Name: Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer methoden voor huidverwondingen en wondreacties in C. elegans. Deze technieken met micro-injectienaald en laser beelden calciumsignalen en actine-ringvorming af om epitheliale wondgenezing te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Naaldwondmethoden voor C. elegans werden voor het eerst ontwikkeld door Nathalie Pujol en Jonathan Ewbank; we bedanken Nathalie Pujol voor haar opmerkingen over het manuscript. Het werk in ons laboratorium over epidermale wondherstel bij C. elegans wordt ondersteund door een subsidie van de NIH aan A.D.C. (R01 GM054657).

De volgende protocollen beschrijven gedetailleerde procedure voor C. elegans huid verwonden en voor het analyseren wond reacties. 1. Naald Verwonden 3,4 <ol><li> Groeien gezonde unstarved wormen op standaard NGM (nematode groeimedium) platen met E. coli OP50 bacteriën als voedsel, onderhouden in een 20 ° C incubator. OPMERKING: Methoden voor NGM agarplaten en routine teelt van C. elegans is te vinden op www.wormbook.org 6. </li><li> Pick 25 L4 stadium wormen met een vers gezaaid plaat 1 dag vóór het verwonden en cultuur bij 20 ° CO / N. </li><li> Voordat verwonden, trek naalden uit haarvaten behulp van een naald trekker. De naalden die in verwonding zijn identiek aan die voor micro-injectie van C. elegans. </li><li> Zorg ervoor dat alle wormen zijn op jonge volwassen stadium. Plaats de plaat van wormen op ijs voor ongeveer 30 min. Koeling zorgt ervoor dat de dieren worden traag, het vergemakkelijken van de naald verwonden. <br /&gt; OPMERKING: Binnen 5 min van verwijdering uit het ijs, zullen de wormen beginnen om normaal te bewegen. Het is mogelijk, maar uitdagend om bewegende wormen wond. Met ervaring, 5 minuten is genoeg tijd om 25 wormen wond. Immobiliseren met drugs zoals levamisol (zoals gebruikt in de laser verwonden, zie hieronder), hoewel dieren zal het langer duren om te herstellen. </li><li> Verwijder de agar plaat uit het ijs om een ​​dissectie stereomicroscoop. Met behulp van een worm pick verplaatst 25 wormen in het midden van de agar plaat. </li><li> Plaats de naald in een 100 ul pipet tip om gemakkelijker te houden van de naald. Prik de voorste of achterste deel van het lichaam van de worm met de naald, het vermijden van de gonaden. In het algemeen proberen te verwonden tussen de achterste keelholte en de voorste gonad, of tussen de achterste gonaden en de endeldarm. Hergebruik naalden vele malen, totdat ze breken. OPMERKING: Zorg ervoor dat de wonden zijn korte, zachte prikt dat de cuticula en de huid te prikken, doordringende ~ 5-10 micrometer in het dier. De naald moet de anim voerenal ongeveer haaks op de huid. De wonden niet zichtbare schade aan inwendige organen of onmiddellijke breuk van het lichaam. Observeer een kleine hoeveelheid cytoplasma sijpelen uit voor een paar seconden nadat de wond; indien echter celinhoud lekken gedurende langere tijd de dieren niet overleven. Voor een optimale beeldvorming, wond de laterale epidermale syncytium (hyp7) of de zijdelingse naad. OPMERKING: Deze procedure omvat het gebruik van een glazen naald. </li><li> Laat wormen om te herstellen bij RT toen cultuur op 20 ° C. Beoordeel het succes van naald verwonding door verschillende assays die hieronder worden beschreven. Meer dan 95% van de wild-type dieren overleven 24 uur na naald verwonden in de jonge volwassen stadium. Het effect van verwonden larven of oudere volwassenen nog niet uitgebreid onderzocht. </li></ol> 2. Laser Verwonden 3 Gebruik femtosecondelaser bestraling (800 nm) om precies te verwonden voeren. <ol><li> Bereid agar padvertenties op een glasplaatje met gesmolten 2% agar 7. Zorg ervoor dat de pads zijn vergelijkbaar met de agar pads gebruikt voor live beeldvorming van C. elegans. </li><li> Transfer 10 jonge volwassen wormen op de agarose pad met worm pick, en voeg een 2 pl daling van 