Name: Voortplanting van Homalodisca coagulata virus-01 Via Homalodisca vitripennis Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Leer hoe je HoCV-1 repliceert in Homalodisca vitripennis-celculturen met RNA-extractie en qRT-PCR. Deze methode biedt een betrouwbaar model voor virologisch onderzoek naar virus-replicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen onze dank uiten aan het Texas Pierce’s Disease Research and Education Program en USDA-APHIS voor hun financiële steun voor dit project. We willen ook Hema Kothari aan de University of Texas Health Science Center in Tyler bedanken voor haar hulp bij confocale microscopie.

1 Celkweek OPMERKING: Homalodisca vitripennis vastgesteld door de Dr Wayne Hunter laboratorium aan de USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) cellijnen werden gebruikt om een lab stock bestaat uit gemengde cel stadia waaronder initiële fibroblasten en monolagen initiëren. <ol><li> Voer de volgende procedures in een steriele testomgeving gehandhaafd bij een temperatuur van 20-24 ° C met 25 cm2 cultuur flessen. </li><li> Cultiveren en kweken handhaven 25 cm2 weefselkweek kolven met H2G + Leafhopper medium, een gemodificeerd WH2 honingbij medium 10 (tabel 1). </li><li> Incubeer cultuur kolven bij 24 ° C met ~ 53% luchtvochtigheid. </li><li> Gebruik een omgekeerde microscoop bij een totale vergroting (TM) van 100X te controleren groei cultuur, bijvoorbeeld, controleren of er geen abnormale celgroei, controleren op eventuele verontreinigingen, en laat de groei vooruitgang in de cultuur oppervlak. </li><li> Voer een compleet medium verandering (~ 4 ml kweekmedium per fles) elke 7-10 dagen zonder de cultuur oppervlak verstoren. </li><li> Ga kweken wanneer de kweekoppervlak ongeveer 80% onder celgroei (confluent) met 0,25% trypsine bevattende ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) om cellen dissociëren. Voeg ~ 2 - 3 ml trypsine aan elke cultuur kolf en bloot cultuur (s) om het enzym gedurende korte tijd (5 - 10 min) tot het volledig celdissociatie bereiken. </li><li> Voeg een gelijke hoeveelheid vers medium aan de kweek kolf (en) (~ 2 - 3 ml) om enzymactiviteit te stoppen en breng de hele oplossing tot een conische buis centrifugeren. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 6 min bij 350 x g. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet en voeg ~ 8 ml vers medium aan elke buis. Voorzichtig homogeniseren cellen met een pipet. </li><li> Split culturen op een 1: 2 verhouding voor 25 cm 2 flessen (~ 4 ml cel solutiop per kolf) en laat vers doorgegeven kweken ongestoord gedurende 48 uur om cellen in suspensie te stevig aan het oppervlak van de kolf. OPMERKING: Cultuur van cellen in 48-well steriele weefselkweekplaten met een groei oppervlak van 1 cm2 is ook mogelijk en kunnen worden gehandhaafd op dezelfde wijze als kolven met een vermindering van de hoeveelheid kweekmedium ~ 250 ul. </li></ol> 2 Hele Virus Extraction <ol><li> Homogeniseren hele lichamen van virus positieve H. vitripennis in fosfaatbuffer, pH ~ 7,2, met 0,02% natrium diethyldithiocarbamaat trihydraat (DETCA) door vortexen ~ 10 seconden intervallen tot er geen klontjes meer groot weefsel aanwezig. Extract virus via supersnel centrifugatie bij 124.500 g gedurende 4 uur bij 4 ° C en 22.000 g gedurende 16 uur bij 4 ° C. Als er een neerslag vormt boven, verwijderen met een steriel wattenstaafje 11. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Verzamel de pellet enoplossen met 5 ml van 10 mM fosfaatbuffer (geen DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-deoxycholinezuur en 4% polyethyleenglycol hexadecyl ether (Brij 52). <ol><li> De pellet meng, verwijdert de pellet van de zijkant van de buis en crush tot in oplossing indien nodig. </li><li> Voeg meer 10 mM fosfaatbuffer in stappen ~ 5 ml om de pellet in oplossing gaan indien nodig en combineren tot 2 tubes 11. </li></ol></li><li> Centrifugeer de oplossing bij 300 xg gedurende 15 min 11. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en laat de oplossing door een 0,45 pm filter, en verzamel het filtraat in grote collectie buis 11. </li><li> Transfer filtraat een dialysemembraan met een molecuulgewicht cut off (MWCO) van 3,5 kD, met kleine hoeveelheden van 10 mM fosfaatbuffer (pH 7) die geen DETCA indien nodig 11. </li><li> Plaats het dialysemembraan in een groot bekerglas gevuld met DDH 2 O bij 4 ° C. Wijzig de DDH 2 O elk uur fof 5 - 6 uur, totdat een wit neerslag vormt in het membraan 11. </li><li> Verzamel de gezuiverde virus vanuit het membraan en onderwerpen 100% virusoplossing een 10-voudige verdunningsreeks door 10 pi oplossing van 90 ul van DDH 2 O. Vervolgens voeg 10 ul van de verdunning naar de andere 90 ul van DDH 2 O tot het bereiken van een verdunning van 1: 100.000. </li><li> WINKEL virus oplossing bij -80 ° C. </li></ol> 3 Virale replicatie <ol><li> Zaad cellen in 48 putjes en groeien alle rijen tot celgroei is 80% samenvloeiing (ongeveer 72 uur na pas als de cellen groeien met een gemiddelde snelheid). </li><li> Inoculeer elke rij van cellen met de seriële verdunde virus eenmaal celgroei confluentie bereikt, dat wil zeggen een rij van een 1:10 verdunning, een rij van een 1: 100 verdunning, etc., behalve de bovenste rij. Gebruik de bovenste rij als controle en voeg 10 ul van DDH 2 O aan elk en een volumeregelaar. <ol><li> Om een ​​conferentie basislijn celconcentratie vast ter vergelijking met experimentele celtellingen, dissociëren en tel het eerste putje van elke rij vóór de initiële inoculatie van elke putjes in de kweken met virus. </li></ol></li><li> Monitor kweekplaten elke 24 uur na virale inoculatie voor kleurverandering in het medium aangeeft een pH-verandering en wijzigingen in celmorfologie. </li><li> Afbeelding een kolom van de testplaat op elk tijdstip, met een omgekeerde microscoop bij 100x TM. </li><li> Verwijder alle medium uit de kolom die werd afgebeeld op elke 24 uur tijdstip en opslaan korte termijn bij -20 ° C voor RNA extractie en virale kwantificering of lange termijn bij -80 ° C. </li><li> Cellen losmaken van de putjes na wegnemen van medium zoals eerder beschreven in stap 1,6-1,9, met alleen ~ 250 ul 0,25% trypsine EDTA en vers medium om enzymactiviteit ~ 250 ul vers medium stoppen om resuspendeer de cel pellet. </li><li> Voeg 10 ul van 0,4% trypan blue stain aan elke buis bevattende cellen celtellingen voeren na celdissociatie voor elke periode van 24 uur meer dan een week. Laat vlek te zitten voor 10 minuten voor het uitvoeren van cel-tellingen. <ol><li> Voer celtellingen binnen 1 uur blootstelling beitsen of levensvatbare cellen begint te vlek als niet-levensvatbare cellen respons Het. </li></ol></li><li> Voeg langzaam 10 ul van de gekleurde celoplossing aan elke kant van een standaard hemocytometer met een micropipet. Laat de oplossing worden gemaakt door capillaire werking om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Tel het aantal levensvatbare (niet gekleurd) cellen aan beide zijden van de hemocytometer (het equivalent van 4 tellen van de 16 vierkanten in de hemocytometer). Voer celtellingen voor elk putje van de kolom die werd verwijderd. </li><li> Het gemiddelde van de cel-tellingen van elke kolom en gebruikt u de volgende formule om de totale celgetal nummer te verkrijgen: (gemiddeld aantal cellen / 4) x verdunningsfactor = aantal cellen x 10 <sup&gt; 4 ml. Dit is de celdichtheid of het aantal levensvatbare cellen in de kweek. </li></ol> 4 Virus Winning van Cell Culture <ol><li> Verwijder behandeld H. vitripennis cellen van kweekflessen zoals eerder beschreven in stap 1,6-1,8, met alleen ~ 250 ul 0,25% trypsine EDTA en vers medium om enzymactiviteit te stoppen. