Name: Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer gepaarde whole cell patch clamp opnamen in organotypische hippocampus slices voor het bestuderen van synaptische circuits tussen neuronen. Deze methode isoleert synaptische activiteit in minimale circuits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen de leden van de Montgomery en Madison labs bedanken voor de nuttige discussie. We erkennen de financiering die voor dit onderzoek is ontvangen van de volgende bronnen: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC en NIH.

Animal Ethics Verklaring: De in dit manuscript beschreven protocollen volgen de verzorging van dieren richtlijnen opgesteld door de Universiteit van Auckland en Stanford University. P7 rat pups werden gedood door snelle onthoofding. Hippocampale dissectie wordt onmiddellijk uitgevoerd zoals hieronder beschreven. 1 Organotypische hippocampus Slice Cultuur <ol><li> Voorbereiding <ol><li> Bereid dissectie Medium (alleen gebruikt voor het ontleden van de hersenen). Combineer 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml penicilline-streptomycine oplossing (10.000 eenheden elk in 0,85% NaCl), 5 ml HEPES bufferoplossing, 2 ml 1 M Tris voorraadoplossing (pH 7,2), en filter steriliseren met 0,22 urn filter . Voeren hippocampus dissectie in ijskoud dissectie medium. </li><li> Koel de dissectie medium. Plaats de dissectie media in de vriezer ongeveer 1 uur voor het begin van de dissectie tot de vloeistof koud. Laat geen grote ijs crystals te vormen. Bewaar op ijs tot vereist. </li><li> Bereid kweekmedium (gebruikt voor alles behalve dissectie van de hippocampus). Combineer 100 ml Minimum Essential Medium (1x concentratie vloeistof) w / Hank&#39;s zouten, w / L-glutamine, 2 ml penicilline-streptomycine oplossing (vloeistof, 10.000 eenheden van elk, in 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M buffer oplossing, 50 ml Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing, 50 ml Paard Serum (gedefinieerd, hitte geïnactiveerd) en filter steriliseren met 0,22 um filter. </li><li> Bereid de cultuur gerechten. Plaats 1 ml van de cultuur media per 35 mm cultuur schotel en voeg een membraan insert bij elk gerecht. Zet maximaal zeven van deze gerechten in een 150 mm petrischaal (hierna aangeduid als een &#39;plaatje&#39;). Plaats de plaat in een CO 2 incubator voor ten minste een uur voor de dissectie begint, zodat het kweekmedium in de gerechten bereikt de juiste temperatuur en pH. </li></ol></li><li> Dissectie van de hippocampus van jonge ratten op postnatale dag 7 (P7) <ol><li> Pre-steriliseren alle dissectie-instrumenten onder UV-licht voor de ingreep. </li><li> Na een snelle onthoofding, verwijder de hersenen en de plaats in gekoelde medium in een schotel, en verwijder deze vervolgens naar een stukje vochtig filtreerpapier voor de dissectie. Plagen de cortex weg van de middenhersenen met stompe gladde kunststof gecoate miniatuur spatels, het blootstellen van de hippocampus. Snijd de fornix, en dan zachtjes werken de spatel onder de hippocampus te flippen (Figuur 1A). OPMERKING: Succesvolle slice culturen kan worden bereid met behulp van dieren tot P10. </li><li> Knip de geïsoleerde hippocampus van de rest van de hersenen. Breng de hippocampus in een nieuwe schotel met gekoelde dissectie media met behulp van een vochtige zachte kwast (bv wit sable # 4). </li><li> Reinig de onderzijde (de vlakkere kant) van de hippocampus van choroid plexus tijdens dissectie, omdat deze sponsachtige, meninge-achtige weefsels bemoeilijkt hippocampale scheidenplakjes van elkaar later. OPMERKING: Laat deze weefsels in de plaats als ze niet voorzichtig kan worden geplaagd weg. </li><li> Voer de gehele dissectie zo snel mogelijk zonder beschadiging van de hippocampus. OPMERKING: Een zorgvuldige dissectie is belangrijker dan een snel, zolang de experimentele omstandigheden worden gekoeld. Snijd de hippocampus van ratten drie tegelijk. Het segment gezondheid niet zolang de totale tijd vanaf start beïnvloed wanneer de geïllustreerde schijfjes gaan in de incubator onder 30 minuten. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Snijd de hippocampus in de dwarsrichting in 400 micrometer doorsnede met behulp van een handleiding weefsel snijmachine. De wijze waarop het snijden wordt uitgevoerd is niet belangrijk, zolang het niet overdreven schadelijk voor het weefsel en produceert plakjes constante dikte van gemakkelijk toegankelijk laminaire architectuur (dwz Ammon&#39;s hoorn wordt gemakkelijk gezien worden bewaard in het weefsel). </li><li> Liggen de hippocampus op het podium van het weefselchopper op een drievoudige dikte van # 2 filtreerpapier. De hippocampus zijn geheel gesneden zonder enige plakjes individueel verwijderen (dat wil zeggen de gehele hippocampus is links op het podium van de helikopter totdat alle bezuinigingen zijn gemaakt, maar veeleer als broden van gesneden brood op dit punt; Figuur 1B). </li><li> Breng de hippocampus in dissectie medium met behulp van een ontspannen naast elkaar hippocampus zacht penseel (wit sable 2 #). Schuif dan ieder hippocampus naar de zijkant om de hechting tussen de hippocampus en de onderliggende filterpapier breken. Rol de borstel onder elk hippocampus om het op te rapen van het podium af. Plaats alle hippocampus in dezelfde 35 mm petrischaal van gekoelde dissectie medium. Scheiden de hippocampus in de afzonderlijke segmenten van de hand schudden van de schotel in afwisselend met de klok mee en tegen de klok in bewegingen. </li><li> Inspecteer de plakjes onder een dissectie microscoop en gooi elke die beschadigd, kleine, of die duidelijk zichtbaar cel niet bezittenbody lagen. Opmerking: Het is vaak het geval dat niet alle segmenten met succes gescheiden van hun siblings deze wijze zijn. In dit geval kunnen zij worden gescheiden door ze op scherp en porren ze met de uiteinden van fijne pincet. &quot;Goed&quot; slices worden vervolgens overgebracht naar een schone petrischaal met koud dissectie medium met een afgesneden en vuur gepolijste Pasteur pipet (Figuren 1C-E). </li></ol></li><li> Opslag <ol><li> Leg de afzonderlijke segmenten op het membraan filter inserts. Met behulp van een Pasteur pipet afgesneden en vuur gepolijst tot een grotere boring geven, afzonderlijk segmenten dragen inzetstukken cultuur. OPMERKING: De grootte van de boring ontstaat wanneer Vuurwapens en polijsten de pipet is belangrijk. Te klein en de plakjes niet gemakkelijk de pipet voor de membraan verlaat. Te groot en overtollige vloeistof wordt op het oppervlak van het membraan geplaatst, samen met het segment. De beste boring typisch ongeveer de helft van de diameter van het vat van de pipet. Bij het snijden, kan deze diameter worden gekozen door te snijden op de juiste plaats in de tapsheid van de pipet. </li><li> Slice Transfer <ol><li> Vul de pipet met een medium, en dan zuigen een enkel schijfje met kleine zuigkrachten. Dit houdt de plak bij de opening van de pipet en voorkomt te veel medium uitzetting in het inzetstuk aan het segment plaatsen. </li><li> Breng een lichte druk op de lamp om een ​​kleine hangende druppel te vormen, zodat het schijfje te vestigen in die druppel, en raak die druppel aan het membraan en laat het stukje &quot;val&quot; op het membraan. Algemeen drie plakjes worden geplaatst op elk membraan insert. Opmerking: Als de vloeistof druppel te groot is, de druppels van de drie segmenten lijken over te gaan op het membraanoppervlak en de plakken zal dus meer tezamen naar het midden van het membraan, waardoor het moeilijker om ze later te scheiden voor elektrofysiologische opname. </li></ol></li><li> Fluid Removal <ol><li> Zuig overtollige medium uit de top van de kweekplaat inzetstuk voor alle segmenten in die plaat (3 segmenten per wisselplaat = 21 plakken per plaat), waardoor schijfjes niet worden ondergedompeld in of omgeven door een pool van dissectie medium. </li><li> Voer deze is met een ongesneden, maar-vuur gepolijste Pasteur pipet. Laat de slice om zich te vestigen en zich te houden aan het membraan voor een minuut voordat pipetteren. Zorg ervoor dat u het stukje omhoog in de pipet te zuigen. Uit te voeren verwijdering