12 mM Levamisole oplossing. Bedek de dieren en de vloeistof met een dekglas. Wacht 1-2 min voor de wormen te verlammen. </li><li> Plaats het glaasje op een draaiende schijf confocale microscoop. Verplaats het podium om de wormen te vinden en zich richten op de laterale voorste of achterste syncytieel epidermis met een 100x objectief (NA 1,4-1,46). </li><li> Stel de kracht van de femtosecondlaser tot 140 mW (gemeten voor de doelstelling). Gebruik de femtosecondelaser een herhalingssnelheid van 80 MHz. OPMERKING: Twee pulsen van 200 msec per stuk (gescheiden door 20 msec) zijn voldoende voor het verwonden in onze handen. </li><li> Focus op het apicale oppervlak van de epidermale cel en wond de opperhuid. Observeren lokale verstoring van het cytoplasma (borrelen), of lokale bleken of tl-marker gebruikt. OPMERKING: Volg de juiste laser procedures veiligheid bij het gebruik van de femtoseconde laser. Lijn of bijzondere scans met femtoseconde lasers zoals twee foton microscopen moet voldoende stroom leveren voor laser verwonden. OPMERKING: Hoewel we niet de directe ervaring van het gebruik van andere lasers hebben, in principe verwonding moet mogelijk zijn met behulp van conventionele UV-lasers (zoals gebruikt in C. elegans cel ablaties). Optioneel gebruik maken van een fluorescentie herstel na Photobleaching (FRAP) module op draaiende schijf confocale aan de epidermis (N. Pujol, persoonlijke communicatie) wond. </li></ol> 3. Visualisatie van epidermale Ca 2+ Reacties met choquerende <ol><li> Gebruik transgene C. elegans stammen die Ca2 + sensoren (zoals die van de GCaMP serie) in de epidermis tot expressie, onder controle van de volwassen epidermale promoter col-19 (Figuur 1A transgenen in opgesomd <strong&gt; Tabel 1). Gebruik een transgen een rood fluorescerend eiwit zoals tdTomato als een interne controle voor transgenexpressie niveau. OPMERKING: We hebben tdTomato gebruikt als een interne controle voor transgenexpressie epidermale tdTomato fluorescentie relatief stabiel is en niet interfereert met GCaMP beeldvorming. </li><li> Zowel naald en laser verwonden trekker Ca 2+ verhoging in de opperhuid. Aangezien naald verwonding niet gemakkelijk kan worden uitgevoerd op een draaiende schijf confocale laser verwonding voorkeur voor kwantitatieve analyse van de Ca2 + respons (Figuur 1). </li><li> Verwerven time lapse beelden in multi-dimensionale overname modus (interval tijd 2 sec met 114 msec excitatie laser blootstelling) met behulp van een draaiende schijf confocale met 100X doelstelling (NA 1,4-1,46) en geschikte filter sets (GFP filters zal werken voor GCaMP3). OPMERKING: Acquire time-lapse beelden elke 30 seconden voor ongeveer 2 uur om de Ca 2+ resp onderzoekenonse te verwonden over een langere tijd natuurlijk. </li><li> Met behulp van beeldanalyse software meet de gemiddelde GCaMP fluorescentie in tien gelijkwaardige gebieden van belang (ROI), waarvan er vijf zijn gericht op de epidermale cel cytosol en vijf op de achtergrond. </li><li> Verkrijgen basislijn fluorescentie (F 0) door het gemiddelde fluorescentie in 5 ROI in de epidermis vervolgens aftrekken van de gemiddelde van 5 ROI op de achtergrond voor schade. Druk de verandering in fluorescentie AF als de verhouding tussen ten opzichte van de basislijn [(t F ​​-F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualisatie van F-actine Dynamics na verwonding <ol><li> LET OP: In antwoord op de naald verwonden, te observeren een actine ring aan de wond die geleidelijk sluit rond de wond. Dit protocol sectie assays wondsluiting door het meten van het actine ring diameter. </li><li> Genereren van transgene wormen die een F-actine marker te drukken, zoals de Drosophila Moesin actine-bindende domein gefuseerd metGFP expressie onder controle van een epidermale specifieke promoter zoals col-19 (figuur 2A) (transgen juIs352). LET OP: Wij hebben soortgelijke resultaten met behulp