Name: Confocale Time Lapse Imaging als een efficiënte methode voor het Cytocompatibility Evaluatie van Dental Composites (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer 3D confocale laser scanning microscopie met time-lapse imaging voor het evalueren van de biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten. Deze methode maakt real-time monitoring van menselijke gingivale fibroblasten mogelijk zonder celstructuur te verstoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Saremco Dental Switzerland en Olympus Microsystems Frankrijk worden dankbaar erkend voor hun financiële steun. Saremco Dental wordt ook erkend voor de genereuze donatie van de tandheelkundige composieten ELS extra lage krimp. De auteurs willen ook hun waardering uitspreken aan Dr. Simon Banks van de afdeling Chemie (University College London) voor zijn hulp bij de Engelse revisie.

Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen: de eerste stap omvat de bereiding van samengestelde extract in kweekmedium; de tweede heeft betrekking op de primaire humane Gingival fibroblasten (HGF) celkweek, het contact van de cellen met de samengestelde extracten en celkleuring; de derde stap uit confocale beeldvorming en het fluorescentiesignaal analyse. Voor tandvleesweefsels nemen, het protocol werd goedgekeurd in overeenstemming met de Franse wetgeving, informed consent en de lokale ethische commissie. 1. Composite Extracten Voorbereiding Gebruik Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) als elutiemedium. Zorg dat de verhouding tussen het oppervlak van de monsters en de hoeveelheid extractiemedium is op het laagste niveau van de ISO 10993/12 eisen. De procedure is onlangs beschreven 11 en schetste in het kort hieronder: <ol><li> Vormen sferische samples van de uitgeharde Composiet met behulp van een op maat gemaakte pakkenER. De houder is 2 mm in straal, die overeenkomstig algemeen geadviseerd uithardingsdiepte in de orale klinische behandeling. </li><li> Bereid putjes, die elk 1 ml kweekmedium (DMEM), met een 5% mengsel van penicilline / streptomycine en 1% amfotericine zonder foetaal runderserum (FBS). </li><li> Cure monsters binnen het putje met DMEM medium met behulp van een LED-lamp met een 1.070 mW cm -2 intensiteit (λ = 465-475 nm) gedurende 40 sec. Controleer of de afstand tussen het uitharden tip en de monsters in het gebied van 0,5 mm. Gebruik deze uitharden-modus om de tijdelijke contact tussen tand en de uitgeharde Composiet simuleren. In klinische situatie het contact plaatsvindt wanneer de herstelmaatregelen composiet wordt in de mondholte. </li><li> Incubeer monsters (composieten specimens in DMEM medium) bij 37 ° C onder een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Incubeer DMEM medium (zonder samengestelde monsters) voor controle cellen onder dezelfde omstandigheden. </li></ol> 2. HGF Cell Culture, Composite Extracten Testing and Cells Kleuring <ol><li> Groei en behoud van celculturen Isoleer de menselijke gingivale fibroblasten van gezond tandvlees biopten van patiënten die tijdens routine orthodontische extracties. <ol><li> Cultiveren humane gingivale fibroblasten in DMEM in de aanwezigheid van 10% FBS, 5% penicilline / streptomycine en 1% amfotericine B. aanvullen cellen bij 37 ° C in een incubator onder bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht. </li><li> Gewijzigde medium om de 3 dagen, en passage cellen om de 5 dagen. Na het bereiken van confluentie, oogst cellen door behandeling met trypsine. </li><li> Centrifugeer cellen bij 90 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer ze in het kweekmedium. Count cel met een scepter handheld geautomatiseerde celgetalmeter. </li><li> Zaad celsuspensie bij een celdichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / ml in een kamer geleidingssysteem. Laat de incubatie van de cellen overnacht bij 37 ° C in een atmosfeer van 5%. </li></ol></li><li> Toevoeging van samengestelde extracten aan de cellen in kweek <ol><li> Vervang de media van twee putjes van de kamer schuif door 1 ml van de geteste samengestelde extracten (na 24 uur incubatie). </li><li> Handhaaf de twee overgebleven wells (controlecellen) onder dezelfde omstandigheden. </li><li> Incubeer de kamer dia met vier putjes bij 37 ° C in incubator onder een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht. </li></ol></li><li> Fluorescentiekleuring Gebruik de Live / Dead cytotoxiciteit kleuring voor eukaryote cellen volgens instructies van de fabrikant. OPMERKING: de kit biedt een snelle twee-kleuren fluorescentie om