Name: Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer fotoreceptorisolatie uit muizenretina met vibratoomsectie voor celkweek. Deze methode biedt hoge zuiverheid en toepassingen voor erfelijke retinale degeneratieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Igal Gery en David Hicks voor anti-SAG-antilichamen. Ram Fridlich voor het lezen van het manuscript.

OPMERKING: De procedure werd goedgekeurd door de ethische commissie van Darwin van de Universiteit Pierre en Marie Curie (CE5 / 2009/048) 1. Voorbereiding van de gelatine-oplossing, Instrumenten, Vibratome, Cultuur Media en Cultuur Plate <ol><li> Bereid een 20% gelatine oplossing ten minste één dag voor het experiment. <ol><li> Onder de motorkap, voeg 500 ul gentamycine [10 mg / ml] om een fles van 500 ml met CO2 onafhankelijk medium (CO2 -i). </li><li> In een apart bekerglas, voeg 20 ml CO2-I (uit stap 1.1.1) en verwarmen bij 95 ° C op een verwarmingsblok met constant roeren gedurende 15 min. Observeer een kleurverandering naar geel, wat aangeeft dat de oplossing is klaar voor verder gebruik. </li><li> Weeg 4 g gelatine en geleidelijk arm naar boven bereide oplossing (stap 1.1.2) bij verhoogde roeren en verwarmen bij 95 ° C gedurende 45 min, om een gele kleur oplossing te verkrijgen. Laat de gelatine oplossing afkoelen onderde kap ongeveer 5 minuten. </li><li> Giet 4 ml van de gelatine-oplossing in een 35 mm cultuur diameter gerechten zonder dat er luchtbellen. Houd de schotel bij 21 ° C gedurende 30 min. Bedek de borden met plastic folie en zet de gerechten zijn kop. Eventueel slaan gerechten bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden voor gebruik. </li></ol></li><li> Bereid een 4% gelatine oplossing. <ol><li> Onder de kap 25 ml CO2 -i medium in een steriele plastic container, en warmte bij 42 ° C op een verwarmingsblok. Verwijder het medium uit het verwarmingsblok en geleidelijk aan 1 g gelatine aan het warme medium en roer. Snel naar de container op de verwarming blok (42 ° C) en warm te houden tijdens het proces. </li></ol></li><li> Opzetten van de vibratome apparaat: <ol><li> Verwijder de vaat met 20% gelatine-oplossing bewaard bij 4 ° C. Snijd de gelatine met een scalpel. Flip de gelatine slice en plak het op de zwarte steun schijf van de vibratome behulp van een druppel super lijm. </li><li> Breek een scheermesje in twee helften, en steek de ene helft in de vibratome houden bakje. Plaats de zwarte steun schijf op de vibratome apparaat. Zet de zwarte knop aan de rechterkant. Fix de holding bakje op de kop van de vibratome. Voeg een voldoende hoeveelheid CO 2 -i medium in de vibratome tank naar de gelatine blok te dekken. </li><li> Schakel de vibratome en snijd drie 100 micrometer plakjes gelatine blok. Houd de gelatine blok voor verder gebruik. </li></ol></li><li> Bereid 40 ml kweekmedium: <ol><li> Bereid Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS) onder de motorkap. Bereid 1 mg / ml Poly-D-lysine met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) pH 7,4. </li><li> In een 96-well plaat, voeg 2 ug / cm 2 van Poly-D-Lysine het bekleden van de bodem van de putjes. Incubeer de plaat gedurende 45 min bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Na incubatie verwijderd en vervangen door PBS 200 ui/ Goed DMEM en plaats opnieuw bij 37 ° C in 5% CO2 incubator voor gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Dissectie van Gehele Retina <ol><li> Ophelderen van de muis: <ol><li> Offeren de muis volgens de Europese richtlijn 2010/63: door cervicale dislocatie. Snijd de kop met gebogen-schaar en plaats het in een diameter van 100 mm petrischaal na het oog te hebben ontsmet met een ontsmettingsmiddel. </li><li> Verwijder het oog na de oogzenuw te hebben losgemaakt door het snijden het heel voorzichtig met een gebogen greep. Plaats vervolgens beide ogen in een 35 mm petrischaal met steriele CO 2 -i medium bij 21 ° C. </li></ol></li><li> Het verwijderen van het netvlies: <ol><li> Maak een gat ter hoogte van het oog ledemaat met behulp van een 18 G naald kunnen de schaar introduceren in de oogbol. Breng rechte schaar in het gat en knip de sclera onder de iris op de omtrek van de oogbol te ciliaire lichaam. </li><li&gt; Verwijder het hoornvlies en de lens en houd de achterste kamer van het oog met het netvlies aangrenzend aan de sclera. Met twee fijne grepen, verwijder het glasvocht zich in de achterste kamer zonder beschadiging van het netvlies. Voeren vier radiale bezuinigingen (retina / sclera) naar afvlakking van het netvlies te staan. </li><li> Opleving van de oogbol en pel het als een &quot;oranje&quot;. Los van het netvlies van de sclera en retinale pigmentepitheel (RPE). Maak de retina nog bevestigd ter hoogte van de optische zenuw voorzichtig met fijne gebogen schaar. </li><li> Maak de resterende glasvocht van de omtrek naar het midden van het netvlies met twee fijne handgrepen. Zorg ervoor dat al het glasvocht volledig is verwijderd om de afvlakking van het netvlies staan. </li><li> Snijd het uiteinde van een plastic pipet en breng de retina een 35 mm petrischaal met CO 2 -i product met de plastic pipet. </li></ol></li></ol> 3. Afdichting van Flat-Mounted Retina op Gelatine Block <ol><li> Verwijder 20 - 30 ml van de CO 2 -i medium uit de vibratome tank (de gelatine blok is gratis) om de afdichting van platte-gemonteerde netvlies mogelijk te maken. </li><li> Transfer het netvlies naar een glasplaatje met behulp van een plastic pipet en een daling van de CO voeg 2 -i medium alvorens naar de gelatine slice met de fotoreceptoren naar beneden op de gelatine slice. </li><li> Bevestig het netvlies aan de gelatine blok door voorzichtig injecteren verwarmd 4% gelatine aan één zijde van het blok tussen de retina en de gelatine blok gelijktijdig uitstoten warme gelatine aan de andere