vloeistof voor de inserts die eerste zijn bedekt, zodat er voldoende tijd voor de plakjes laten bezinken. </li></ol></li><li> Slice-opslag <ol><li> WINKEL slice cultures in een 5,0% CO2 incubator bij 37 ° C. Let op de uiteindelijke opstelling van de culturen in figuur 1E. De afzonderlijke segmenten rusten op een petrischaal inzetstuk dat een poreus membraan voor een bodem heeft en dit inzetstuk past in een petrischaal gevuld met een kleine hoeveelheid van het medium; Op deze wijze worden de schijfjes niet ondergedompeld in het medium, maar toegankelijk is alleen door het membraan onder in de kweekplaat insert. </li><li> Optioneel, verwijder de plakjes kan voor studie, hetzij door het verwijderen van de cultuur plaat insert of door het uitsnijden van een deel van de insert membraan met een slice. </li></ol></li></ol></li><li> Onderhoud <ol><li> Wisselen het medium in de petrischaaltjes de dag na het maken van culturen. Breng de kweek inzetrooster in nieuw petrischaaltje met 1 ml vers kweekmedium dat is geëquilibreerd in de incubator gedurende ten minste een uur vóór de overdracht. </li><li> Verander het medium weer op dezelfde wijze op de derde dag na het maken van culturen. Op de derde dag, de overdracht van de culturen tot een incubator ingesteld op 34 ° C. Verander het medium twee keer per week (om de 3-4 dagen). </li><li> Identificeer gezonde culturen. Kies gezonde culturen voor gepaarde hele cel opnames. OPMERKING: Gezonde culturen hebben een goed gedefinieerde rand en een duidelijk omschreven piramidale cellaag. Culturen with donker (waarschijnlijk necrotische) gebieden aanwezig zijn of een gevacuoleerde verschijning met afgeplatte grenzen worden afgewezen. Gebruikmakend van deze criteria, gewoonlijk tweederde van slice cultures voldoende gezond voor opname. </li><li> Gebruik maken van deze culturen binnen een vrij kleine venster van de tijd. Niet gebruikte weefsels die gekweekt voor meer dan twee weken zijn aangezien de neuronen beginnen enigszins epileptische gedrag dat langzaam erger wordt met de tijd weer. De exacte bovengrens van neuronale overleving is niet bekend maar het is mogelijk opnemen functioneren piramidale cellen zo laat als 16 weken in kweek. </li></ol></li></ol> 2 Gekoppelde Whole Cell Recordings <ol><li> ACSF en intracellulaire Solutions <ol><li> Bereid presynaptische elektrode oplossing door het mengen (in mM) 120 kaliumgluconaat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP en 0,3 NaGTP (pH 7,2 met KOH; osmolariteit: 290 mOsm). Hoewel die elektrode oplossing wordt gebruikt voor postsynaptische neuronen, cesium gluconaat (120 mM) Wordt typisch gebruikt als de belangrijkste zout in de postsynaptische elektrode plus 5 mM QX314. OPMERKING: Dit maakt stabiele spanning klemmen op positieve mogelijkheden om postsynaptische-NMDAR gemedieerde stromen 8-10,13 opnemen. Het voorkomt ook dat de kalium-geïnduceerde hyperexciteerbaarheid van de presynaptische neuron door de interne oplossing die uit de postsynaptische registratie-elektrode voor een zegel giga ohm wordt gemaakt. </li><li> Bereid postsynaptische elektrode samenstellen oplossing (in mM) 120 cesium gluconaat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 NaATP en 0,3 NaGTP (pH 7,2 met CsOH, osmolariteit: 290 mOsm). Trek glazen micro-elektroden 5-10 MQ weerstand en vullen met gefilterd interne oplossing. </li><li> Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) samenstellen (in mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1.3 MgSO4, 2,4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3, 11 glucose, pH 7,4, verzadigd met 95% O2, 5 % CO 2. OPMERKING: Als Ampar-gemedieerde responses moeten worden geblokkeerd voor het onderzoek van NMDAR EPSCs, inclusief 10 uM CNQX of NBQX in de ACSF. </li></ol></li><li> Verkrijgen Gekoppelde Whole Cell Recordings <ol><li> Om synaptische transmissie tussen twee individuele neuronen te onderzoeken, wijst een neuron als het presynaptische neuron en houden in de huidige klem om actiepotentialen opwekken en initiëren van synaptische transmissie. </li><li> Wijzen de tweede