de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen in een populatie op basis van plasma membraan integriteit en esterase activiteit. De vlek onderscheiden levende van beschadigde cellen door gelijktijdig labelen met groen-fluorescent calceïne-AM intracellulaire esterase activiteit en rood-fluorescerende ethidiumhomodimeer-1 (EthD-1) aangeven verlies van membran aangevene integriteit. <ol><li> Bereid een werkoplossing van beide vlek reagentia die 2 uM calceïne AM en 4 uM EthD-1 (eindconcentratie gerapporteerd geschikt voor fibroblast kleuring is). Voeg de vlek aan de gekweekte hechtende cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van de geselecteerde samengestelde extracten. </li><li> Houd u direct en snel de gebrandschilderde celpopulaties ten minste 15 minuten na kleuring en door middel van de time-lapse imaging. Niet centrifuge en niet fixe de gekleurde cellen. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time Lapse Imaging and Signal Analysis Het gebruikte systeem is uitgerust met vier diodelaser eenheden en beeld een multi-gekleurd tot vier fluorescente kleurstoffen voor elk specimen. Het systeem kan een mapping afbeelding (10x vergroting) die een overzicht geeft van het monster waarop men kan verhuizen naar een regio van belang (600X vergroting) observeren geeft presteren. <ol><li> Time lapse imaging <ol><li> Plaats de specimens (de kamer dia met de gekleurde monsters) op de donkere kamer van de confocale geïntegreerde incubator (37 ° C, 5% CO2 en vochtige atmosfeer). </li><li> Het geëigende lasers. Gebruik de twee laser bronnen 473 nm (15 mW) en 559 nm (18 mW) te prikkelen Calceïne en EthD-1. </li><li> Gebruik een twee sequentiële modus om afbeeldingen via lijn sequenties verwerven zonder overspraak in beeldvorming met de twee gebruikte fluorescentie kleurstoffen. </li><li> Gebruik een detector met een nieuw ontwikkelde spectrum automatisch voorwaarden overeenkomstig de fluorescentie kleurstof in aftasteenheid. </li><li> Optimaliseer de bandbreedtes van de gedetecteerde fluorescentie voor elk kanaal tot het maximum. Record alle acquisities sequentieel aan potentiële cross-talking vermijden. </li><li> Selecteer de meest geschikte beeldvormende voorwaarden op basis van de fluorescerende kleurstof selectie met behulp van de acquisitie software. </li><li> Acquire beeld Kaart van een die automatisch wordt gemaakt van het centrum in een spiraalvormig patroon,met het gebied van belang omdat ze gemakkelijk worden geselecteerd voor nader onderzoek. </li><li> Selecteer observatie modus. Selecteer maximaal vijf soorten observatie modi waaronder time-lapse, Z-stack, en multi-gebied als dat nodig is. Gebruik een combinatie van Z-stack en time-lapse-modi in het huidige onderzoek en vul snel het vastleggen van het beeld, </li><li> Veranderen en schakel de fluorescente kleurstof. Als alternatief overlay de tl en het licht contrast beelden met elkaar. Observeer live-beeld met behulp van het geselecteerde punt op de linker onderste kaart scherm. </li><li> Bepaal de beeldvorming gebied met behulp van de framing en zoomen functies. Eventueel schakelen tussen de schermen voor elk type fluorescentie kleurstof. OPMERKING: De microscoop gebruikt in dit protocol heeft dezelfde functionaliteit als een high conventionele confocale in een compact ontwerp. De microscoop is uitgerust met omgekeerde water-immersie doelstellingen die optimaal geschikt zijn voor stabiele time-lapse imaging van levende cellen met een vereenvoudigde ingebouwde incubator. </li&gt; </ol></li><li> Signaal analyse en kwantificering <ol><li> Gebruik de imaging software om de fluorescentie-signaal te kwantificeren. Verkrijgen van vijf kaartbeelden met de 10X objectief voor zowel geteste monster en mobiele controle. </li><li> Verkregen 1.024 × 1.024 pixels regelmatig beelden, met een 0,231 um x 0,231 micrometer pixelgrootte. Afbeeldingen opslaan als Olympus Image Format (OIF) voor signaalanalyse. Dit formaat kunt opslaan van verschillende parameterinstellingen en beelden samen. Gebruik verschillende analyse-instrumenten (meten van intensiteit profiel intensiteitsverhouding tussen de twee gebruikte kanalen). </li><li> Bewaar de maximale projectie beelden als 12 bits / pixel TIFF-bestanden. </li><li> Voorvormen statistische analyses met behulp van de R commandant software. Analyseer de verschillen met behulp van one-way variantie-analyse (ANOVA) met een herhaling test. Verslag resultaten als gemiddelde standaarddeviatie (± SD) en statistische significantie bij p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben, ze hebben niets te onthullen.