kant. </li><li> Zuig 4% gelatine met een pasteur pipet. Wacht 10 minuten aan totale afdichten. Voeg CO 2 -i medium om de blok en het mes volledig onder te dompelen. </li></ol> 4. Snijden de Retina OPMERKING: Deze stap is essentieel voor een laag fotoreceptorcellen verkrijgen zonder de andere retinale cellen (Figuur 1). <ol><li> Vanaf de top van de gelatine blok, gesneden 100 pm seriecoupes het netvlies. Snijd vervolgens 100-120 urn van de binnenlaag. Afhankelijk van de toepassing kan deze laag worden weggegooid of opgeslagen in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat de snelheid van de vibratome is erg traag (1 of 2) tijdens het snijden van de binnenste laag of fotoreceptoren lagen. </li><li> Voer intermediair 15 urn van de retina overeenkomt met de interface tussen de binnenste en de buitenste retina. Observeer deze sectie onder een microscoop. De afwezigheid van bloedvaten blijkt dat de buitenste retina bereikt. </li><li> Snij 200 urn van de buitenste retina (de fotoreceptor laag) met gelatine en overbrengen naar een 35 mm schaal diameter gevuld met 3 ml van CO 2 -i medium. Houd het op ijs tot alle fotoreceptor laag secties van alle netvliezen worden verkregen. </li></ol> 5. Dissociatie lichtgevoelige cellen <ol><li> Neem de schotel (es) die de fotoreceptor laag (lagen) en zet het (ze) in een incubator bij 37 ° C gedurende 10 min. </li><li> Behulp van een tang voorzichtig scheiden de fotoreceptor laag van de gelatine en breng deze in een nieuwe schaal gevuld met 3 ml oplossing van Ringer. Herhaal deze stap (5.2) voor elke lichtgevoelige laag voorbereiding. </li><li> Incubeer 2 eenheden van papaïne met 25 ul activator-oplossing (1,1 mM EDTA, 5,5 mM L-cysteïne, 60 uM β-mercaptoethanol) in een 5 ml polypropyleen steriele buis en incubeer het 30 minuten bij 37 ° C in 5% CO2 incubator . De activering van papaïne wordt bereikt bij 37 ° C. Tijdens deze incubatie, snijd de lichtgevoelige laag in 2 mm 2 stuks (niet te klein) en breng deze stukjes in een 5 ml buizen. </li><li> Tweemaal Spoel het netvlies 1,5 ml oplossing van Ringer-oplossing, gevolgd door zwaartekracht sedimentatie. Verwijder alle resterende Ringer-oplossing uit de buis met het monster. </li><li> Voeg 475 ul van Ringer-oplossing voor de buis met geactiveerde papaïne en mix. Voeg deze oplossing aan de buis met het netvlies. </li><li> Incubeer de buis met het netvlies gedurende 20 min bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Stop de reactie door toevoeging van 1 ml 10% FCS in DMEM. Voeg 25 U van desoxyribonuclease I (DNAse I) gedigereerd DNA uit cellen dood. Homogeniseer de celsuspensie voorzichtig met een 1 ml-pipet. Spin bij 50 xg gedurende 6 min bij RT. </li><li> Verwijder het supernatant om sporen van het serum te verwijderen en voeg DMEM medium met supplementen (zie tabel van specifieke reagents_equipment) naar de cel-pellet en resuspendeer voorzichtig de celsuspensie met een pipet 1 ml. Spin bij 50 xg gedurende 6 min bij RT. Herhaal deze stap (5.7) eens te meer. </li></ol> 6 Het kweken lichtgevoelige cellen <ol><li> De fotoreceptor laag van een muis PN8 bevat ongeveer 1-1500000 cellen met deze techniek. Zaad van de lichtgevoelige cellen in 1x 10 5 cellen / cm2 in een kweekplaat met kweekmedium en kweek van de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Op dag 5, overgaan tot immunochemie en western blotting studie volgt die door de leveranciers het antilichaam. OPMERKING: Stappen om de cultuur te stoppen en de voorafgaande proeven worden beschreven in referentie 21. </li></ol>

<ol><li>The Organization of the Retina and Visual System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Webvision%22">Webvision</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (2014).</li>
<li>Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).</li>
<li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+transplants+increase+host+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+%28rd%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse.</a> Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).</li>
<li>Daiger, S., Sullivan, L., Bowne, S. RetNet, the Retinal Information Network. , The University of Texas Health Science Center. Houston, TX. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet">https://sph.uth.edu/retnet</a> (2014).</li>
<li>Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+transplantation+of+rods+delays+cone+loss+in+a+retinitis+pigmentosa+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model.</a> Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+photoreceptor+and+total+neural+retina+preserves+cone+function+in+P23H+rhodopsin+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat.</a> PLoS One. 5 (10), (2010).</li>
<li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+retina+releases+a+diffusible+factor+stimulating+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).</li>
<li>Fintz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+of+retina-derived+cone+neuroprotection+in+two+culture+models+of+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).</li>
<li>Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degenerations%3A+from+cell+signaling+to+cell+therapy%3B+pre-clinical+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues.</a> Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).</li>
<li>Wright, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+searchlight+through+the+fog%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A searchlight through the fog.</a> Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).</li>
<li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).</li>
<li>Lillig, C. H., Holmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+and+related+molecules--from+biology+to+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).</li>