neuron, als de postsynaptische neuron, en houd hem in stroom of spanning klem afhankelijk van de door de onderzoeker informatie. Verkrijgen van gedetailleerd onderzoek van de glutamaat stromingen, met Ampar-gemedieerde EPSCs bij -65 mV onderzocht en-NMDAR gemedieerde EPSCs onderzocht bij 30 mV 6-16 door het vasthouden van de postsynaptische neuron in voltage clamp </li><li> Opzetten van een gepaarde opname. Om een ​​gekoppeld opname vast te stellen, wordt de presynaptische hele cel opname altijd eerst verkregen, waardoor meerdere opeenvolgende postsynaptische neuronen te worden verkregen tot een die synaptically connected wordt verkregen. Als uitvoeren synaptische plasticiteit experimenten is bijzonder kritisch voor het presynaptische neuron eerste verkrijgen de inductie van LTP in het postsynaptische neuron op 10 min van het verkrijgen van de volledige cel opnamen washout van cytoplasmatische factoren die nodig zijn voor LTP 8,19 voorkomen moet worden gestart. </li><li> Vermijd beweging geïnduceerde cel verlies. Een grote uitdaging bij het uitvoeren van gepaarde hele cel opnames is het vermijden van trillingen en-beweging geïnduceerde verstoring van de eerste hele cel opname, terwijl het verkrijgen van de tweede opname. <ol><li> Haal het eerste gehele cel opnemen en vervolgens de microscoop lens 10-200 urn in de x-as, zodat de vastgestelde opname ligt aan de rand van het gebied zichtbaar op de monitor (figuur 2A). </li><li> Til de lens van de microscoop ~ 5-10 mm, terwijl ervoor te zorgen dat de ACSF contact met de lens nog steeds handhaaft. Monteer de tweede elektrode en begeleiden in de vloeistof meniscus (Figuur 2B </strong&gt;). </li><li> Beweeg de elektrode in het xy vlak tot het direct onder de lichtbundels door de lens, maar nog steeds aanzienlijk boven de vastgestelde registratie-elektrode. Als de elektrode zichtbaar onder de microscoop, zorgen de tip aan de uiterste rand van het beeldscherm van het eerste electrode. </li><li> Beweeg de tweede elektrode in sequentie met de microscoop nadruk totdat beide elektroden in hetzelfde focal plane. Belangrijk is dat het niveau van positieve druk sterk genoeg om tip verstopping te voorkomen, maar niet te sterk om het eerste hele cel opname verstoren. Dit vertaalt zich naar de overdruk inducerende beweging 2-3 neuronen van de elektrode wanneer het eerst het segment binnenkomt. </li><li> Zoek een postsynaptische partner in een soortgelijke focal plane naar de eerste presynaptische opname (figuur 2C). Opname wordt krijgen over het algemeen gepaard opnames tussen CA3 piramidale neuronen de tweede hele cel uit een 0-200 mm neuron van de eerste ropnametechnieken (Figuren 2C, D). OPMERKING: Synaptic transmissie tussen neuronale paren zijn stabiel in de tijd een periode van maximaal 3-4 uur bij gebruik van deze standaard whole cell opnametechnieken. </li></ol></li></ol></li><li> Synaptische plasticiteit: Once Upon verkrijgen van een succesvolle synaptically-verbonden piramidale cel pair (Figuren 3A, B), op de kenmerken van de synaptische transmissie en plasticiteit. <ol><li> LTP inductie. <ol><li> Induceren LTP door het koppelen presynaptische actiepotentialen (1 Hz) met postsynaptische depolarisatie tot -10 tot 0 mV gedurende 1 min (Figuur 3C) 7-9,12-14. Koppeling tot stand brengen binnen 10 min van de inbraak in het postsynaptische neuron. OPMERKING: LTP kan worden geïnduceerd met zowel neuronen dat op lopende clamp door koppelen presynaptische en postsynaptische actiepotentialen 1 Hz gedurende 1 min, met postsynaptische actiepotentialen opgewekt 10 msec na injectie van stroom in het presynaptische neuron 8 </sinschrijven&gt;. </li></ol></li><li> Verder induceren LTD by laagfrequente stimulatie (LFS) 1 Hz in combinatie met een lichte depolarisatie van het postsynaptische neuron tot -55 mV gedurende 5-10 min (Figuur 3C) 9. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutamate+receptor+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The glutamate receptor ion channels.</a> Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).</li>