van andere actine-bindende domein markers zoals Lifeact of F-tractin (niet gepubliceerde resultaten) verkregen. </li><li> Voeren naald verwonden op P col-19- GFP-Moesin transgene wormen. Na naald verwonden, te observeren een ring van GFP-Moesin rondom de wond door ~ 5 min. De actine ring wordt kleiner in diameter en uiteindelijk sluit 2-3 uur na het verwonden in wild type dieren (Figuur 2A). </li><li> Bereid een 2% agar pad op een glasplaatje en overdragen 10 wormen op het pad in 2 pl 12 mM Levamisole oplossing. Afbeelding de GFP-Moesin ringen 1 uur na verwonding met conventionele confocale microscopie. OPMERKING: Gebruik confocale microscopie om z-stacks (13 x 0,5 micrometer) van actine ringen verwerven 1 uur na verwonding. </li><li> Meet de actine ring diameter na verwonding. Epidermale G kwantificerenFP-Moesin, eerst een maximale intensiteit projectie van de z-stack en dan trekken 4 lijnscans (bij 45 ° met elkaar) over de GFP-Moesin ring. Ring diameter wordt gedefinieerd als de gemiddelde piek tot piek afstand van de vier lijnaftastingen (figuur 2B). Voor ringen die al zijn gesloten, wordt de diameter gedefinieerd als 0 micrometer. OPMERKING: F-actine ringen zijn gunstig gemeten 1 uur na het verwonden als dit is ongeveer de helft weg door de wonden in proces in het wild type. F-actine ringen kunnen ook worden gemeten op verschillende tijdstippen een tijdsverloop van wondsluiting leiden. Time lapse filmpjes van wondsluiting kan worden verkregen met behulp van levamisol geïmmobiliseerd wormen en draaiende schijf confocale microscopie. </li></ol> 5. Inductie Assay van Epidermale antimicrobiële peptiden OPMERKING: De verwondingen veroorzaakt ook aangeboren immuunrespons bij de C. elegans huid. Transcriptie van genen die coderen voor antimicrobiële peptiden (AMPs) is induced in de epidermis. De NLP-29 (neuropeptide-achtig eiwit) AMP wordt sterk geïnduceerd door verwonden 4. Om te testen hoe de epidermis regelt AMP uitdrukking na verwonding, gebruik transgene reporters of real-time PCR individuele AMP transcriptniveaus detecteren. <ol><li> Transgene reporter assay voor aangeboren immuunrespons te verwonden 4. </li><li> Voeren naald verwonding (zoals in protocol 1) op volwassen dieren de uiting van de transgene verslaggever frIs7, die P NLP-29- GFP en P col-12- DsRed bevat als een interne controle. Observeren gewonde volwassen dieren zo donker rood of oranje in een GFP lange pass filter. OPMERKING: Verwonden wild-type wormen zullen P NLP-29-GFP expressie te induceren, maar heeft geen invloed op P col-12 -dsRed, wat resulteert in wormen die oranje, geel of groen verschijnen onder GFP lange pass verlichting. Verlies van de functie van genen in het p38 MAPK route, zoals PMK-1 of NSY-1 zal blokkeren NLP-29-GFPinductie na verwonding 4. P NLP-29- GFP wordt uitgedrukt op een hoog niveau in larvale stadia </li><li> Voeren AMP inductie assays bij jonge volwassen dieren. Ervoor te zorgen dat gewonde controle dieren hebben lage niveaus van GFP. OPMERKING: P NLP-29- GFP expressie wordt ook veroorzaakt door osmotische stress 8, en kunnen gevoelig zijn voor andere milieu-invloeden zijn. </li><li> 6 uur na verwonding score het aantal wormen die P nlp-29 GFP inductie (figuur 3) 9 met fluorescentie- dissectie scope met GFP lange-pass filter hebben. OPMERKING: Bij 1 uur na de verwonding P NLP-29- GFP wordt zichtbaar geïnduceerd, met een piek ongeveer 6 uur na verwonding en vervolgens de resterende verhoogd tot 24 uur na verwonding. Kwantificeren expressie door visuele scoren 4,9. Als alternatief kwantificeren expressie niveaus met behulp van een fluorescentie-geactiveerde worm sorteerder 4. Voor de worm sorteerder, moeten ten minste 50 dieren worden verwond. </li><li> Real-time PCR-test voor quantitating transcript niveaus van de afzonderlijke AMP genen. Assay transcriptniveaus voor verschillende genen: NLP-29, nlp-30, cnc-1, en ​​cnc-5. </li><li> Voeren