<li>Fridlich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thioredoxin-like+protein+rod-derived+cone+viability+factor+%28RdCVFL%29+interacts+with+TAU+and+inhibits+its+phosphorylation+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cone+rescue+by+RdCVF+protein+in+a+dominant+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa.</a> Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).</li>
<li>Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+delivery+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor.</a> Retina. 25 (8 Suppl), S47(2005).</li>
<li>Komaromy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+photoreceptor+deconstruction+by+CNTF+enhances+rAAV-mediated+cone+functional+rescue+in+late+stage+CNGB3-achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia.</a> Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).</li>
<li>Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).</li>
<li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disruption+of+the+rod-derived+cone+viability+gene+leads+to+photoreceptor+dysfunction+and+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).</li>
<li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases%3A+from+clinic+to+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16(2010).</li>
<li>Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+ganglioside+composition+of+photoreceptors+during+postnatal+maturation+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina.</a> Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).</li>
<li>Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+purified+rat+photoreceptors+in+vitro+is+stimulated+directly+by+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2.</a> J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeobox+gene+CHX10%2FVSX2+regulates+RdCVF+promoter+activity+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina.</a> Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).</li>
<li>Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+photoreceptor+circadian+oscillator+strongly+relies+on+lighting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions.</a> Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).</li>
<li>Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+developing+postnatal+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).</li>
<li>Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+facilitates+quantitative+analysis+of+wild-type+and+Nrl%28-%2F-%29+retinal+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes.</a> Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).</li>
<li>Delyfer, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+surgical+specimens+using+jouRNAI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Ying, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CAT+reporter+construct+containing+277bp+GNAT2+promoter+and+214bp+IRBP+enhancer+is+specifically+expressed+by+cone+photoreceptor+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice.</a> Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het netvlies is een model orgaan biologie. Studie van het netvlies heeft geleid tot 6 grote ontdekkingen in de biologie. Het ligt aan de oorsprong van de eerste tumor suppressor gen RB1. Het onthult de moleculaire verbinding tussen de receptor tyrosine kinases en de MAP kinases door de interactie met de Zoon van sevenless. Hij was betrokken bij de ontdekking van PAX6, de eerste master control gen voor orgel morfogenese. Het is in het centrum van de genetische associatie van complement factor H (CFH) met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de eerste ziektegevoeligheid gen geïdentificeerd door genoomwijde associatie scherm (GWAS). Tenslotte leidde tot de eerste succesvolle gentherapie voor Leber congenitale amaurosis, de eerste corrigerende gentherapie studie bij menselijke van een erfelijke ziekte. De structuur van dit orgaan is geconserveerd in de meeste gewervelde dieren. De toegankelijkheid voor manipulatie in vivo heeft begin aangemoedigd op functional genomics onderzoek op deze integraal onderdeel van het central zenuwstelsel. We laten hier zien hoe de fotoreceptor laag te scheiden van de binnenlaag van het netvlies vibratome snijden. Deze stap is essentieel voor pure fotoreceptor kweken verkrijgen. Onze dissectie protocol maakt de besmetting door RPE cellen zeer onwaarschijnlijk. Eén van de belangrijkste uitdagingen is de afvlakking van de retina die nodig is om punt juist de binnenste en de buitenste retina. Het snijden van het netvlies is beste op netvlies met kleine diameter als die van knaagdieren en deze diameter is een beperking van de techniek huidige beschikbare materiaal. Het is raadzaam voordat een biologisch betekenisvol experiment te oefenen op een monster van het netvlies. We illustreren de wijze representatieve resultaten verkregen uit gekweekte fotoreceptorcellen, waarin het materiaal gebruikt om expressie studie van zowel mRNA en proteïnes. Expressie studies kunnen ook worden uitgevoerd op sections verkregen door lasermicrodissectie, maar de culturen zijn het best uitgevoerd met behulp van vibratome snijden. We konden gebruiken de techniek van microdissection laser met een compleet andere strategie. Maar om de fotoreceptor laag met de microdissectie inrichting voor cultuur verzamelen, zou moeten worden fixeermiddel vermijden en zou de huidige methode aanzienlijk compliceren. We zijn het ontwikkelen van een protocol gericht op het bestuderen van de kinetiek van gen- en eiwitexpressie in vibratoomcoupes tijdens de degeneratie van fotoreceptoren in modellen van retinitis pigmentosa. Wij geloven dat de gedetailleerde beschrijving van het protocol bruikbaar voor onderzoekers op het gebied van retinale biologie zal zijn en in het bijzonder voor proteomics en metabolomics studies.