<li>Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+-+A+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation - A decade of progress.</a> Science. 285, 1870-1874 (1999).</li>
<li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).</li>
<li>Dudek, S. M., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homosynaptic+long-term+depression+in+area+CA1+of+hippocampus+and+effects+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).</li>
<li>Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calyx+of+held+synapse%3A+from+model+synapse+to+auditory+relay%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay.</a> Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).</li>
<li>Pavlidis, P., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+in+pair+recordings+from+CA3+pyramidal+cells+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture.</a> Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).</li>
<li>Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+protein+kinase+activity+supports+long-term+potentiation+at+synapses+between+individual+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).</li>
<li>Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pair+recordings+reveal+all-silent+synaptic+connections+and+the+postsynaptic+expression+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation.</a> Neuron. 29, 691-701 (2001).</li>
<li>Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+heterogeneity+in+synaptic+depression+between+pyramidal+cell+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs.</a> Neuron. 33, 765-777 (2002).</li>
<li>Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+NMDAR+endocytosis+during+LTD+and+its+dependence+on+synaptic+state%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state.</a> BMC Neuroscience. 6, 48(2005).</li>
<li>Waites, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+SAP97+isoforms+regulate+AMPA+receptor+dynamics+and+access+to+presynaptic+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate.</a> Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).</li>
<li>Emond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+subunits+define+properties+of+state-dependent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity.</a> Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP97+directs+NMDA+receptor+spine+targeting+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity.</a> Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).</li>
<li>Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-spaced+stimulation+and+protein+phosphatase+1+dictate+the+direction+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity.</a> European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).</li>
<li>Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+subunit+GluA1+is+necessary+for+long-term+potentiation+and+synapse+unsilencing%2C+but+not+long-term+depression+in+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus.</a> Brain Research. 1435, 8-14 (2012).</li>
<li>Arons, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism-associated+mutations+in+ProSAP2%2FShank3+impair+synaptic+transmission+and+neurexin-neuroligin-mediated+transsynaptic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling.</a> Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).</li>
<li>Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+synaptic+states+define+a+major+mechanism+of+synapse+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity.</a> Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).</li>
<li>Miles, R., Poncer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pair+recordings+from+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pair recordings from neurones.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons%3A+quantal+levels%2C+oscillations+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP.</a> Science. 252 (5006), 722-724 (1991).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-pulse+facilitation+and+depression+at+unitary+synapses+in+rat+hippocampus%3A+quantal+fluctuation+affects+subsequent+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release.</a> Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).</li>