Biocompatibiliteit materiaal gedrag is de meest vereiste parameter die moet worden geëvalueerd voordat medisch gebruik. Internationale standaarden omvatten medische hulpmiddelen ISO 10993 33 en specifiek tandheelkundige materialen ISO 7405 34. De afwezigheid van de toxische effecten op de omringende cellen is de sleutel norm in de biocompatibiliteit evaluatie van dergelijke materialen. Daarom cytotoxiciteit testen heeft zo&#39;n belang bij de beoordeling van tandheelkundige materialen biocompatibility 35-37. De ISO suggereerde testmethoden kan worden gebaseerd op de metabole activiteit of membraan integriteit. Geselecteerde eindpunten moeten voorwaarden voor het rangschikken bijwerkingen bij testmateriaal om de tijd en de kosten van de beoordeling assays minimaliseren volgen. De huidige methode van onderzoek (3D confocale time lapse imaging) is membraanintegriteit gebaseerd. De cytotoxiciteit evaluatie via dit eindpunt lijkt een waardevolle marker van cel biocompa zijnbaarheid met geteste materialen en het is ook ISO goedgekeurd eindpunt. In vitro testen zijn ontwikkeld om te bepalen hoe een materiaal monster van invloed op een bepaald celtype. De colorimetrische MTT assay werd oorspronkelijk beschreven door Mossman (1983) als een bruikbare methode voor de meting van in vitro cytotoxiciteit en celproliferatie. De MTT test is gebaseerd op de omzetting van het tetrazoliumzout tot formazan kristallen op actieve cellen, die mitochondriale activiteit bepaalt. Dit kan worden vertaald door levensvatbaarheid tarief 38. Gupta en medewerkers meldde dat de MTT test is de meest gebruikte methode voor het meten van cytotoxiciteit van composieten. Barnsteenzuur dehydrogenase en alkalische fosfatase reacties zijn ook gebruikt voor hetzelfde doel 39. Echter, het lot cellen niet worden opgevolgd, aangezien de MTT assay vereist doden van de cellen bij elke meting tijdstip. Om beter te kunnen volgen van het gedrag van de gekleurde cellen in de huidige studie, direct observatie van levende cellen werd uitgevoerd, dankzij de time lapse CLSM imaging gecombineerd met een kort protocol vlekken, geautomatiseerde beeldanalyse en fluorescent signaal kwantificering. Tandheelkundige composieten komen in nauw contact met orale weefsels, vooral tandvlees en pulpale cellen. 41 - fibroblasten zou het doelwit van componenten vrijgegeven van deze herstellende composieten 40 zijn. Bovendien hebben onderzoeken zien dat geïmmortaliseerde cellen en primaire cellen verschillende cellulaire responsen in contact met biomaterialen kunnen hebben. Primaire cellen bleken beter om biomaterialen effecten 42 te beoordelen. Dit verklaart het gebruik van primaire humane gingivale fibroblasten als celmodel voor cytotoxiciteit beoordeling van de geteste Composiet in de huidige studie. De toxiciteit potentieel van de vrijgekomen stoffen uit Composiet is vaak bestudeerd 43-44. Om t beoordelenhij cytotoxische potentieel van materialen, konden twee contactpunten model cellen worden uitgevoerd. In het directe contact modelsysteem het materiaal direct geplaatst doelcellen terwijl het indirect contactsysteem doelcellen in contact met elueert uit biologische media. In klinische toepassingen en voor restauratieve procedures, worden Composiet geplaatst in indirect contact met de gingiva. Daarom werd de experimentele protocol gericht op het indirect contactsysteem met humane gingivale fibroblasten (cellen in aanwezigheid van de geteste samengestelde extracten). Zoals eerder gemeld door Dahl en medewerkers, werd cytotoxiciteit reacties gerangschikt als ernstig (&lt;30%), matig (30-60%), lichte (60-90%) of niet-cytotoxisch (&gt; 90%) op basis van de activiteit ten opzichte waarden voor de besturing 45. Daarom is het volgens deze rangschikking en in het licht van de bereikte resultaten (tabel 1), composiet ELS extra lage krimp zou kunnen worden gerangschikt als very lichtjes cytotoxische en toonde vergelijkbaar gedrag om cellen te controleren gedurende de gehele time lapse periode. Gebruiken precies dezelfde onderzoeksmethode, kunnen de resultaten van dit onderzoek worden vergeleken met die van een recent gepubliceerde studie. De ELS extra lage krimp composiet een superieure biocompatibiliteit vergelijking met de twee eerder geteste composieten gebruikt voor dezelfde klinische toepassing die direct herstel 11. Verdere studies zijn nog nodig om meer volledige vergelijking te vestigen. Bij de beslissing welke cytotoxiciteit assay te keuren voor een specifiek eindpunt beoordeling is het noodzakelijk dat de voordelen en de beperkingen van elk assay begrijpen. Het hoofddoel van confocale beeldvorming is een 3-D structuur van cellen en organen bereiken. De techniek kan niet alleen het oppervlak van een monster, maar ook de ondergrond te onthullen. Het hier beschreven protocol onderstreept het gebruik van 3D CLSM time lapse confocale beeldvorming, als een sensitieve methode voor de in vitro biocompatibiliteit gedrag van een Composiet beoordelen. Echter, teneinde de beperkingen die eigen is aan te vermijden, anti-vibratie werkstations kan worden gebruikt om stabielere en langere tijd lapse imaging toestaan; het blad kan het gebruikt confocale systeem isoleren van de nadelige effecten die trillingen in het laboratorium kan veroorzaken. Voorts materialen voor gebruik in de mondholte idealiter onschadelijk voor het gingivale weefsel en dient geen stoffen die systemische toxiciteit kunnen veroorzaken. Overeenkomstig de gebruikte methodologie en de resultaten van de huidige studie resultaten kan worden geconcludeerd dat de geteste samenstelling (ELS extra lage krimp) niet cytotoxisch in de onderhavige experimentele omstandigheden. Zoals de CLSM methode gevoelig kan geven de initiële snelheid van levensvatbare cellen, zouden andere mogelijkheden te voorzien om meer eindpunten evalueren. In het bijzonder als het is onlangs gemeld dat composiet monomeren beïnvloeden cellen thrdoorgedreven reactive oxygen species (ROS) 46- 48, is verder onderzoek nodig is om correlaties te beoordelen of eventuele tussen cytotoxiciteit signalering netwerken en ROS productie. De toekomstige protocol kan worden ontworpen om gelijktijdig te evalueren ROS productie (H 2 O 2 en / of O 2 - vlekken) en cytotoxiciteit verhouding (Live / dode vlekken) met behulp van time-lapse CLSM imaging.

