RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord
1 november 2014
Deze video toont de basisstappen voor het uitvoeren van een volledige transcriptoomanalyse op gedissecteerde vogelembryonale ruggenmergmonsters na transfectie met in ovo elektroporatie.
Het algemene doel van deze procedure is om de expressieniveaus van alle genen en monsters van geëlektropoerde kippenembryonale ruggenmerg te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst in ovo de rechterkant van vroege embryonale neurale buisjes te poren en de embryo's opnieuw in te couveer tot het gewenste stadium. De tweede stap van de procedure is om met succes getransfecteerde neurale buishelften in een RNA-vrije omgeving te dissecteren en zo snel mogelijk door te gaan met lysering.
De derde stap is om RNA te isoleren en de monsters te onderwerpen aan bibliotheekvoorbereiding en high-throughput sequencing. De laatste stap is om de datasets te verwerken om sequencingartefacten te verwijderen. Breng rassen tot het genoom en wijs expressieniveaus toe aan elk gen.
Uiteindelijk kunnen resultaten differentieel geëxpresseerde genen tonen door vergelijking van expressieniveaus onder controle en experimentele omstandigheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal als een neurobuisdissectie. Stappen zijn moeilijk te leren omdat we bekend moeten zijn met embryomanipulatie.
Voor deze demonstratie zijn de embryo's getransformeerd met de GFP-expresserende constructie bij de neurale buis. Bereid je voor om twee uur te werken aan maximaal 10 embryo's om één tot twee microgram totaal RNA per embryo te verzamelen. Onder vrije RNA-omstandigheden, verzamel de embryo's met behulp van fijne dissectiescharen en een SVE-verzamellepele en breng elk embryo naar koud over.
DEPC-behandeld. Gebruik PBS als oplossing voor alle neurale buisisolatie-stappen. Gebruik fijne pincetten om de volledige flankregio van een embryo tussen de ledemaatknoppen te verwijderen. Verplaats dit gedeelte naar verse koude oplossing met het weefsel dorsale kant omhoog.
Gebruik twee fijne glazen naalden om drie plekken op elke dorsale laterale kant van het embryo tussen de neurale buis en parial mesoderm te doorboren. Introduceer nu de twee glazen naalden in de centrale perforatie en beweeg ze uit elkaar langs de AP-as. Doe dit door elke perforatie heen zoals nodig is om uiteindelijk het parial mesoderm los te maken, verwijder en gooi dit weefsel weg.
Keer vervolgens het embryo opzij en introduceer de uiteinden van twee pincetten tussen de neurale buis en de nodale koord. Schuif ze uit elkaar langs de AP-as om de structuren te verdelen. Voltooi het verwijderen van grotere stukken mederweefsel uit de neurale buis door het voorzichtig vast te zetten met pincetten terwijl je het overtollige mesoderm eraf plukt.
Breng vervolgens voorzichtig de neurale buis over naar verse koude oplossing. Gebruik een glazen pipet met een handmatige pomp om alle benodigde neurale buizen te verzamelen en houd ze op ijs voordat je verdergaat. Verdeel nu elk van de neurale buizen in twee helften.
Voer scherpe puntpincetten in het lumen in en scheur door het dakplaatje. Gebruik vervolgens de pincetten om door de bodemplaat te snijden en het weefsel in tweeën te verdelen. Gebruik een fluorescente dissectiemicroscoop om de geëlektropoerde van de niet-geëlektropoerde helften te sorteren.
Breng de gesorteerde neurale buishelften over naar een 1,5 milliliterbuis met verse oplossing. Klop deze buizen om al het weefsel naar de bodem te krijgen. Draai vervolgens de buizen gedurende enkele seconden bij 100 GS neer.
Asptereer vervolgens zeer voorzichtig onder felle verlichting het snat op. Als er weefsel wordt opgezogen, spuug het langzaam weer uit en herhaal het spinnen. Zodra de neurale buishelften zijn vrijgemaakt van oplossing, voeg je 70 microliter per neurale buis toe, de helft van de lysisbuffer naar de buis.
Klop de buis en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten elke vijf minuten, voort. Gebruik de buis krachtig en ga door met het verzamelen van het RNA om RNA te zuiveren. Voor sequencing, heb minimaal acht neurale buishelften per monster. Andere collecties van lyce neurale buizen opgeslagen bij min 80 graden Celsius kunnen worden gepoold in de collectie. Begin met het ontdooien op ijs gedurende 15 tot 30 minuten en voltooi het ontdooien bij kamertemperatuur.