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Uittreksel virus van kweekcellen volgens het protocol eerder beschreven in stap 2,3-2,8. </li></ol> 5 RNA extractie <ol><li> Uittreksel RNA van mediummonsters gedurende elke week virus proef met een guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie ontworpen voor vloeibare monsters per protocol van de fabrikant verzameld. </li><li> WINKEL geëxtraheerde monsters bij -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Vast virale standaarden voor RT-PCR door het uitvoeren van PCR met de traditioneleprimerpaar HoCV RT-PCR-primer 1 (forward 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-omgekeerde ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) met virusisolaat van hele lichaam H. vitripennis. </li><li> Betreft PCR product aan elektroforese gel gedurende 60 minuten bij 120 V in een 2% agarose gel die 0,1% ethidiumbromide. </li><li> Accijnzen de banden van de gel en zuiveren met behulp van een gel extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Pool al uitgesneden en gel gezuiverd product en verder te zuiveren door elementaire ethanolprecipitatie. Elueer de precipitatie product in ongeveer 30 pl Tris EDTA (TE) de algemene monsterconcentratie verhogen. </li><li> Kwantificeren van de mate van cDNA in gepoolde monsters via spectrofotometrie met behulp van 260/230 golflengte instellingen voor nucleïnezuur detectie. </li><li> Voer een tienvoudige seriële verdunningsreeks van het gezuiverde monster variërend van 57 ng / ul tot 57 ag / pl (10 -18). Voer de seriële verdunning vergelijkbaar met die beschreven in 2.8 met aanpassingen voor het verschil in concentratie-eisen. </li><li> Bepaal detectielimieten van de verdunningsreeks door het uitvoeren qRT-PCR met een qRT-PCR kit met betrouwbare kwantificatie van lage abundantie transcripten. OPMERKING: Virale concentraties lager dan 5 x 10 -3 kopieën zijn niet detecteerbaar. </li><li> Uittreksel RNA experimentele monsters zoals eerder beschreven in stap 5.1 en kwantificeren met spectrofotometrie. </li><li> Normaliseren alle geëxtraheerde monsters 5 ng / ul met nuclease vrij water. </li><li> Voer qRT-PCR op alle monsters in duplo, zoals 25 ul reacties middels een stap qRT-PCR kit met de mogelijkheid om lage aantal kopieën voelen als volgt: 50 ° C houden gedurende 10 min; 95 ° C gedurende 5 minuten; 30 cycli van 95 ° C gedurende 10 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden; smelt 50-99 ° C gedurende 5 seconden op elke stap. <ol><li> Maak de master mix, zodat elk reactiemengsel bevat 12,5 ul 1x master mix, 1,0 pl (0,3 uM) van de forward primer, 1,0 pl (0,3 uM) van de reverse primer, 0,25 pl van reverse transcriptase en variabele hoeveelheden template op basis van standaardisatie waarden. </li><li> Breng het totale reactievolume op 25 ui met RNase-free water. </li><li> Onder meer vijf standaard concentraties in elke PCR uitgevoerd met de volgende kopie nummers: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, en 5 x 10 -2 exemplaren. Stel de drempel voor elke run tot net onder een fluorescentie van 10x -2,5 tot geluidsoverlast tijdens de vroege overname aan het begin van elke run te verminderen. </li></ol></li></ol> 7 confocale microscopie <ol><li> Groeien Homalodisca vitripennis cellen in een twaalf wells plaat met dekglaasjes meet 18 mm in diameter in elk putje. </li><li> Inoculeer een kolom op de plaat elke 24 uur gedurende een periode van vier dagen nadat een monolaag bereikt. Zorg ervoor dat elke column bevat een controle goed, een lage virale verdunning (1:10) goed en een hoge virale verdunning (1: 100.000) goed. Gebruik virus oplossingen verkregen uit stap 2.8. </li><li> Verwijder alle media op de vijfde dag en was de cellen tweemaal met 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixeer de cellen met koude 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 500 ul van 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de cellen en wassen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker bij lage snelheid. Was de cellen drie keer. </li><li> Voeg 500 ul van 0,1% Triton X-100 aan de cellen te permeabiliseren. Laat zitten voor 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen opnieuw zoals eerder beschreven in stap 7.5. </li><li> Voeg 500 ul van een 5% bovine serum albumine (BSA) oplossing om cellen te blokkeren bij kamertemperatuur. Laat zitten voor 2 uur en vervolgens te verwijderen. </li><li> Verdunnen voorraad Rhodamine rood-geconjugeerde phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS met 5% BSA en voeg 250 ul van de verdunning aan elk putje om beits voor F-actine. </li><li> Afdekplaat in aluminium folie te voorkomen dat de kleurstof van bleken en incubeer cellen bij 4 ° CO / N. </li><li> Verwijder de RCP na 12 uur incubatie en vervangen door 250 ul van 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (250 ug / ml) verdund in 1 x PBS bevattende 5% BSA, de kernen van de cellen vlek . </li><li> Incubeer de cellen met DAPI bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was de cellen drie keer met 1x PBS zoals eerder beschreven in stap 7.5. </li><li> Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de putten en monteren op dia microscoop met een montage media met een anti-fade reagens. </li><li> Laat de dia&#39;s te drogen in lichtdichte dozen totdat bekeken onder de confocale microscoop. Bekijk voorbereid dia&#39;s zo snel mogelijk als kleurstoffen snel kan vervagen. </li><li> Afbeelding gekleurde cellen met behulp van een confocale systeem uitgerust met een microscoop met een 63X (olie) van plan-apochromate lens. <ol><li> Stel de laser golflengte tot 543 ± 10 nm excitatie en 575 ± 10 nm emissie voor Rhoadmine rood-conjucated phalloidin, En 369 ± 10 nm excitatie en 450 ± 30 nm emissie voor DAPI. </li><li> Gebruik identieke gain en off-set instellingen voor de melder om alle beelden te verkrijgen. </li><li> Proces beelden met behulp van de juiste software voor het verwerken en sorteren en import gewenste beelden in een beeld het beheren van software. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Stijgende bezorgdheid over de instroom van invasieve landbouwgewassen hebben geleid tot een toenemende vraag naar nieuwe methodieken om te verdedigen tegen nieuwe plagen en pathogenen. Een focus van ziektepreventie en-beheer omvat het beheer van de ziekteverwekker vectoren en was het primaire doel van deze studie. Economie spelen een vitale rol in de beslissing om dit soort biopesticide om pathogeen vectoren te beheren in de landbouw, omdat de praktische toepassing moet zijn grote hoeveelheden over grote gebieden, maar ...