Een van de belangrijkste eisen welke in de ISO aanbevelingen biocompatibiliteit definiëren is de afwezigheid van materiaal toxiciteit voor cellen. Hars dentale samenstellingen kunnen componenten van het harsachtige matrix, die aanvankelijk door gedeeltelijke polymerisatie kan zijn, en / of later door afbraakprocessen tijd 1-4 vrijgeven. Deze vrijgekomen componenten in contact met orale weefsels en kunnen verschillende nadelen zoals urticaria en slijmvliesreacties 5, ontwikkeling van allergie en overgevoeligheidsreacties bij patiënten 6, modificaties van gingivale fibroblasten morfologie en vermindering van type I collageen proteïne 7, immunosuppressie of immuunstimulatie op mitogeen hebben -driven proliferatie van gezuiverde T-lymfocyten en de milt cellen 8 en DNA-schade in primaire menselijke gingivale fibroblasten, die onderstreept van de genotoxische potentie 9. Veel parameters kunnen tandheelkundige toxiciteit composiet beïnvloeden, zoals de schaduw van de compositieplaten, de met licht uithardende, de chemische samenstelling van de hars monomeer, de vulstof en de omzettingsgraad 10- 13. Aangezien in vitro toxische potentieel van materialen kunnen voorspellen in vivo omstandigheden en kan worden vergeleken met klinische situaties door de analyse van enkele relevante eindpunten. De cytotoxiciteit van tandheelkundige composieten en hun componenten zijn op grote schaal geëvalueerd met behulp van celkweek systemen 14- 16. Deze in vitro systemen ontwikkeld om tandheelkundige composieten biocompatibiliteit beoordelen termijn: celgroei en apoptose met THP-1monocytes achtige cellen 17, cytotoxiciteit in humane gingivale fibroblasten 18, inflammatoire potentieel HaCaT keratinocyten achtige cellen 2, celfunctionaliteit odontoblast- zoals MDPC-23 cellen 19, vermindering van de totale RNA-spiegels, en een significante toename van de inductie van apoptose op de menselijke tandvlees keratinocyten 20 enDNA schade aan het tandvlees en pulp fibroblastcellen 21. Verschillende methoden worden voorgesteld om de biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten onderzoeken. Colorimetrische assays, welke specifieke kleurstoffen en lichte adsorptiemetingen omvatten, blijven de meest gebruikte, vanwege hun relatieve eenvoud en lage kosten 22- 26. Microscopie analyse door licht contrast verbruikt vaak meer tijd en maakt hogere kosten. Echter, deze microscopische technieken hebben een aantal belangrijke voordelen. De waarneming van de celstructuur geeft uitgebreide informatie over ervaren toxische effecten, waardoor er meer relevante en gevoelige gegevens. In het bijzonder, heeft de introductie van confocale microscopie 27 toegelaten voor waarneming van biologische structuren verbeteren axiale resolutie dan traditionele wide-field imaging fluorescentie microscopen. Daarom heeft confocale beeldvorming uitgegroeid tot een krachtig onderzoeksinstrument in verschillende gebieden van demedische en wetenschappelijke onderzoeken. In tegenstelling tot elektronische microscopie, confocale microscopie biedt de mogelijkheid om afzonderlijke componenten van cellen te visualiseren door incorporatie van specifieke fluorescente merkers. De meeste van deze specifieke tracers stabiel in een waterige omgeving, verstandig meetbaar, goedkoop en niet-toxisch 28, waardoor het gebruik ervan in klinische en laboratoriumonderzoek studies. Bovendien, het monster drogen en bevestiging vereist conventionele elektronische microscopie analyse niet noodzakelijk time lapse confocale beeldvorming, waardoor tijdsafhankelijke acquisitie ook op monsters. Vergeleken met de tweedimensionale beeldvorming, het confocale beeldvorming principe kan een specimen ondergrond visualisatie en de driedimensionale structuur reconstructie uit de verschillende verkregen dieptebeelden; die resulteren in, preciezer en structurele details 29, 30. Deze video studie is een voorbeeld van het gebruik van drie-dimensionale tijdsverloopopname Confocal laser scanning microscopie (3D-CLSM) in combinatie met Live / Dead fluorescerend etikettering en signaal kwantificering als een innovatieve methode. De in dit document techniek heeft het voordeel dat gevoelige evaluatie en time-lapse beeldvorming van levende cellen zonder de beoordeelde celstructuur. Geen voorbereiding stappen nodig voordat confocale analyse. Voorheen werd dezelfde kleuring gebruikt voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van gekweekte poreus bot cores 31 maar zonder confocale time-lapse volgende. Zo ook hetzelfde time-lapse confocale procedure werd gebruikt om erythromycine time-kill activiteit beoordelen in bacteriën van actief slib volgens hun Gram soort 32 met behulp van een specifieke bacteriën leven / dood kleuring. Deze methoden zijn onlangs aangepast en gebruikt om de toxiciteit van tandheelkundige composieten methacrylaat monomeren 11 vergelijken.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>O2/CO2 Incubator</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Cel incubatie</td></tr><tr><td>Live/Dead Kit</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Kleuren&nbsp;</td></tr><tr><td>ELS extra low shrinkage &nbsp;</td><td>Saremco&nbsp;</td><td></td><td>Tandheelkundig composiet</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Oogsten van cellen</td></tr><tr><td>chamber slide system&nbsp;&nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Kweekkamer</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Celtelling&nbsp;</td></tr></tbody></table>