Het netvlies is een integraal onderdeel van het centrale zenuwstelsel die een geconserveerde architectuur bij vertebraten heeft. De neuronen van de neurale retina zijn georganiseerd in lagen, met de verst van het invallende licht, de fotoreceptor laag in nauw contact met het retinale pigmentepitheel (RPE) achter in het oog. Staafjes en kegeltjes photorecptors zijn lichtgevoelige cellen die afhankelijk zijn van opsin gevoelige moleculen voor foton capture. Deze moleculen zijn ingesloten op schijf membranen van een cellulaire structuur, op het buitenste segment van de fotoreceptor die wijst in de richting van de RPE 1. Deze structuur, die meestal heel vroeg in gevallen van fotoreceptor degeneraties wordt beïnvloed, wordt vernieuwd tegen het tarief van 10% per dag. De zogenaamde binnenlaag bevat de meeste andere neuronen die het ontvangen van de fotoreceptoren, bipolaire, amacrine en horizontale cellen alsmede de ganglioncellen signaal berekenen. Deze laatste met hun axonenvormen een balk die de oogzenuw. Deze gelaagdheid is zo geconserveerd dat biologen hebben gebruikt de term verplaatste amacrine cellen wanneer de cellen worden gevonden buiten de binnenste plexiform laag 2. Lagen van neuronen verdeeld in een armatuur radiale Müller gliacellen. Bipolaire cellen koppelen fotoreceptoren naar ganglioncellen. Ze liggen tussen de externe plexiform laag en de binnenste plexiform laag. De ganglioncellen vormen de binnenste plexiform laag in verband met de bipolaire cellen. De amacrin cellen worden genoemd als vereniging cellen in het binnenste plexiform laag tussen de bipolaire cellen en ganglioncellen. De buitenste plexiform laag bevat horizontale cellen. Deze unieke opstelling van neuronale lagen van het centrale zenuwstelsel maakt de isolatie van de fotoreceptor laag van de binnenste cellaag van het doorsnijden van de platte gemonteerd netvlies met een vibratome. Oorspronkelijk werd deze techniek gebruikt om fotoreceptoren voor tran isolerensplantation in het oog van de RD1 muis, een model van menselijke retinitis pigmentosa (RP) 3. De RD1 muis draagt ​​een recessieve mutatie in het PDE6B gen dat codeert voor de staaf-specifieke fosfodiësterase beta-subeenheid. Recessieve mutaties van dit gen resultaat in RP bij de mens 4. Na staaf fotoreceptoren gedegenereerd, verliest de patiënt nachtzicht, en verrassend kegel fotoreceptoren, die niet uitdrukken het gemuteerde gen, ontaarden in een tweede fase. Doordat de kegels zijn vereist voor kleurenzien en gezichtsscherpte, patiënten progressief blind en een effectieve behandeling voor de ziekte is nog niet ontwikkeld. Door enten fotoreceptor laag van een wildtype muis van de conus degeneratie van de ontvangende muis vertraagd 3,5. De staven verloren in de staaf-kegel degeneratieve model kon niet worden vervangen door een transplantatie omdat de synaptische verbinding tussen staven en bipolaire cellen alleen kan worden bereikt in een specifiek stadium van retinal ontwikkeling, gekenmerkt door het begin van Nrl expressie 6. De laag fotoreceptoren wordt geïntroduceerd door chirurgie in de sub- retinale ruimte van de staafvormige minder RD1 netvlies, tussen de RPE en de buitenste retina overeenkomt met slechts 3% van de resterende fotoreceptoren, de kegels. Twee weken na de operatie, 40% van de kegels van het dier getransplanteerd met een normale fotoreceptor laag overleefde in vergelijking met de dieren getransplanteerd met een normale laag binnenste retinale cellen of de schijn-geopereerde dieren. De topografie van kegel overleving, uitgespreide over het gehele oppervlak van de gemuteerde netvlies zich ter plaatse van het geënte weefsel geeft aan dat het beschermende effect door een diffundeerbare molecule 7. Vervolgens gebruikten we een co-kweeksysteem en geconditioneerde kweekmedia op het feit dat de beschermende werking berust op de uitscheiding van een eiwit door stangen 8,9 valideren. Onze hypothese is dat dit eiwit wordt exprgineel continu bepaald van staven en dat de dood tijdens de eerste fase van de ziekte secundaire cone degeneratie veroorzaken door het verlies van een beschermende signaal van staven in een niet-cel autonoom 10. Vanwege het belang van de kegel gemedieerde centrale visie in primaten deze vermeende eiwit zal een zeer relevant therapeutisch hulpmiddel voor RP zijn. Het behoud van de kegels in RP zou in theorie voorkomen dat een totaal van 1,5 miljoen patiënten wereldwijd te blind 11 geworden. We hebben een hoog gehalte screening aanpak en een kegel-verrijkte cultuur-model gebruikt om een cDNA dat codeert voor Rod-afgeleide Cone Viability Factor (RdCVF) van een retinale cDNA-bank 12 te identificeren. RdCVF is het gesplitste product van de NXNL1 gen dat, interessant homoloog is aan het gen voor thioredoxine eiwitten betrokken bij redox homeostase 13. Het tweede gesplitste product van het gen, RdCVFL is een enzym dat het doelwit, het tau-eiwit tegen oxidatieve d beschermtAmage 14. Toediening van RdCVF voorkomt dat de secundaire degeneratie van kegels en het verlies van hun visuele functie in een recessief en dominant model van RP 12,15. Dit toont twee belangrijke aspecten van deze vernieuwende therapeutische strategie 16. Ten eerste kan het in de meeste gevallen RP worden toegepast in een gen-onafhankelijke wijze. Ten tweede wordt in tegenstelling tot de concurrerende factor CNTF, RdCVF survival in verband met het behoud van de visuele functie 17. De afwezigheid van functioneel effect kan wegens het ontbreken van klinische voordeel van de toediening van CNTF RP 18 patiënten verklaren. RdCVF is waarschijnlijk een van de belangrijkste overlevingssignaal van staafjes en kegeltjes sinds kegel redding in vitro wordt geremd door RdCVF immunodepletie 12. Bovendien, de verstoring van de stang afgeleide levensvatbaarheid conus gen leidt tot disfunctie en gevoeligheid fotogeleider oxidatieve stress 19. Het gebruik vanfotoreceptor laag is aan de oorsprong van de identificatie van RdCVF en van een roman redox signaal betrokken bij neurodegeneratieve ziekten 20. Dit manuscript beschrijft het protocol voor de isolatie en kweek cellen van de fotoreceptor laag om de activiteit van RdCVF karakteriseren. De fotoreceptoren kunnen in kweek worden gehandhaafd gedurende 5 tot 7 dagen 21. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de expressie van specifieke genen te bestuderen fotoreceptor.

<table><tbody><tr><td>Cytidine 5&prime;-difosfocholine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td>4.7 &micro;M Cytidine 5&prime;-difosfocholine</td></tr><tr><td>Cytidine 5&prime;-difosfoethanolamine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0456</td><td>2.7 &micro;M Cytidine 5&prime;-difosfoethanolamine</td></tr><tr><td>Linolzuur&iuml;c acid/ bovine serum albumine (BSA)*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td>100 &micro;g/ml linolzuur&iuml;c acid/ bovine serum albumine (BSA)</td></tr><tr><td>Trijodo-L-thyronine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.03 &micro;M Trijodo-L-thyronine</td></tr><tr><td>96-well platen</td><td>Greiner bio-one</td><td>655-095</td><td></td></tr><tr><td>Binoculaire microscoop</td><td>Leica</td><td>MZ-75</td><td></td></tr><tr><td>CO2 onafhankelijk (CO2-i)</td><td>Life Technologies</td><td>18045054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Forceps nr. 5 Dumont</td><td>Bionic</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine van varkenshuid type A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>U74v2</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin oplossing</td><td>Life Technologies</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>0.55 &micro;M hydrocortison</td></tr><tr><td>Insulin* (I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.86 &micro;M insulin (I)</td></tr><tr><td>Papaine</td><td>Worthington-biochem</td><td>WOLS03124</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556&nbsp;</td><td>2.0 &micro;M progesteron</td></tr><tr><td>Prostaglandine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5172</td><td>0.28 &micro;M prostaglandine</td></tr><tr><td>Putrescine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>182 &micro;M putrescine</td></tr><tr><td>Scalpel Albion</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Moria</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>Natriumseleniet* (S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.29 &micro;M Na2SeO3&nbsp;&nbsp; (S)</td></tr><tr><td>Tauriene*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>3 mM tauriene</td></tr><tr><td>Transferrine* (T)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.07 &micro;M transferrine (T)</td></tr><tr><td>Vibratome apparaat</td><td>Leica</td><td>VT1000-S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Supplementen</td></tr></tbody></table>

vibratome sectioning mouse retina te fotoreceptor culturen bereid

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Het netvlies is een deel van het centrale zenuwstelsel die organiseert architectuur met neuronen in lagen van de fotoreceptoren, zowel staafjes en kegeltjes in contact met het retinale pigmentepitheel in het verste gedeelte van het netvlies gezien richting licht, en de ganglion cellen in de meest proximale afstand. Deze architectuur maakt het isolement van de fotoreceptor laag door vibratome snijden. De ontlede neurale retina van een muis 8 dagen oud plat ingebed in 4% gelatine op een plak van 20% gelatine fotoreceptor laag naar beneden. Met behulp van een vibratome en een tweesnijdend scheermesje, wordt de 100 micrometer dikke innerlijke netvlies coupes. Dit deel bevat de ganglioncellen en de binnenste laag met name de bipolaire cellen. Een intermediaire sectie van 15 urn wordt verwijderd vóór 200 urn van de buitenste retina bevat de fotoreceptoren gewonnen. De gelatine wordt verwijderd door verwarming bij 37 ° C. Stukken van buitenste laag zijn incubated in 500 pi van Ringer&#39;s oplossing met 2 eenheden geactiveerde papaïne gedurende 20 min bij 37 ° C. De reactie wordt gestopt door toevoeging van 500 pi 10% foetaal kalfsserum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), vervolgens 25 eenheden DNAse I vóór centrifugatie meerdere malen toegevoegd bij kamertemperatuur, gewassen met serum te verwijderen en de cellen worden geresuspendeerd in 500 ul DMEM en geënt bij 1 x 10 5 cellen / cm2. De cellen worden gekweekt tot 5 dagen in vitro en hun levensvatbaarheid gescoord met behulp van live / dead assay. De zuiverheid van de kweek wordt eerst bepaald door microscopische waarneming tijdens het experiment. De zuiverheid wordt vervolgens gevalideerd door zaaien en de vaststelling van cellen op een histologische glijbaan en analyseren met behulp van een konijn polyklonale anti-SAG, een foto-marker en muis monoklonaal anti-Rho, een staaf fotoreceptor specifieke marker. Alternatief kan de fotoreceptor laag (97% staafjes) worden gebruikt voor gen- of eiwitexpressie analyse en voor transplantatie.