De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis Germar 1821) is geïdentificeerd als de belangrijkste vector van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), de veroorzaker van de ziekte van wijnstok (PD) Pierce&#39;s in Noord-Amerika 1. Insect beheer bevolking heeft snel de focus van het onderzoek worden bij dit verwoestende probleem om de wijnbouw-industrie te bestrijden in Californië en over de zuidelijke Verenigde Staten. Een positief-sense, enkelstrengs RNA-virus behoort tot de familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is vastgesteld bij wilde H. vitripennis populatie en aangetoond dat de sterfte te verhogen in deze populaties 2-4, terwijl het verlagen van de weerstand van het insect om insecticiden. Ontwikkeling van methoden om effectief achter besmet H. vitripennis naar volwassenheid in een laboratorium setting zijn moeilijk omdat geweest <em&gt; H. vitripennis verschillende fase-specifieke voedingsbehoeften die verschillende gastheerplanten 5-8 vereisen. Specifieke voorzieningen nodig zijn aan de achterzijde voor live H. vitripennis in de Verenigde Staten; Daarom celkweek economischer en een alternatief, en steeds belangrijker voor HoCV-01 detectie en replicatie 2,9. Terwijl elementaire methoden voor het vaststellen van celculturen van H. vitripennis beschreven, deze methoden zijn nog niet gebruikt voor commerciële productie van biologische bestrijdingsmiddelen, zoals virussen 2. De algemene doelstelling van de volgende procedures is een hoge concentratie van HoCV-01 geschikt voor gebruik als een biologisch bestrijdingsmiddel te produceren. Virale replicatie vereist een levende cel, waarvan de reden waarom succes cultiveert en het optimaliseren van H. vitripennis culturen is essentieel voor de voortgang van de productie van winstgevende niveaus van het virus.