Na het ontdooien, voort alle monsters krachtig en laat ze vijf minuten staan. Voort dan de monsters opnieuw en centrifugeer ze gedurende één minuut bij 15.000 GS. Om onoplosbaar materiaal te verwijderen, breng de supernatant over naar een nieuwe buis en ga door met de extractie.
Gebruik een RNA-isolatiekit om het proces te voltooien door de RNA uit te sluiten met de grootst mogelijke concentratie. Dit protocol vereist een Galaxy-website-account om de benodigde ruimtekwotum te garanderen. FTP upload eerst de FASTQ-bestanden naar de site, tenzij kwaliteitsscores al zijn gecodeerd in Shred plus 33.
Bereid eerst de geüploade datasets voor met behulp van de FASTQ-groomtool onder het NGS QC en Manipulatie-menu. Verander anders onder attributen het bestandstype naar FASTQ-afzender. Gebruik vervolgens onder het NGS QC en Manipulatie-menu de FAST QC-tool om de algemene kwaliteit van de datasets te analyseren.
Selecteer de FASTQ-kwaliteitstrimmer onder hetzelfde menu om de drie prime-einden die van lage kwaliteit zijn weg te gooien. Een kwaliteitsscore van 20 of hoger moet worden verwerkt. Ga nu naar de cliptool onder hetzelfde menu.
Stel deze tool in om leestaken weg te gooien met minder dan 45 basenparen. Voer de adaptersequentie in. Schakel de optie uit om leestaken met onbekende basen weg te gooien en kies de uitvoer om zowel geknipte als niet-geknipte sequenties te omvatten.
Ga door met de trimsequentietool. Gebruik deze om de eerste basen van de leesop te trimmen om de vijf prime-sequentiebias te verwijderen die door FAST qc wordt gedetecteerd. De volgende stap is om de nieuwste kippengenoomsamenstelling van de Illumina I-genoomsite te downloaden en uit te pakken.
Upload vervolgens het volledige genoomsnellere formaatbestand en het gen-annotatie GTF-formaatbestand naar de Galaxy History. Kaart nu de leestaken voor elk monster naar het genoom door de N-G-S-R-N-A-analysemenu te openen en het top hat two-tool te selecteren. Selecteer he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert de procedure voor whole transcriptome-analyse van gedissecteerde monsters van het embryonale ruggenmerg van kuikens na in ovo elektroporatie. De methode is bedoeld om de genexpressieniveaus in de geëlektroporeerde ruggenmergen te evalueren.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genexpressie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Analyse van het gehele transcriptoom biedt inzicht in genexpressie.
- In ovo elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt voor de transfectie van embryonale weefsels.
- Kikkerembryo's dienen als model voor het bestuderen van de ontwikkeling van het ruggenmerg.
- RNA-isolatie is essentieel voor een nauwkeurige transcriptomische analyse.
Doel van de studie
- Om de expressieniveaus van alle genen in embryonale ruggenmergen van kuikens te bepalen.
- Om de effectiviteit van in ovo electroporatie voor genoverdracht te evalueren.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in transcriptomics.
Gebruikte methoden
- In ovo elektroporatie van kippenembryo's.
- Dissectie van neurale buishelften in een RNA-vrije omgeving.
- RNA-isolatie en bibliotheekpreparatie.
- High-throughput sequencing en gegevensverwerking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van RNA uit geëlektroporeerde ruggenmergen.
- Kwalitatief hoogwaardige sequentiesgegevens verkregen uit de monsters.
- Expressieniveaus van diverse genen toegewezen aan het genoom.
- Identificatie van sequencing-artefacten en de verwijdering daarvan.
Conclusies
- Het protocol beoordeelt effectief de genexpressie in ruggenmergen van kuikens.
- In ovo elektroporatie is een levensvatbare methode voor gentransfectie.