confocale time lapse imaging als een efficiënte methode voor het cytocompatibility evaluatie van dental composites

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Het wordt algemeen aanvaard dat in vitro celmateriaal interactie een bruikbaar criterium bij de beoordeling van tandmateriaal biocompatibiliteit. Het doel van deze studie was om 3D CLSM time lapse confocale beeldvorming om de in vitro biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten beoordelen. Deze methode verschaft een nauwkeurige en gevoelige indicatie van levensvatbare cel rate in contact met Composiet extracten. De ELS extra lage krimp, een Composiet gebruikt voor direct herstel, is genomen als voorbeeld. In vitro evaluatie werd uitgevoerd op gekweekte primaire menselijke gingival fibroblast cellen met Live / Dead kleuring. Beelden werden verkregen met de FV10i confocale biologische omgekeerde systeem en geanalyseerd met de FV10-ASW 3.1 Software. Beeldanalyse toonde een zeer geringe cytotoxiciteit in aanwezigheid van de geteste composiet na 5 uur tijdsverloop. Een lichte vermindering van cellevensvatbaarheid werd voorgesteld in contact met de geteste samengestelde extracten compared met controle cellen. De bevindingen benadrukt het gebruik van 3D CLSM time lapse imaging als een gevoelige methode om de biocompatibiliteit gedrag van tandheelkundige composieten kwalitatief en kwantitatief evalueren.