naald verwonden op wild-type of mutant wormen (zie protocol 1) </li><li> Verzamel 50 gewonden wormen en 50 gewonde wormen op de gewenste tijden (bijvoorbeeld 3, 6, 24 uur) na de verwonding. </li><li> Extraheer RNA met een commercieel kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voeren reverse transcriptie aan de totale 20 pi cDNA te krijgen met behulp van een commercieel reverse transcriptase kit. </li><li> Voor RT-PCR, een 0,2 pi cDNA (1/40) van elk monster in combinatie met een groene Supermix met fluoresceïne en 0,2 uM primers. Te vergelijken RNA kwaliteit, gebruiken ama-1 of SNB-1 RT-PCR als referentie; vergelijken de AMP relatieve expressie niveau door het normaliseren van de interne controle (ama-1 of SNB-1), of vergelijken voudige inductie na de verwonding (AMP-inductie bij gewonde wormen / gewonde wormen) door normalizing om de interne controle. OPMERKING: cnc-1 en cnc-5 zijn caenacin familie antimicrobiële peptiden waarvan de transcriptie wordt geactiveerd door verwonden 10. Typisch, naald verwonding induceert expressie (~ 500 voudig voor cnc-1) over een tijdsverloop van 4 uur 10. Primers gebruikt in gepubliceerde werk zijn vermeld in tabel 2. </li></ol> 6. Assay Survival na verwonding <ol><li> OPMERKING: De verwondingen activeert ten minste twee onafhankelijke signaalwegen in de epidermis: de Ca 2+ afhankelijk wondheling route en de aangeboren immuunrespons pad. Beide routes zijn vereist om overleving van steriele verwonding. Om te testen of een mutant of RNAi behandeling van invloed op de wondgenezing, meten overleving na 24-48 uur na verwonding. Optioneel gebruik van conventionele levensduur assays om het effect van het verwonden op levensduur 4,9 bepalen. </li><li> Voeren naald verwonden op jong volwassen (L4 + 24 uur) wormen (50 wormen, herhaalt several keer) volgens het protocol van 1 hierboven. Handhaaf een equivalent aantal gewonde wormen als controlegroep. </li><li> Controleer overleven elke 24 uur (transfer gewond wormen naar een nieuwe agarplaat elke 24 uur). Observeren ~ 50% overlevingskans 24 uur na verwonding in mutanten die defect in wondheling zijn zoals GTL-2 of TIR-1, bij normalisatie-gewonde controle dieren. De dood wordt gedefinieerd als een gebrek aan motorische respons te raken door worm pick. </li></ol>

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li>
<li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G%CE%B1q-Ca2%2B+signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II%3A+differentiation+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook+%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22">WormBook : the online review of C. elegans biology</a>. , 1-11 Forthcoming.</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 Forthcoming.</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li>
<li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li>
<li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensor.%2C+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li>
<li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li>
<li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bacterial+pathogen%2C+Microbacterium+nematophilum%2C+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li>
<li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li>
</ol>

De auteurs zijn zich niet bewust van enige concurrerende belangen.

De hier gepresenteerde van naald en laser verwonding werkwijzen complementaire werkwijzen om het vermogen van de epidermale epitheel schade te herstellen. Laser verwonding is relatief gelokaliseerde en (afhankelijk van de laser configuratie) kan worden beperkt tot de epidermis, terwijl naald verwonding verstoort de opperhuid, cuticula, en waarschijnlijk interne basaalmembranen. Naald verwonding kan nauwkeuriger lijken wonden toegebracht door pathogenen of mechanische schade in de natuurlijke omgeving. In de regel naald ...