<table><tbody><tr><td>Corning cell culture flasks</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Oppervlakte 25 cm2, canted hals, dop (plug seal)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Inverteer microscoop en camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0,25%, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek, 2,5 g varkenstrypsine en 0,2 g EDTA &bull; 4Na per liter Hanks' Balanced Salt Solution met fenolrood</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR multiwell kweekplaten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 putjes (TC behandeld met deksel)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Natriumdiethyldithiocarbamaat trihydraat</td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuümfiltersysteem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Cellulose acetaatmembraan, poriegrootte 0,45 &mu;m, membraangebied 54,5 cm2, filtercapaciteit 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyethyleenglycol hexadecylether</td></tr><tr><td>Fosfaat buffer oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Ontvangen als 100 mM verdund tot 10 mM met steriel water</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Voor elektroforese</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, voor moleculaire biologie, poeder</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagenskwaliteit, kristallijn</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine red-geconjugeerd phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin is een hoge affiniteit F-actine sonde geconjugeerd aan de rood-oranje fluorescerende kleurstof, tetramethylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagens</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Confocal Systeem</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace&rsquo;s Insect medium (gesupplementeerd, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>L-histidine monohydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salts (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>MEM, aminozuurmix (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>1 M MgCl oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Pen-Strep (met glutamine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ bladluismedium component</td></tr></tbody></table>

