In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

Het algemene doel van deze procedure is de in vitro synthese van gemodificeerd mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen. Dit wordt bereikt door eerst het plasmide-insert of de coderende DNA-sequentie te versterken en een poly T-staart van 120 thymidine toe te voegen met behulp van polymerasekettingreactie. De tweede stap is de in vitro transcriptie van het gegenereerde DNA naar mRNA met poly adenine-staarten.

Vervolgens wordt het sjabloon-DNA verwijderd door D'S-behandeling van het in vitro transcriptiereactiemengsel. De laatste stap is de Antarctische fosfatasebehandeling van het geproduceerde mRNA om vijf prime-fosfaten te verwijderen. Uiteindelijk worden cellen getransfecteerd door de gegenereerde mRNA, lipidecomplexen.

Fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie-analyse worden gebruikt om de synthese van verbeterd GFP in cellen te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals virale transfectie, is het ontbreken van integratie in het genoom van de gastheercel, wat het risico op oncogenese voorkomt. Deze methode kan helpen om ontbrekende of defecte eiwitten in cellen te produceren en kan worden gebruikt voor vaccinatiebehandeling van genetische aandoeningen.

En op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zal de procedure worden aangetoond door Steinle, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Voorafgaand aan het begin van deze procedure, werden de plasmiden die de vereiste coderende DNA-sequenties of CDS bevatten, geamplificeerd in e coli en geïsoleerd zoals beschreven in de protocoltekst. In dit voorbeeld is de CDS van belang verbeterd groen fluorescent eiwit of EGFP om tegelijkertijd het CDS van EGFP te versterken en een polydetail toe te voegen.

Bereid een PCR-mengsel voor zoals beschreven in de protocoltekst. Plaats de PCR-buis in een thermocycler en voer het PCR-cyclusprotocol uit dat in de protocoltekst wordt beschreven. Wanneer de PCR-reactie voltooid is, reinig de PCR-reactie met behulp van een commercieel verkrijgbaar PCR-zuiveringskit en verdun het DNA met 20 microliter nucleasevrij water.

Om de kwaliteit van het PCR-product te controleren, voer DNA-gelelektroforese uit en visualiseer de DNA-banden op een beeldvormingssysteem. Een duidelijke DNA-band met een lengte van ongeveer 1.100 basenparen moet worden gedetecteerd tijdens in vitro transcriptie of IVT. Het eerder gegenereerde DNA zal worden getranscribeerd naar mRNA.

Bereid het NTP-cap-analoogmengsel voor zoals hier getoond. Meng het NTP-cap-analoogmengsel grondig door te vortexen. Spuit het vervolgens neer. Monteer kort het IVT-reactiemengsel zoals beschreven in deze tabel.

Meng het IVT-reactiemengsel grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren. Centrifugeer vervolgens de PCR-buis kort om het mengsel op de bodem van de buis te verzamelen. Incubeer het IVT-reactiemengsel gedurende drie uur op 37 graden Celsius in een thermomixer.

Na drie uur verwijdert u het sjabloon-DNA door één microliter DNAs toe te voegen aan het IVT-reactiemengsel. Meng het goed en incubeer het gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius. Zuiver het reactiemengsel met behulp van een RNA-zuiveringskit en verdun het gemodificeerde MR NA van de spinkolommembranen tweemaal met 40 microliter nucleasevrij water, het gemodificeerde mRNA dat door IVT is gegenereerd, moet worden behandeld met fosfatase om vijf prime-trifosfaten te verwijderen, wat kan leiden tot immuunactivering.

Voeg om deze procedure te beginnen negen microliter 10 x Antarctische fosfatasereactiebuffer toe aan 79 microliter gezuiverde mRNA-oplossing. Voeg vervolgens twee microliter Antarctische fosfatase toe en meng het monster voorzichtig. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius.

Na 30 minuten zuivert u het reactiemengsel met behulp van een RNA-zuiveringskit en verdunt u het gemodificeerde mRNA van de spinkolommembranen tweemaal met 50 microliter nucleasevrij water. Na het meten van de concentratie van het gemodificeerde mRNA, pas de concentratie aan tot 100 nanogram per microliter door nucleasevrij water toe te voegen. Controleer de kwaliteit van het gesynthetiseerde gemodificeerde mRNA door RNA-gelelektroforese en visualiseer de ladder en mRNA-banden op een UV-trans illuminator.

Er moet een duidelijke mRNA-band worden gedetecteerd met een lengte van ongeveer 1.100 basenparen. Bereid de HEC 2 9 3-cellen voor op transfectie met het gesynthetiseerde gemodificeerde mRNA door twee keer te plateren. Centreer vijf cellen per put van een 12-wellplaat en incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius in een cellenincubator. De volgende dag zouden de cellen 80 tot 90% confluentie moeten hebben bereikt.

Genereer de lipoplex voor transfectie. Bereid voldoende transfectiemengsel voor alle putten die worden getransfecteerd. Elke put van een 12-wellplaat vereist 2,5 microgram gemodificeerd mRNA, twee microliter lipidetransfectiereagens en 473 microliter opt een. Verminder serummedium.

Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren als negatieve controle. Bereid een transfectiemengsel zonder Mr.NA, incubeer de transfectiemengsels bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om lipoplexes te genereren. Voor transfectie.

Was de cellen met 500 microliter DPBS per. Voeg 500 microliter transfectiemengsel toe aan elke put van de 12-wellplaat. Incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na vier uur, aspireer het transfectiemengsel en voeg één milliliter compleet celkwekmedium toe aan de cellen in elke put.

Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de cellenincubator. Vervolgens wordt fluorescentiemicroscopische analyse van de cellen uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop om cellen voor flowcytometrie voor te bereiden. Verwijder het celkwekmedium van de putten en was elke put met één DPBS zonder calcium en magnesium.

Voeg 500 microliter TRIPSIN EDTA per put toe om de cellen los te maken van het oppervlak van de celkwekplaten. Voeg vervolgens 500 microliter trypsine-neutralisatie