plasmide dat de CDS van eGFP, de synthese van gemodificeerde eGFP mRNA werd vastgesteld (figuur 1). Na insertie amplificatie met PCR en poly T-tailing is een duidelijke band met een lengte van ongeveer 1100 bp gedetecteerd (Figuur 2). Verhogen van de IVT tijd Augmented de opbrengst van mRNA (figuur 3). Na de IVT, werd een duidelijke band mRNA met een lengte van ongeveer 1100 bp gedetecteerd, hetgeen overeenkomt met de lengte van eGFP mRNA te produceren...

In deze video artikel beschrijven we de in vitro synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen.

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Het algemene doel van deze procedure is de in vitro synthese van gemodificeerd mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen. Dit wordt bereikt door eerst het plasmide-insert of de coderende DNA-sequentie te versterken en een poly T-staart van 120 thymidine toe te voegen met behulp van polymerasekettingreactie. De tweede stap is de in vitro transcriptie van het gegenereerde DNA naar mRNA met poly adenine-staarten.Vervolgens wordt het sjabloon-DNA verwijderd door D'S-behandeling van het in vitro transcriptiereactiemengsel. De laatste stap is de Antarctische fosfatasebehandeling van het geproduceerde mRNA om vijf prime-fosfaten te verwijderen. Uiteindelijk worden cellen getransfecteerd door de gegenereerde mRNA, lipidecomplexen.Fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie-analyse worden gebruikt om de synthese van verbeterd GFP in cellen te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals virale transfectie, is het ontbreken van integratie in het genoom van de gastheercel, wat het risico op oncogenese voorkomt. Deze methode kan helpen om ontbrekende of defecte eiwitten in cellen te produceren en kan worden gebruikt voor vaccinatiebehandeling van genetische aandoeningen.En op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zal de procedure worden aangetoond door Steinle, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Voorafgaand aan het begin van deze procedure, werden de plasmiden die de vereiste coderende DNA-sequenties of CDS bevatten, geamplificeerd in e coli en geïsoleerd zoals beschreven in de protocoltekst. In dit voorbeeld is de CDS van belang verbeterd groen fluorescent eiwit of EGFP om tegelijkertijd het CDS van EGFP te versterken en een polydetail toe te voegen.Bereid een PCR-mengsel voor zoals beschreven in de protocoltekst. Plaats de PCR-buis in een thermocycler en voer het PCR-cyclusprotocol uit dat in de protocoltekst wordt beschreven. Wanneer de PCR-reactie voltooid is, reinig de PCR-reactie met behulp van een commercieel verkrijgbaar PCR-zuiveringskit en verdun het DNA met 20 microliter nucleasevrij water.Om de kwaliteit van het PCR-product te controleren, voer DNA-gelelektroforese uit en visualiseer de DNA-banden op een beeldvormingssysteem. Een duidelijke DNA-band met een lengte van ongeveer 1.100 basenparen moet worden gedetecteerd tijdens in vitro transcriptie of IVT. Het eerder gegenereerde DNA zal worden getranscribeerd naar mRNA.Bereid het NTP-cap-analoogmengsel voor zoals hier getoond. Meng het NTP-cap-analoogmengsel grondig door te vortexen. Spuit het vervolgens neer. Monteer kort het IVT-reactiemengsel zoals beschreven in deze tabel.Meng het IVT-reactiemengsel grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren. Centrifugeer vervolgens de PCR-buis kort om het mengsel op de bodem van de buis te verzamelen. Incubeer het IVT-reactiemengsel gedurende drie uur op 37 graden Celsius in een thermomixer.Na drie uur verwijdert u het sjabloon-DNA door één microliter DNAs toe te voegen aan het IVT-reactiemengsel. Meng het goed en incubeer het gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius. Zuiver het reactiemengsel met behulp van een RNA-zuiveringskit en verdun het gemodificeerde MR NA van de spinkolommembranen tweemaal met 40 microliter nucleasevrij water, het gemodificeerde mRNA dat door IVT is gegenereerd, moet worden behandeld met fosfatase om vijf prime-trifosfaten te verwijderen, wat kan leiden tot immuunactivering.Voeg om deze procedure te beginnen negen microliter 10 x Antarctische fosfatasereactiebuffer toe aan 79 microliter gezuiverde mRNA-oplossing. Voeg vervolgens twee microliter Antarctische fosfatase toe en meng het monster voorzichtig. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius.Na 30 minuten zuivert u het reactiemengsel met behulp van een RNA-zuiveringskit en verdunt u het gemodificeerde mRNA van de spinkolommembranen tweemaal met 50 microliter nucleasevrij water. Na het meten van de concentratie van het gemodificeerde mRNA, pas de concentratie aan tot 100 nanogram per microliter door nucleasevrij water toe te voegen. Controleer de kwaliteit van het gesynthetiseerde gemodificeerde mRNA door RNA-gelelektroforese en visualiseer de ladder en mRNA-banden op een UV-trans illuminator.Er moet een duidelijke mRNA-band worden gedetecteerd met een lengte van ongeveer 1.100 basenparen. Bereid de HEC 2 9 3-cellen voor op transfectie met het gesynthetiseerde gemodificeerde mRNA door twee keer te plateren. Centreer vijf cellen per put van een 12-wellplaat en incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius in een cellenincubator. De volgende dag zouden de cellen 80 tot 90% confluentie moeten hebben bereikt.Genereer de lipoplex voor transfectie. Bereid voldoende transfectiemengsel voor alle putten die worden getransfecteerd. Elke put van een 12-wellplaat vereist 2,5 microgram gemodificeerd mRNA, twee microliter lipidetransfectiereagens en 473 microliter opt een. Verminder serummedium.Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren als negatieve controle. Bereid een transfectiemengsel zonder Mr.NA, incubeer de transfectiemengsels bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om lipoplexes te genereren. Voor transfectie.Was de cellen met 500 microliter DPBS per. Voeg 500 microliter transfectiemengsel toe aan elke put van de 12-wellplaat. Incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na vier uur, aspireer het transfectiemengsel en voeg één milliliter compleet celkwekmedium toe aan de cellen in elke put.Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de cellenincubator. Vervolgens wordt fluorescentiemicroscopische analyse van de cellen uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop om cellen voor flowcytometrie voor te bereiden. Verwijder het celkwekmedium van de putten en was elke put met één DPBS zonder calcium en magnesium.Voeg 500 microliter TRIPSIN EDTA per put toe om de cellen los te maken van het oppervlak van de celkwekplaten. Voeg vervolgens 500 microliter trypsine-neutralisatie

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.

Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Er zijn gedetailleerde protocollen voor beide in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) experimenten om de secundaire structuur van pre-mRNA opeenvolgingen van belang in de aanwezigheid van een kleine molecule van RNA-targeting in dit artikel wordt gepresenteerd.

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) wordt ontwikkeld met behulp van een microfluïdisch mengapparaat om in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA in te kapselen en af te leveren. Het beschreven mRNA/PP-sNp kon in vitro efficiënt gekweekte cellen transfecteren.

Efficiënte transfectie van in vitro getranscribeerd mRNA in gekweekte cellen met behulp van peptide-poloxamine nanodeeltjes

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Leer de in vitro synthese van gemodificeerde mRNA voor eiwitexpressie in menselijke cellen. Deze methode omvat PCR-amplificatie, transcriptie en transfectie zonder genoomintegratie.

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

Meer video's verkennen