Figuur 1 toont een overzicht van de Live / Dead gekleurde cellen verkregen in kaartbeelden (10X objectief) voor zowel controle en cellen blootgesteld aan de geteste samengestelde extracten (ELS extra lage krimp). De driedimensionale structuur van de cellen kunnen worden gevisualiseerd aan de vergroting 600X. Visualisatie van cellen in de regelkamer en de cellen in de kamer in aanwezigheid van de geteste samengestelde extracten werden ingezameld is weergegeven in figuur 2. De maximale projectie (60X objectief) toont het lot van geselecteerde celpopulaties bij de start van het tijdsverloop (15 min) en aan het einde van het tijdsverloop (ten 5 uur). Zevenenvijftig stapels afbeeldingen (xyzt mod scan, 39 beelden per stapels voxel diepte 1,00 um) werden verkregen tijdens deze periode. Een lichte vermindering in de groene fluorescentiesignaal en zeer kleine variatie in de rode fluorescente werden verkregen blootgestelde cellen. Geen significante verschillen waargenomen voor controlecellen. Samengestelde extracten blootgestelde cellen aangenomen vergelijkbaar spil morfologie met controle cellen; morfologie niet in deze experimentele omstandigheden gewijzigd (ondanks het groene signaal daling en de rode signaal toename in aanwezigheid van de geteste composiet). Beeldanalyse werd uitgevoerd op vijf verschillende geselecteerde beeld stacks voor de verschillende celpopulaties uit de verkregen beelden van de geteste samenstelling in vergelijking met de negatieve controle cellen voor zowel groen en rood signaal. Het intensiteitprofiel van gekleurde cellen wordt geïllustreerd in figuur 3; de groene en rode signaal evolutie van de cellen in contact met de geteste samenstelling vergelijkbaar met die van controlecellen. Calceïne en EthD-1-emissie-intensiteiten werden gemeten met controlecellen en samengestelde blootgestelde cellen. De meting werd uitgevoerd bij intervallen van een uur tot vijf uur. De groen / rood fluorescentieverhouding (gebaseerd op geïntegreerde intensiteiten van de groene 495-515 nm en rode 620-650 nm signalen) Werd berekend tijdens de time-lapse-periode. De levensvatbaarheid verhoudingen voor controle- en cellen blootgesteld aan ELS extra lage krimp extracten worden getoond in de T abel 1. In aanwezigheid van de geteste samenstelling, het percentage levende cellen bleek weinig afnemen van 100% tot 93,9% na 1 uur contact. Significant verschil waargenomen tussen de geteste composiet en de negatieve controle (cellen zonder enige composiet extracten) na 5 uur van de aangegeven time-lapse periode. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> Figuur 1: Overzicht image mapping getoonde gekleurde cellen op objectieve 10X, (A) controle cellen en (B) cellen in aanwezigheid van composiet extracten (ELS extra lage krimp) in het begin van de time lapse periode (t = 15 min). Groene gebieden zijn levende cellen en rode gebieden zijn beschadigde cellen. In dezeexperimentele omstandigheden, geen variatie (zowel groene en rode fluorescentie) werd waargenomen voor composieten blootgestelde cellen in vergelijking met de negatieve controle cellen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> Figuur 2: CLSM beelden op objectieve 60X van een cel populatie van (A) regelkamer en (B) samengestelde extracten kamer in het begin en het einde van de blootstelling time-lapse periode (I: 15 min en II: 5 uur, respectievelijk ). Groene gebieden zijn levende cellen en rode gebieden zijn beschadigde cellen. Het paneel van de beelden getoond kleine verandering in de intensiteit signaal (lichte daling van het groene signaal en lichte stijging in het rode). Nr celmorfologie veranderingen werden waargenomen in de aanwezigheid van samengestelde extracten; cellen handhaafden hun spoelvormige en fibroblastische morfologie controlecellen bloot. Figuur 3: Lijnprofiel cellen waargenomen in time-lapse microscopie (A) Controle cellen (B) samengestelde extracten blootgestelde cellen, (I) 15 min en (II) 5 uur.. Geen zichtbare verandering in het groene signaal ontwikkeling in aanwezigheid van geteste samenstelling ongeacht de tijd contact. Echter, de lichte toename van rode signaal werd waargenomen in de aanwezigheid van composiet na 5 uur van contact. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Contact tijd (uur) </td><td colspan="5"> Levensvatbaarheid van de cellen (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Controlecellen </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS extra lage krimp ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabel 1:. Snelheid van levende cellen HGF evolutie na 1, 2, 3, 4 en 5 uur van contact met samengestelde extracten Cel levensvatbaarheid werd bepaald door kleuring met de Live / Dead cytotoxiciteit kit. Gegevens tonen gemiddelde waarden ± SD van vijf beelden stacks analyse. Waarden significant verschillend van de controle cellen bij p &lt;0,05.