<li>Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li>
<li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li>
<li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons%3A+quantal+levels%2C+oscillations%2C+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li>
<li>Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li>
<li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn%2C+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Hier hebben we beschreven de vereisten voor de oprichting van een succesvolle gepaarde whole cell opnames in organotypische hippocampus slice culturen. Gepaarde opnames kunnen ook worden uitgevoerd in verschillende bereidingen, waaronder acute plakjes en gedissocieerde kweeksystemen 26,27. Hoewel de focus hier is op de inductie van langere vormen van synaptische plasticiteit (namelijk LTP en LTD), is het belangrijk dat gepaarde whole cell recordings in organotypische, acute slice markeren en gedissocieerde ce...

Glutamaat receptoren bemiddelen de meerderheid van prikkelende synaptische transmissie in het centrale zenuwstelsel synapsen. De twee belangrijkste subtypes van ionotrope glutamaatreceptoren gelokaliseerd aan het hoofd van de wervelkolom postsynaptische membraan N-methyl-D-aspartaat (NMDA) en α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazool-4-proprioniczuur (AMPA) receptoren. Bij rust membraanpotentialen, AMPA receptoren dragen meeste postsynaptische stroom tijdens synaptische transmissie. In de hippocampus, het NMDA receptor speelt een belangrijke rol bij het ​​ontstaan ​​van veranderingen in het aantal AMPA-receptoren in het postsynaptische membraan: door als &quot;koincidentiedetektor&quot; 1 tot veranderingen in synaptische sterkte 1 initiëren de NMDA receptor deelneemt aan de synaptische mechanismen die worden verondersteld om te leren en het geheugen ondersteunen op een subcellulaire niveau. In reactie op depolarisatie van het postsynaptische neuron parallel aan presynaptische afgifte van transmitter, calcium komt via de NMDAreceptor AMPA receptor inbrengen of verwijderen 2 initiëren. Deze receptor dynamiek ten grondslag liggen synaps plasticiteit: een toename van de synaptische kracht is op lange termijn potentiëring 2,3 (LTP), terwijl een afname in synaptische kracht is op lange termijn depressie 4 (LTD). Daarom AMPA receptor beweging wordt verantwoordelijk geacht voor synaptische plasticiteit expressie, terwijl NMDA-receptoren wordt gedacht dat de inductie controleren. Het bepalen van de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische transmissie en plasticiteit vereist het bestuderen van kleine populaties van synapsen, idealiter enkele synapsen. Terwijl sommige synapsen zeer geschikt voor onderzoek op dit niveau, bijvoorbeeld de calyx van Held 5 voor de meeste synaptische populaties is uiterst moeilijk door de kleine en diffuse aard van de synaptische verbindingen. Twee belangrijke elektrofysiologie technieken ontwikkeld enkelvoudige synaptische verbindingen onderzocht: het eerste is minimaal stimulatie, where een presynaptische vezel wordt verondersteld gestimuleerd extracellulair. De tweede techniek is gekoppeld opnamen, waarbij twee simultane gehele cellen opnames van synaptisch verbonden neuronen wordt uitgevoerd. Een groot voordeel van minimale stimulatie is dat het snel en relatief eenvoudig uit te voeren, waarbij de plaatsing van een extracellulair stimulerende elektrode in de axonale kanaal tegelijkertijd opnemen van een postsynaptische neuron. De primaire zorg bij het gebruik van deze techniek is dat betrouwbare stimulatie van een enkele cel zelden worden gegarandeerd proef na proef. In de afgelopen vijftien jaar hebben we routinematig gebruikt gepaarde whole-cell opnames van twee synaptically verbonden piramidale neuronen 6-17. Het grote voordeel van deze techniek is dat slechts een presynaptische neuron consistent en betrouwbaar wordt gestimuleerd. Ook kan niet alleen elektrofysiologische karakterisering maar ook farmacologische