- Deze studie biedt een basis voor toekomstig transcriptomisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt targetvalidatie in de vroege fase van neurowetenschappelijk onderzoek mogelijk door genetische manipulatie te koppelen aan functionele read-outs van het gehele transcriptoom. Het ondersteunt het mechanistisch minimaliseren van risico's bij hypothesen over neurale factoren via kwantitatieve differentiële expressieanalyse. De benadering biedt voorspellende zekerheid voor het prioriteren van targets in ontwikkelingspaden van het ruggenmerg voordat men overgaat tot inspanningen voor lead-identificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door genoombrede transcriptionele responsen te meten op elektroporeerde constructen in het embryonale ruggenmerg.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een kiजembyo-model om neurale targets functioneel te valideren in een ziekte-relevant systeem met een hoge transcriptionele getrouwheid.
- Voorspellende waarde: Maakt detectie van differentieel tot expressie gekomen genen mogelijk om de betrokkenheid van signaalpaden te verduidelijken en targetmechanismen te de-risken voorafgaand aan de ontwikkeling van assays.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert RNA-seq-data van hoge kwaliteit die geschikt zijn voor het vaststellen van basistranscriptomen in controle- en experimentele condities.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare genexpressiemetingen die assay-standaardisatie ondersteunen voor downstream screeningcampagnes.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt gebruik van de publieke Galaxy-server voor bio-informaticaverwerking, waardoor lokale computationele infrastructuur overbodig is bij target-validatiestudies op kleine tot middelgrote schaal.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Verbindt bevindingen uit vroege ontdekkingen met preklinische continuïteit door het identificeren van differentieel tot expressie gebrachte genen die relevant zijn voor ontwikkelingspaden van het ruggenmerg.
- Mechanistische risicoreductie: Bevestigt overexpressie van het construct (bijv. scratch twee zinkvinger-domeinen) via transcriptomische verrijking, wat de validatie van target-interactie ondersteunt.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Maakt gebruik van replica-controlemonsters met een Pearson-correlatie van 0,99 om de detectiegevoeligheid voor werkelijke differentiële expressie in experimentele condities te waarborgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen, door functionele read-outs op transcriptoomniveau te leveren die de selectie en prioritering van targets ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door transcriptomen van controle- en experimentele ruggenmerghelften te vergelijken na elektroporatie.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde RNA-isolatie en library-preparatie onder RNase-vrije condities, wat resulteert in monsters die klaar zijn voor sequencing.
- Analytics: Levert kwantitatieve genexpressiemetingen via RNA-seq, waardoor vergelijking van expressieniveaus en identificatie van significant differentieel tot expressie gebrachte transcripten mogelijk is met behulp van Q-waarde drempelwaarden.
- Translational Research: Verbindt vroege targetvalidatie met preklinische relevantie door differentieel tot expressie gebrachte genen in neurale ontwikkelingspaden te identificeren, met visuele verificatie van overexpressie van het construct.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor transcriptoomanalyse voor neurale targetvalidatie die kan worden toegepast op meerdere constructen en ontwikkelingsstadia.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen in targetvalidatie via genoombrede expressieprofilering en vermindert mechanistische ambiguïteit in modellen voor neurale ontwikkeling.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via RNase-vrije dissectie, hoogwaardige RNA-isolatie (RIN 10) en bio-informatische verwerking via publieke servers.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van transcriptionele responsen mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een laat stadium bij neuroscience target-programma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde targetprioritering door het leveren van kwantitatieve differentiële expressiedata die beslissingen over verdere ontwikkeling bij lead-identificatie informeren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in embryomanipulatie, in ovo elektroporatie en het omgaan met weefsels in een RNase-vrije omgeving voor een succesvolle dissectie van de neurale buis.
- Is afhankelijk van toegang tot high-throughput sequencing en publieke bioinformatica-platforms (Galaxy) voor de verwerking van RNA-seq-gegevens en differentieële expressieanalyse.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor de embryonale stadia (HH23), consistentie bij dissectie en bibliotheekpreparatie om reproduceerbare transcriptoomvergelijkingen te garanderen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende embryonale stadia, constructen of modelsystemen buiten het ruggenmerg van de kuikenembryo.
- Praktische beperkingen omvatten de technische moeilijkheidsgraad van de dissectie van de neurale buis en de noodzaak van biologische replica's om voldoende statistische kracht te bereiken voor het detecteren van differentieële expressie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Harvesting Neural Tubes for RNA Collection
4:32
Pooling Tissue to Purify RNA for Illumina Sequencing
5:34
Comparing RNA-Seq Datasets on the Galaxy Public Server
9:52
Transcriptome Analysis Quality
9:52
Results: Transcriptome Analyis Quality
10:42
Conclusion