De meest bestudeerde aspect van de biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten is hun cytotoxiciteit 3D CLSM time lapse imaging gecombineerd met fluorescerende signaal kwantificering maakt gevoelige evaluatie van het lot van de cel in de tijd. Gebruik makend van deze methode kan een efficiënt instrument om de cytocompatibility van tandheelkundige composieten beoordelen.

Confocale Time Lapse Imaging als een efficiënte methode voor het Cytocompatibility Evaluatie van Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om 3D confocale laserscanningmicroscopie te gebruiken voor time-lapse beeldvorming om de in vitro biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst sferische monsters van ongeharde tandheelkundige composiet te nemen in de tweede stap. Menselijke gingivale fibroblasten worden gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van deze composietextracten, en vervolgens worden de cellen gelabeld met live dead staining.Vervolgens worden kaartbeelden van de celculturen gegenereerd en overlaybeelden gemaakt voor de gebieden van belang. Uiteindelijk kunnen de real-time verschillen in celgedrag die optreden in aanwezigheid of afwezigheid van de geteste composieten worden gemonitord volgens de veranderingen in de groene of rode fluorescente signalen die in de afbeeldingen worden waargenomen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn dat het realtime monitoring van levende cellen mogelijk maakt zonder veranderingen in de celstructuur te veroorzaken.Er zijn geen fixatie- of droogstappen vereist na celkleuring of vóór time lapse observatie. Om de composietextract voor te bereiden, begint u met het gebruik van een op maat gemaakte houder met een straal van twee millimeter om sferische monsters van het ongeharde tandheelkundige composiet te vormen. Breng de monsters over naar individuele putjes van een zesputjesplaat die een milliliter kweekmedium bevat, zorg ervoor dat u enkele putjes met alleen media achterlaat voor controlecelculturen, en plaats vervolgens een LED-lamp met een intensiteit van 1070 milliwatt per vierkante centimeter binnen 0,5 millimeter van de monsters.Hard de monsters 40 seconden om het tijdelijke contact tussen tanden en het ongeharde tandheelkundige composiet te simuleren, en incubeer vervolgens de composietmonsters gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Ververs het medium om de drie dagen en passeer de cellen om de vijf dagen. Vervolgens, nadat de cultuur confluency heeft bereikt, oogst u de cellen en centrifugeert u ze gedurende vijf minuten bij 90 keer G en bij 37 graden Celsius.Suspendeer het pellet opnieuw in kweekmedium en zaai vervolgens de celsuspensie na het tellen van de cellen met een celdichtheid van 2,5 keer 10 tot de vierde cellen per milliliter in een kamerslidesysteem een nacht bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide. De volgende ochtend vervangt u het medium in twee putjes van de kamerslide met een milliliter van de geteste composietextracten en plaatst u de slide terug in de incubator om de cellen te beeldvormen door confocale time-lapse beeldvorming.Label eerst de composiet gecocultiveerde en controlecellen met live dead cytotoxiciteitskleuring voor eukaryote cellen volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de kamerslide 15 minuten na het kleuren in het donker in de confocale geïntegreerde kamer onder celcultuurcondities en warm de 473 nanometer en 559 nanometer lasers op. Gebruik vervolgens een detector met een nieuw ontwikkeld spectrum om automatisch de beeldvormingscondities voor de 473 nanometer laser in te stellen.Gebruik de framing- en zoomfuncties om het gebied van belang te selecteren en kies vervolgens de observatiemodus. Selecteer maximaal vijf soorten observatiemodi, waaronder time-lapse Zack en multi gebied naar behoefte, en vang vervolgens snel vijf kaartafbeeldingen met een 473 nanometer laser onder de 10 x objectief voor zowel het testmonster als controlecellen op wanneer de gewenste afbeeldingen zijn verkregen. Schakel over naar de 559 nanometer laser en vang afbeeldingen van de cel op de tweede fluorescentie zoals net gedemonstreerd.Alternatief, overlap de fluorescente en de lichtcontrastafbeeldingen met behulp van het geselecteerde punt op de X 60 live scherm om de live beeldopslag te observeren. De kaartafbeeldingen in het Olympus-afbeeldingsformaat voor signaalanalyse en de maximale projectieafbeeldingen is 24 bits per pixel. TIFF-bestanden gebruik vervolgens de verschillende analysetools om de intensiteitsprofiel van het signaal en de intensiteitsverhouding tussen de twee fluorescente kanalen te meten.Ten slotte analyseert u de verschillen in de fluorescente celsignalering tussen de twee groepen met de juiste software. In deze kaartafbeeldingen van live TED-kleuringcellen in alleen media of blootgesteld aan composietextract, werden geen verschillen waargenomen in de levensvatbaarheid van de cellen 15 minuten in de time-lapse periode. Hier tonen maximale projectieafbeeldingen van de controlecellen het vergrote lot van de cellen binnen de eerste 15 minuten en vijf uur later aan het einde van de time-lapse periode zoals waargenomen, er was geen significante variatie in de fluorescentie binnen de controlecellen gedurende de incubatieperiode.De ELS extra laag krimpende blootgestelde cellen namen een vergelijkbare spindelmorfologie aan als de controlecellen, maar vertoonden een lichte afname in het groene fluorescente signaal en een zeer lichte toename in rode fluorescentie aan het einde van de time-lapse periode. Het intensiteitsprofiel van de gekleurde cellen wordt geïllustreerd in deze grafieken waarin de calciumendothelium homodimeer een fluorescentie emissie intensiteiten werden gemeten op controle en composietblootgestelde cellen met een uur intervallen voor maximaal vijf uur. Er werden geen significante verschillen in signalering waargenomen tussen de twee culturen.De huidige gegevens benadrukken het gebruik van confocale time-lapse beeldvorming als een nauwkeurige en gevoelige methode om het gedrag van genfibroblasten in contact met tandheelkundige composieten te beoordelen na de ontwikkeling ervan. Deze methode biedt een privéweg voor onderzoekers op het gebied van toxicologie om de cytotoxiciteit en risicobeoordeling van tandheelkundige materialen, geneesmiddelen, chemische stoffen en andere medische hulpmiddelen te onderzoeken.