manipulatie van het presynaptische neuron 6,18 &lt;/ Sup&gt;. De waarschijnlijkheid van synaptische verbindingen tussen neuronen is laag, waardoor verbonden paren moeilijk te verkrijgen 19. Het gebruik van organotypische brain slice cultures omzeilt het obstakel als synaptische connectiviteit kan herstellen in vitro en bovendien de aard van de resulterende verbinding is vergelijkbaar met die van natief hersenweefsel 20. Bovendien organotypische kweken drukken LTP, LTD 7-10,12-15,21 en andere vormen van kortdurende synaptische plasticiteit inbegrip gepaarde puls facilitatie (PPF) en depressie (PPD) 6,22,23, waardoor plasticiteit mechanismen bestudeerd in paren neuronen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie betrokken succes bereiken gekoppeld opnamen in dit in vitro systeem. Deze informatie kan gemakkelijk worden aangepast aan andere experimentele systemen, waaronder acute segmenten en andere hersengebieden.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td></td><td></td><td>Stable motorized micromanipulators&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Shallow tissue bath</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution</td><td></td><td></td><td>DIC camera</td></tr><tr><td>1 M Tris stock solution</td><td></td><td></td><td>Amplifier</td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>Computer</td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Vibration isolation table</td></tr><tr><td>Plastic-coated miniature spatulas</td><td></td><td></td><td>Upright microscope</td></tr><tr><td>Soft paintbrush</td><td></td><td></td><td>Data acquistion and analysis software</td></tr><tr><td>Manual tissue chopper</td><td></td><td></td><td>Electrode puller</td></tr><tr><td>#2 Filter paper</td><td></td><td></td><td>Faraday cage</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane inserts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class II hood</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gepaarde whole cell opnamen in organotypische hippocampus slices

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings omvatten gelijktijdige gehele cel patch clamp opnames van twee synaptisch verbonden neuronen, wat niet alleen een directe elektrofysiologische karakterisering van de synaptische verbindingen tussen individuele neuronen mogelijk maakt, maar ook farmacologische manipulatie van het presynaptische of het postsynaptische neuron. Wanneer uitgevoerd in organotypische hippocampale plakjesculturen, is de waarschijnlijkheid dat twee neuronen synaptisch verbonden zijn aanzienlijk verhoogd. Deze voorbereiding maakt het gemakkelijk om celtypen te identificeren, en de neuronen behouden hun morfologie en eigenschappen van synaptische functie vergelijkbaar met die in natieve hersenweefsels. Een groot voordeel van gepaarde gehele cel opnames is de zeer nauwkeurige informatie die het kan verstrekken over de eigenschappen van synaptische transmissie en plasticiteit die niet mogelijk zijn met andere grovere technieken die extracellulaire axon stimulatie gebruiken. Gepaarde gehele cel opnames worden vaak als te uitdagend om uit te voeren ervaren. Hoewel er uitdagende aspecten zijn aan deze techniek, kunnen gepaarde opnames worden uitgevoerd door iedereen die is getraind in gehele cel patch clamping, op voorwaarde dat specifieke hardware en methodologische criteria worden gevolgd. De waarschijnlijkheid om synaptisch verbonden gepaarde opnames te behalen neemt aanzienlijk toe met gezonde organotypische plakjes en stabiele micromanipulatie waardoor onafhankelijke verkrijging van pre- en postsynaptische gehele cel opnames mogelijk is. Hoewel CA3-CA3 piramidale celparen het meest worden gebruikt in de organotypische hippocampale plak voorbereiding, is deze techniek ook succesvol geweest in CA3-CA1 paren en kan worden aangepast aan alle neuronen die synaptisch verbonden zijn in dezelfde plak voorbereiding. In dit manuscript bieden we de gedetailleerde methodologie en vereisten voor het vestigen van deze techniek in elk laboratorium dat is uitgerust voor elektrofysiologie.