Naast transplantatie werden de fotoreceptor lagen ook gebruikt om cell signaling bestuderen door zaaien cellen voor het maken fotogeleider kweken 12,22. Bovendien worden ze gebruikt om genexpressie en circadiane ritme 23,24 bestuderen. We hebben de cel fotoreceptor laag uit een wildtype muis gebruikt postnatale dag 8 fotoreceptor kweken in afwezigheid van FCS bereiden en onderhouden de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in een incubator met 5% CO2 (Figuur 1E ). De cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% paraformadehyde en vervolgens voortgegaan immunocytochemische analyse met die door het antilichaam leveranciers hetzij muizen monoklonaal anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) of konijn polyklonaal anti-SAG (1: 200, een royale gave van Igal Gery en David Hicks). We gebruikten anti-RHO en anti-SAG (hoewel thixotropiebevorderende label kegeltjes en staafjes) vanwege het feit dat anti-SAG een eerdere merker, dan anti-RHO. Het aandeel van CELls positief voor het anti-RHO antilichaam lager dan die positief voor anti-SAG-antilichamen (Figuur 2). Dit kan worden verklaard door het feit dat SAG, de stang arrestin wordt ook uitgedrukt door kegels die 3% van fotoreceptoren maken de geïsoleerde laag, of alternatief door het feit dat tijdens postnatale maturatie van de retina, de expressie van SAG dat voorafgaat Rho 25,26. De fotoreceptor laag werd ook gebruikt om de expressie van genen controleren aan fotoreceptoren van het wildtype retina en de hersenen van dieren 35 dagen RNA werden bereid middels CsCl ultracentrifugatie 27 en gehybridiseerd met muis DNA chip Array jaar. De boodschappers voor rhodopsine (Rho), S-arrestin (Sag) en kegel-transducine (Gnat2) worden specifiek in de retina uitgedrukt ten opzichte van de hersenen (Figuur 3A). De uitdrukking is prominent aanwezig in de fotoreceptor laag (PR) dan in de hele netvlies, die omvatde binnenste retinale laag blijkt dat deze genen inderdaad door fotoreceptoren worden uitgedrukt. Voor Gnat2, de relatieve expressie ten opzichte van Rho en Sag blijkt dat wordt uitgedrukt door kegels opgenomen in het geïsoleerde fotoreceptor laag. De expressie van recoverin (Rcvrn) in de fotoreceptor laag in vergelijking met de gehele retina wordt verhoogd (Figuur 3B). De fotoreceptor laag werd ook gebruikt om de expressie van RHO en GNAT2 met Western blotting na die door de leveranciers antilichaam monitoren en te vergelijken met de binnenste retinale laag (figuur 4). Let op de afwezigheid van RHO en GNAT2 28, de markers van de staafjes en kegeltjes in respectievelijk het hele netvlies en in het netvlies van RD1 muis op postnatale dag 35. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van de vibratome snijden van muis netvlies. (A) Installatie van de flat-gemonteerde netvlies met de fotoreceptor naar beneden op de gelatine slice. (B) Sectie van de binnenste netvlies met de vibratome mes. (C) Sectie van de buitenste retina toegevoegde gelatine. (D) Controle van de aanwezigheid van fotoreceptor aan de rand van het fragment van netvlies na de isolatie van fotoreceptor laag. Schaalbalk gebruikt voor groene fluorescentie wordt gebruikt van een wit licht microscoop. De fotoreceptoren zijn in de rand van het beeld. (E) Gekweekte fotoreceptorcellen (na vijf dagen). (F) Hogere vergroting paneel E. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550" /> Figuur 2. Differentiële expressie van RHO en SAG in de muis fotoreceptoren cultuur. (A) Kleuring van kernen (blauw), (B) SAG kleuring (groen), (C) RHO kleuring (rood). (D) Samengevoegd afbeelding. Omdat kleuring van SAG eerder dan RHO kleuring wordt uitgedrukt, worden slechts twee cellen dubbel gelabeld SAG en RHO (zie *). Schaalbalk:. 23 micrometer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Vergelijking van de expressie van drie genen in de hersenen en het gehele netvlies en fotoreceptoren van het wildtype dieren vijfendertig dagen oud. (A) Rhodopsin (Rho), S-arrestine (Sag) en kegel-transducine (Gnat2). (B) Calbindin (Calb1) en Recoverin (Rcvrn). De gegevens worden weergegeven als relatieve expressie. De relatieve expressie is een expressie waardeverkregen van microarray data na normaliszation met de software Robuuste multi-array-Average (RMA) beschikbaar in de kennisdatabase KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400" /> Figuur 4. Expressie van RHO en GNAT2 in de buitenste retina van een wild-type netvlies aan postnatale dag 35. Afwezigheid van hun expressie in de binnenste netvlies en in het netvlies van het RD1 muis op postnatale dag 35. ACTB, beta actine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <!-- Repeat of the materials table
