Confocale Time Lapse Imaging als een efficiënte methode voor het Cytocompatibility Evaluatie van Dental Composites

Het algemene doel van deze procedure is om 3D confocale laserscanningmicroscopie te gebruiken voor time-lapse beeldvorming om de in vitro biocompatibiliteit van tandheelkundige composieten kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst sferische monsters van ongeharde tandheelkundige composiet te nemen in de tweede stap. Menselijke gingivale fibroblasten worden gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van deze composietextracten, en vervolgens worden de cellen gelabeld met live dead staining.

Vervolgens worden kaartbeelden van de celculturen gegenereerd en overlaybeelden gemaakt voor de gebieden van belang. Uiteindelijk kunnen de real-time verschillen in celgedrag die optreden in aanwezigheid of afwezigheid van de geteste composieten worden gemonitord volgens de veranderingen in de groene of rode fluorescente signalen die in de afbeeldingen worden waargenomen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn dat het realtime monitoring van levende cellen mogelijk maakt zonder veranderingen in de celstructuur te veroorzaken.

Er zijn geen fixatie- of droogstappen vereist na celkleuring of vóór time lapse observatie. Om de composietextract voor te bereiden, begint u met het gebruik van een op maat gemaakte houder met een straal van twee millimeter om sferische monsters van het ongeharde tandheelkundige composiet te vormen. Breng de monsters over naar individuele putjes van een zesputjesplaat die een milliliter kweekmedium bevat, zorg ervoor dat u enkele putjes met alleen media achterlaat voor controlecelculturen, en plaats vervolgens een LED-lamp met een intensiteit van 1070 milliwatt per vierkante centimeter binnen 0,5 millimeter van de monsters.

Hard de monsters 40 seconden om het tijdelijke contact tussen tanden en het ongeharde tandheelkundige composiet te simuleren, en incubeer vervolgens de composietmonsters gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Ververs het medium om de drie dagen en passeer de cellen om de vijf dagen. Vervolgens, nadat de cultuur confluency heeft bereikt, oogst u de cellen en centrifugeert u ze gedurende vijf minuten bij 90 keer G en bij 37 graden Celsius.

Suspendeer het pellet opnieuw in kweekmedium en zaai vervolgens de celsuspensie na het tellen van de cellen met een celdichtheid van 2,5 keer 10 tot de vierde cellen per milliliter in een kamerslidesysteem een nacht bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide. De volgende ochtend vervangt u het medium in twee putjes van de kamerslide met een milliliter van de geteste composietextracten en plaatst u de slide terug in de incubator om de cellen te beeldvormen door confocale time-lapse beeldvorming.

Label eerst de composiet gecocultiveerde en controlecellen met live dead cytotoxiciteitskleuring voor eukaryote cellen volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de kamerslide 15 minuten na het kleuren in het donker in de confocale geïntegreerde kamer onder celcultuurcondities en warm de 473 nanometer en 559 nanometer lasers op. Gebruik vervolgens een detector met een nieuw ontwikkeld spectrum om automatisch de beeldvormingscondities voor de 473 nanometer laser in te stellen.

Gebruik de framing- en zoomfuncties om het gebied van belang te selecteren en kies vervolgens de observatiemodus. Selecteer maximaal vijf soorten observatiemodi, waaronder time-lapse Zack en multi gebied naar behoefte, en vang vervolgens snel vijf kaartafbeeldingen met een 473 nanometer laser onder de 10 x objectief voor zowel het testmonster als controlecellen op wanneer de gewenste afbeeldingen zijn verkregen. Schakel over naar de 559 nanometer laser en vang afbeeldingen van de cel op de tweede fluorescentie zoals net gedemonstreerd.

Alternatief, overlap de fluorescente en de lichtcontrastafbeeldingen met behulp van het geselecteerde punt op de X 60 live scherm om de live beeldopslag te observeren. De kaartafbeeldingen in het Olympus-afbeeldingsformaat voor signaalanalyse en de maximale projectieafbeeldingen is 24 bits per pixel. TIFF-bestanden gebruik vervolgens de verschillende analysetools om de intensiteitsprofiel van het signaal en de intensiteitsverhouding tussen de twee fluorescente kanalen te meten.

Ten slotte analyseert u de verschillen in de fluorescente celsignalering tussen de twee groepen met de juiste software. In deze kaartafbeeldingen van live TED-kleuringcellen in alleen media of blootgesteld aan composietextract, werden geen verschillen waargenomen in de levensvatbaarheid van de cellen 15 minuten in de time-lapse periode. Hier tonen maximale projectieafbeeldingen van de controlecellen het vergrote lot van de cellen binnen de eerste 15 minuten en vijf uur later aan het einde van de time-lapse periode zoals waargenomen, er was geen significante variatie in de fluorescentie binnen de controlecellen gedurende de incubatieperiode.

De ELS extra laag krimpende blootgestelde cellen namen een vergelijkbare spindelmorfologie aan als de controlecellen, maar vertoonden een lichte afname in het groene fluorescente signaal en een zeer lichte toename in rode fluorescentie aan het einde van de time-lapse periode. Het intensiteitsprofiel van de gekleurde cellen wordt geïllustreerd in deze grafieken waarin de calciumendothelium homodimeer een fluorescentie emissie intensiteiten werden gemeten op controle en composietblootgestelde cellen met een uur intervallen voor maximaal vijf uur. Er werden geen significante verschillen in signalering waargenomen tussen de twee culturen.

De huidige gegevens benadrukken het gebruik van confocale time-lapse beeldvorming als een nauwkeurige en gevoelige methode om het gedrag van genfibroblasten in contact met tandheelkundige composieten te beoordelen na de ontwikkeling ervan. Deze methode biedt een privéweg voor onderzoekers op het gebied van toxicologie om de cytotoxiciteit en risicobeoordeling van tandheelkundige materialen, geneesmiddelen, chemische stoffen en andere medische hulpmiddelen te onderzoeken.