Synaptische connectiviteit is duidelijk door het stimuleren van de presynaptische neuron om een ​​actiepotentiaal te vuren door het passeren van een depolariserende stroomstoot (meestal 20-50 jaar voor 20 msec) via de registratie-elektrode. De postsynaptische stroom trace wordt dan voor de aanwezigheid van een monosynaptic EPSC onderzocht opgeroepen Snel (&lt;5 msec) en consistent latencies na de piek van de presynaptische actiepotentiaal (Figuur 3A). In de meeste experimenten meerdere postsynaptische n...

Paaropnamen zijn gelijktijdige gehele cel patch clamp opnamen van twee synaptisch verbonden neuronen, waardoor een nauwkeurige elektrofysiologische en farmacologische karakterisering van de synapsen tussen individuele neuronen mogelijk wordt. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie en vereisten voor het vestigen van deze techniek in organotypische hippocampale plakculturen in elk laboratorium dat is uitgerust voor elektrofysiologie.

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om elektrofysiologisch te kunnen registreren vanuit het minimale synaptische circuit in de hersenen. Dit wordt bereikt in opnames gemaakt van organotypische plakjesculturen uit de hippocampus van ratten, gekweekt in plastic kweekinzetstukken. Deze plakjes maken uitgebreide maar geschikte synaptische verbindingen die na een groeiperiode in cultuur gemakkelijk kunnen worden geregistreerd.Het maken van opnames in deze plakjes maakt het mogelijk om de synaptische activiteit van het minimale synaptische circuit dat tussen slechts twee neuronen is gemaakt, te isoleren en maakt zo de studie van de meest basale eigenschappen van neuronale circuiterie mogelijk. Deze methode kan worden gebruikt om de functie van synaptische microcircuits in de hippocampus te onderzoeken, maar het kan worden gebruikt voor elk gebied van de hersenen waar buurneuronen synaptisch zijn verbonden. Visuele demonstratie van zowel de opname- als de dissectiemethoden zijn cruciaal, omdat veel van de stappen afhankelijk zijn van de nauwkeurige identificatie van hersenlandmerken en neuronen. Bereid, voordat u plakjes maakt, alle oplossingen en de kweekplaten voor.Elke gro

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit is een protocol voor te bereiden en een neocorticale slice voorbereiding handhaven organotypische cultuur voor het maken van elektrische opnames van piramidale neuronen.

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

We maken gebruik van de patch-clamp techniek om GABA-geactiveerde single-channel stromingen (GABAA-kanalen, GABAA-receptoren) en de synaptische en tonische stromen ze genereren in neuronen te meten. Activering van de kanalen af ​​neuronale prikkelbaarheid bij gezondheid en...

GABA-geactiveerde Single-kanaal en Tonic Stromingen in hersenen van de rat Slices

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

This video demonstrates the procedure for setting up a brain slice in a submersion chamber to record synaptic activity. The process involves securing the slice on lens paper, maintaining a continuous flow of artificial cerebrospinal fluid (aCSF) to ensure neuronal viability, and accurately positioning the stimulation and recording electrodes relative to a specific brain region of interest. This setup allows for precise monitoring of baseline synaptic activity and the effects of electrical...

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Leer gepaarde whole cell patch clamp opnamen in organotypische hippocampus slices voor het bestuderen van synaptische circuits tussen neuronen. Deze methode isoleert synaptische activiteit in minimale circuits.

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Meer video's verkennen