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Naam van het product / Apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td>Opmerkingen / Omschrijving </td></tr><tr><td> Cytidine-5&#39;diphosphocholin * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0256 </td><td> 4.7 uM Cytidine 5&#39;-diphosphocholin </td></tr><tr><td> Cytidine-5&#39;diphosphoethanolamine * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0456 </td><td> 2.7 uM Cytidine 5&#39;-diphosphoethanolamine </td></tr><tr><td> Linolzuur / bovine serum albumine (BSA) * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8384 </td><td> 100 ug / ml linolzuur / bovine serum albumine (BSA) </td></tr><tr><td> Trijood-L-thyronine * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6397 </td><td> 0,03 uM trijood-L-thyronine </td></tr><tr><td> 96-wells plaat </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655-095 </td><td></td></tr><tr><td> Binoculaire microscoop </td><td> Leica </td><td> MZ-75 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 onafhankelijke (CO 2- i) </td><td> Leven Technologies </td><td> 18045054 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 41966029 </td><td></td></tr><tr><td> Tang n ° 5 Dumont </td><td> Bionic </td><td> 11.254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine van het type varkensbedrijf huid A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td></td></tr><tr><td> GeneChip </td><td> Affymetrix </td><td> U74v2 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin oplossing </td><td> Life Technologies </td><td> 15710049 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 0,55 uM hydrocortison </td></tr><tr><td> Insuline * (I) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.86 uM insuline (I) </td></tr><tr><td> Papaïne </td><td> Worthington-biochem </td><td> WOLS03124 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td>P-6407 </td><td></td></tr><tr><td> Progesteron * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7556 </td><td> 2,0 uM progesteron </td></tr><tr><td> Prostaglandine * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5172 </td><td> 0,28 uM prostaglandine </td></tr><tr><td> Putrescine * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5780 </td><td> 182 uM putrescine </td></tr><tr><td> Scalpel Albion </td><td> EMS </td><td> 72000 </td><td></td></tr><tr><td> Scissor </td><td> Moria </td><td> 15.396-00 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8636 </td><td> 1 mM natriumpyruvaat </td></tr><tr><td> Natriumseleniet * (S) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.29 uM Na 2 SeO 3 (S) </td></tr><tr><td> Taurine * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8691 </td><td> 3 mM taurine </td></tr><tr><td&gt; Transferrine * (T) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0,07 uM transferrine (T) </td></tr><tr><td> Vibratome apparaten </td><td> Leica </td><td> VT1000-S </td><td></td></tr><tr><td> * Supplementen </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1: Specifiek materiaal en apparatuur is gebruikt. -&gt;

Neurale retina van een muis 8 dagen oud is op een 4% gelatine blok. Na isolatie van de fotoreceptor laag (200 pm) door vibratome, zijn de fotoreceptoren gezaaid na mechanische en enzymatische dissociatie voor cultuur. De fotoreceptor laag kan worden gebruikt voor moleculaire, biochemische analyses of transplantatie.

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Het algemene doel van deze procedure is om de fotoreceptorlaag van de muis te isoleren. Voor het kweken is de eerste stap het verkrijgen van een volledig platte retina en het verzegelen ervan op een gelatineblok. Vervolgens worden de retinale lagen succesvol gesneden om de fotoreceptorlaag te isoleren.De laatste stap is het zaaien van gezuiverde fotoreceptorcellen in cultuur. Uiteindelijk wordt de zuiverheid van de fotoreceptorlaag bevestigd door microscopie en immunofluorescentie, gevolgd door toetsing van het staafcel-afgeleide kegellevensvatbaarheidsfactor. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals laser micro dissectie, is om de fotoreceptorlaag met vertrouwen te isoleren.De implicaties van deze technologie reiken tot therapie van erfelijke retinale degeneratie. Omdat het erg handig is om de biologie van fotoreceptoren te bestuderen, hadden we deze methode oorspronkelijk ontwikkeld om de cellulaire interactie tussen staaf- en koude fotoreceptoren te bestuderen. De transplantatie van de fotoreceptorlaag in het oog van de vroege een mar leidde tot de identificatie van alle afgeleide kegellevensvatbaarheidsfactoren.Visuele demonstratie van deze methoden is cruciaal, aangezien de mogelijkheid van een platte bergretina moeilijk uit te voeren is omdat het lastig is. Voordat u de retina isoleert, bereidt u de vibrato voor. Begin met schalen van 20% gelatine-oplossing die bij vier graden Celsius uit de opslag is gehaald.Snijd de gelatine met een scalpel, draai de gelatinesnede om en plak deze met een druppel superlijm op de zwarte steunschijf van de vibrator. Breek vervolgens een scheermes in twee helften en steek de ene helft in de vibrator. Plaats vervolgens de zwarte steunschijf op het vibratorapparaat en draai de zwarte knop naar