voortplanting van<em&gt; homalodisca coagulata virus-01</em&gt; via<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; cell culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis) is een zeer vagile en polyfage insect gevonden in de zuidwestelijke Verenigde Staten. Deze insecten zijn de belangrijkste vectoren van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), een-houtvaten beperkt bacterie die de veroorzaker van de ziekte van Pierce (PD) van wijnstok. De ziekte van Pierce is economisch schadelijk; aldus, H. vitripennis hebben een doel voor pathogeen management strategieën worden. A dicistrovirus geïdentificeerd als Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is geassocieerd met een verhoogde mortaliteit in H. vitripennis populaties. Omdat een gastheercel nodig HoCV-01 replicatie, celkweek verschaft een uniforme omgeving voor gerichte replicatie die logistiek als economisch waardevol voor biopesticide productie. In deze studie, een systeem voor grootschalige vermeerdering van H. vitripennis cellen via weefselkweek ontwikkeld, providing een virale replicatie mechanisme. HoCV-01 werd geëxtraheerd uit hele lichaam insecten en gebruikt om gekweekte H. inoculeren vitripennis cellen op verschillende niveaus. Het kweekmedium werd elke 24 uur gedurende 168 uur, RNA geëxtraheerd en geanalyseerd met qRT-PCR verwijderd. Cellen werden gekleurd met trypaanblauw en telde tot cel overlevingskansen te kwantificeren met behulp van een lichtmicroscoop. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd tot 96 uur na infectie, waarbij het tijdstip bepaald voordat totale celkweek ineenstorting opgetreden was. Cellen werden ook onderworpen aan fluorescentiekleuring en bekeken met behulp van confocale microscopie om virale activiteit op de F-actine gehechtheid en kernen integriteit te onderzoeken. De conclusie van deze studie is dat H. vitripennis cellen kunnen worden gekweekt en gebruikt voor massaproductie van HoCV-01 op een passend niveau productie van een biopesticide mogelijk.