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Parker, J. J., et al. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases the imaging of glioblastoma tissue slices expressing green fluorescent protein (GFP) via confocal microscopy. High-resolution images are captured at consistent intervals to track tumor cell movement and direction.

Imaging Tumor Cell Migration in Glioblastoma Tissue Using Time-Lapse Scanning Confocal Microscopy

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

In deze studie wordt het gebruik van een in situ laadinrichting in combinatie met micro-X-ray tomografie vezelachtige gemeenschappelijke biomechanica besproken. Experimentele uitlezingen identificeerbaar met een totale verandering in joint biomechanica omvatten: 1) reactionaire kracht versus verplaatsing, namelijk tand verplaatsing binnen de alveolaire stopcontact en de reactionaire reactie op belasting, 2) drie-dimensionale (3D) ruimtelijke configuratie en morfometrie, dwz geometrische...

In situ drukbelasting en Correlatieve Niet-invasieve beeldvorming van de Bone-parodontale ligament-tooth Stapel Joint

Om de ruimtelijke ontwikkeling van polymerisatie krimp stress in tandheelkundige hars composietvullingen begrijpen, werd Digital Image Correlation gebruikt voor de volledige verplaatsingsveld / stam meting van herstelde model glas holten voorzien door het correleren van afbeeldingen van de restauratie vóór en na polymerisatie.

Krimp van Dental Composite in Gesimuleerde Cavity Gemeten met Digital Image Correlation

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen voor tandheelkundige prothese abutments, met inbegrip van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen en morfologische kenmerken. Een in situ -model die samenhangen met krachtige microscopie technieken wordt gebruikt voor de analyse orale biofilm.

Mondelinge Biofilm vorming op verschillende materialen voor tandheelkundige implantaten

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

De fluorescentie-ondersteunde identificatietechniek is een uitvoerbare, snelle en betrouwbare aanpak voor de differentiatie van composietharsrestauraties van tandsubstantie en vergemakkelijkt de minimaal invasieve en volledige verwijdering van composietharsrestauraties en composietgebonden traumaspalken.

Detectie en verwijdering van tandkleurige composiethars met behulp van de fluorescentie-ondersteunde identificatietechniek

Deze methodologie maakt het mogelijk om een tandheelkundig apparaat op elk monster onder elke hoek aan te brengen met gestandaardiseerde kracht en stabiliteit. Deze benadering kan op grote schaal worden gebruikt in de gezondheidswetenschappen om de effecten van tandheelkundige apparatuur te standaardiseren met handhoudende elementen zoals micromotoren, turbines en ultrasone scalers op verschillende oppervlakken.

Ruwheidseffect van piëzo-elektrische tandschaler op twee verschillende vloeibare composiet vulmaterialen

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Leer 3D confocale laser scanning microscopie met time-lapse imaging voor het evalueren van de biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten. Deze methode maakt real-time monitoring van menselijke gingivale fibroblasten mogelijk zonder celstructuur te verstoren.

Confocale Time Lapse Imaging als een efficiënte methode voor het Cytocompatibility Evaluatie van Dental Composites

Meer video's verkennen