rechts.Vestig nu het houdervatje aan het hoofd van de vibrato en bedek de gelatineblok met CO2-onafhankelijk medium. Zet de vibrato aan om de setup te testen. Snijd drie 100 micron-sneden totdat de snede soepel is en vlakke sneden worden geproduceerd.Na het oogsten van de ogen van een muis en andere voorbereidingen, isoleer de retina. Gebruik eerst een naald van 18 gauge om een gat te maken ter hoogte van de ooglim. Vervolgens om het ciliair lichaam te verwijderen, steekt u rechte scharen door het gat en in de oogbol en snijdt u voorzichtig de sclera onder het iris en vervolgens langs de omtrek van de oogbol.Houd vervolgens het achterste deel van het oog met de retina aan de sclera aangrenzend en verwijder het hoornvlies en de lens. Verwijder met twee fijne grijpers het glasvocht, dat aan de retina is gehecht zonder de retina te beschadigen, zodat de retina plat kan worden gelegd. Maak er vier radiale sneden in.Keer nu het oogbol om en schil het als een sinaasappel. Vervolgens, heel voorzichtig met fijne rechte scharen. Los de retina los van de sclera en het retinale pigmentepitheel.Het zou op het niveau van de oogzenuw moeten blijven plakken met behulp van fijne grijpers, los het resterende glasvocht los, beginnend aan de periferie en bewegend naar het midden van de retina. Met alle glasvocht volledig verwijderd, zal de retina vlak worden. Breng nu de retina over in een 35 millimeter diameter Petri-schaal.Het proces van het verzegelen van de platte retina in de gelatineblok is delicaat en fundamenteel het meest uitdagende aspect voor het snijden van het weefsel. Verwijder eerst 20 tot 30 milliliter medium uit de vibramtank. Ten tweede, breng de retina over naar een glazen plaatje met behulp van een plastic brede buispijp en breng een druppel CO2-onafhankelijk medium aan op de plaat.Ten derde, breng de retina over naar een gelatinesnede met een fotoreceptor naar beneden. Ten vierde, bevestig de retina aan de gelatineblok. Injecteer voorzichtig warm 4% gelatine aan één kant van de blok tussen de retina en de gelatineblok en verplaats gelatine naar de andere kant.Ten slotte, zuigt u de gelatine op met een glazen pijp en wacht zeven tot 10 minuten terwijl de retina in de blok wordt geseald. Voeg nu CO2-onafhankelijk medium toe aan de tank en dompel de blok en het mes onder voor het snijden, beginnend vanaf de bovenkant van de gelatineblok. Snijd 100 micron seriële secties totdat het mes de retina bereikt.Gebruik vervolgens een zeer lage snelheid, zoals één of twee, om 100 tot 120 micron secties van de binnenste laag van de retina te snijden. Afhankelijk van de toepassing, kan deze laag worden weggegooid of opgeslagen in vloeibare stikstof, waarbij de snelheid langzaam wordt gehouden op het grensvlak tussen de binnenste en buitenste laag. Neem 15 micron secties.Bekijk deze secties onder een microscoop op de aanwezigheid van bloedvaten. Wanneer er geen zijn, is de buitenste retina bereikt door de buitenste laag. Snijd langzaam 200 micron secties.Breng deze plakken over naar een 35 millimeter schaal met drie milliliter koude, CO2-onafhankelijke medium die op ijs wordt bewaard. Ga verder met het verzamelen van alle fotoreceptorlaagsecties van alle retina's die moeten worden gesneden naar deze schaal. Begin met het overbrengen van de gesneden fotoreceptoren naar een 37 graden Celsius incubator voor 10 minuten.Gebruik vervolgens een pincet om elke fotoreceptorlaag voorzichtig te scheiden van de gelatine en breng ze over naar een nieuwe schaal gevuld met drie milliliter ringeroplossing op kamertemperatuur. Zodra alle fotoreceptoren uit de gelatine zijn geïsoleerd, combineer twee eenheden papaïne met 25 microliters activaatoroplossing in een steriele vijf milliliter polypropyleenbuis en incubeer gedurende 30 minuten. Om de papaïne tijdens deze incubatie te activeren, snijdt u de fotoreceptorlaagsneden in stukken van twee millimeter vierkant en niet veel kleiner.Breng deze stukken over naar een vijf milliliterbuis met 1,5 milliliter ringeroplossing. Zuig vervolgens de ringen op en vervang deze voor een tweede wasbeurt. Wacht tot alle plakken door zwaartekracht, sedimentatie, zijn bezonken en

vibratome-sectioning-mouse-retina-to-prepare-photoreceptor-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een kosteneffectieve techniek voor organotypische cultuur van volwassen varkens netvlies gedurende zeven dagen. In het kort werd een steriel filtreerpapier wordt gebruikt om de neurale netvlies lift af van de RPE en plaats fotoreceptor kant naar boven op een insert opgevoed door een op maat gemaakte stand.

Organotypische Cultuur van Full-dikte van volwassen varkens Retina

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer fotoreceptorisolatie uit muizenretina met vibratoomsectie voor celkweek. Deze methode biedt hoge zuiverheid en toepassingen voor erfelijke retinale degeneratieonderzoek.

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

Meer video's verkennen