Cel aanhechting en groei werd gezien binnen de 48 uur van de passage in zowel kleine als grote kweekflessen, van primaire culturen en voortgezet passages. Groei en ontwikkeling van fibroblasten werd ook waargenomen binnen dit tijdsbestek. Bij nieuw geplaatste flessen werden verstoord vóór 48 uur, was er een zichtbare vermindering van celhechting, wat leidt tot langzamer groeiende kweken en soms niet gehecht of groei meer. Cellen werden ongeveer 80% confluent binnen een week passing en vormden een monolaag 10-14 dagen <s...

Hier presenteren we een protocol om Homalodisca vitripennis cellen en HoCV-1 propageren in vitro. Medium werd verwijderd uit HoCV-1 positieve kweken en RNA geëxtraheerd elke 24 uur gedurende 168 uur. Cell overlevingsvermogen werd gekwantificeerd door trypan blauw kleuring. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd na infectie. Geëxtraheerde RNA werd gekwantificeerd door qRT-PCR.

Voortplanting van<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om vast te stellen of Homalodisca coagulata virus one of HOCV-one kan worden gerepliceerd met behulp van Homalodisca vitripennis celculturen en vervolgens kan worden geëxtraheerd voor verdere downstream toepassingen. Dit wordt bereikt door H. vitripennis succesvol te cultiveren om gezuiverd HOCV-one te introduceren voor replicatie. Als tweede stap worden het medium en de cellen die het virus bevatten uit de cultuur verwijderd, waarna ze worden onderworpen aan virus- en RNA-extracties.Vervolgens wordt het geëxtraheerde RNA uit de geïnfecteerde culturen onderworpen aan PCR om te bepalen of er viraal RNA in de cellen aanwezig is. De resultaten tonen aan dat HOCV one in vivo kan worden gerepliceerd, gebaseerd op levende celtellingen voor en na infectie en qRT-PCR analyse.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het kweken van geïnfecteerde levende insecten, is dat het economischer is en gemakkelijker beheersbaar met minimale faciliteiten en apparatuur. Het gebruik van deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van biologische bestrijding. Kan bijvoorbeeld een i

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Bron: Biesbrock, A. M. et al. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (2014)Deze video demonstreert de in vitro propagatie van Homalodisca coagulata Virus-01 met behulp van gastcellen afgeleid van insecten. Er wordt ingegaan op de stappen voor viruszuivering, inoculatie en replicatie binnen gekweekte insectencellen.

Isolatie en zuivering van virussen uit geïnfecteerde insectenlichamen

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Herpesvirus van kalkoenen (HVT) wordt veel gebruikt als een vector-platform voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en snelle aanpak voor de generatie van recombinante HVT-vectored vaccins met behulp van een geïntegreerde NHEJ-CRISPR/Cas9 en de Cre-Lox systeem.

Genereren van recombinante aviaire Herpesvirus vectoren met CRISPR/Cas9 Gene bewerken

Dit protocol wordt beschreven hoe om virale infectie in vivo bij Drosophila melanogaster met behulp van de methode van de nano-injectie en de basistechnieken voor het analyseren van virus-gastheer interactie.

Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster

Dit protocol beschrijft een experimenteel proces voor het produceren van hoogtiter infectieuze virale pseudo-getypte deeltjes (PP) met envelop glycoproteïnen uit twee influenza-A-stammen en hoe ze hun infectiviteit kunnen bepalen. Dit protocol is zeer aanpasbaar om PPS te ontwikkelen van elk ander type omhulde virussen met verschillende envelop glycoproteïnen.

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

Hier beschreven is een effectieve methode voor het produceren van hoge virale titer voorraden van hepatitis E-virus (HEV) om efficiënt te infecteren hepatoma cellen. Met de gepresenteerde methode kunnen zowel niet-omhulde, als omhulde virale deeltjes worden geoogst en gebruikt voor het inenten van verschillende cellijnen.

Een cel cultuur model voor de productie van hoge titer hepatitis E virus voorraden

Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

Leer hoe je HoCV-1 repliceert in Homalodisca vitripennis-celculturen met RNA-extractie en qRT-PCR. Deze methode biedt een betrouwbaar model voor virologisch onderzoek naar virus-replicatie.

Voortplanting van

Meer video's verkennen