Huid wondgenezing mechanismen zijn van fundamentele biologische interesse en voor de menselijke gezondheid relevant. Wondgenezing in gewervelde dieren en zoogdieren bestaat uit een complexe reeks gecoördineerde reacties van verschillende weefsels en signalering 1. Veel eenvoudige genetische model organismen zijn ook in staat om helende huidwonden 2. Het is daarom van belang genetisch handelbaar modellen huid wondheling analyseren. Wij en anderen hebben begonnen Caenorhabditis elegans als nieuw model voor de huid wondgenezing 3,4. Het doel van dit protocol is om een bredere reeks van onderzoekers aan C. gebruiken mogelijk elegans als een instrument om de moleculaire en cellulaire mechanismen van epidermale wondgenezing te onderzoeken. De C. elegans huid omvat de epidermis (ook bekend als hypodermis) en het extracellulaire cuticula 5. De volwassen epidermis gevormd uit een klein aantal meerkernige syncytia, waarvan de grootste de syncytium known als hyp7. De epidermis is een eenvoudige epitheel dat de cuticula van het apicale oppervlak afscheidt. De huid kan actief verdedigen tegen-huid doordringende ziekteverwekkers en repareren kleine wondjes 4. Wondherstel van de C. elegans huid is robuust, aangezien bijna alle wild type dieren overleven kunnen kleine wondjes veroorzaakt door naalden, of lokale beschadiging van de huid veroorzaakt door laser bestraling overleven. C. elegans huid verwonding veroorzaakt een reeks van reacties, met inbegrip van een epidermale aangeboren immuunrespons, wondsluiting en littekenvorming 4. De volwassen epidermis post-mitotische en wondheling omvat lokale cellulaire responsen in tegenstelling tot epidermale proliferatie of celmigratie. We hebben aangetoond dat de huid verwonding veroorzaakt een aanzienlijke en aanhoudende groei van epidermale Ca2 +, waarbij het ​​membraan TRPM kanaal GTL-2 en interne Ca2 + stores 3. De epidermale Ca2 + signaal nodig voor oprichting en sluiting van F-actine ringen aan de wound website. Verwonding induceert ook aangeboren immuunrespons dat de transcriptie van AMPs zoals NLP-29 te activeren. De verwonding geïnduceerde transcriptie van AMPs is afhankelijk van een TIR-1 / PMK-1 p38 MAP kinase cascade autonoom handelen in de epidermis 4. Defecten in ofwel de Ca 2+ signaleringsroute of in de aangeboren immuunrespons zal leiden tot lagere overleving na de verwonding. De relatief eenvoudige structuur van het C. elegans epidermis, zijn genetische handelbaarheid en voordelen voor in vivo beeldvorming maakt het een uitstekend systeem om meerdere aspecten van wondheling te bestuderen. Hier presenteren we protocollen voor de twee gebruikelijke methoden van verwonding: naald verwonden en laser verwonden. Naald verwonding vereist geen speciale apparatuur (met uitzondering van de naald trekker), en met ervaring kan worden uitgevoerd op honderden wormen per dag. Naald verwonding wordt uitgevoerd op dieren groeien op agarplaten. Daarentegen wordt laser verwonding uitgevoerd op anesthetized dieren aangebracht op agar kussentjes onder een dekglaasje en is geschikt voor levende beeldvorming van de cellulaire respons op beschadiging.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof Petri-schaal</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillair</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Naaldtrekker</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platina draad)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 oplossing</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O tot 1 liter. Steriliseer door autoclaven</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Gebruik 500 ml voor 50 wormen</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR buizen</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden voor de huid de verwondingen en testen voor wond reacties in c. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

De C. elegans epidermis en cuticula vormen een eenvoudige, maar verfijnde huidlaag die gelokaliseerde schade als gevolg van het verwonden kan repareren. Studies wond reacties en reparatie dit model hebben ons begrip van het cytoskelet en genomische respons op weefselbeschadiging verlicht. De twee meest gebruikte methoden wond C. elegans volwassen huid prikt met micro-injectie naalden, en lokale laser bestraling. Naald verwonden plaatselijk verstoort de cuticula, epidermis en bijbehorende extracellulaire matrix, en kunnen ook interne weefsels beschadigen. Laser bestraling resulteert in meer gelokaliseerde schade. Verwonding veroorzaakt een opeenvolging van gemakkelijk getest reacties ontvangen, waaronder verhoogde epidermale Ca 2+ (seconden-minuten), de vorming en de sluiting van een actine-bevattende ring op de wond (1-2 uur), verhoogde transcriptie van antimicrobiële peptide genen (2-24 hr) en littekenvorming. In wezen zijn alle wild type volwassen dieren overleven verwonding, waarals mutanten defect in de wond reparatie of andere reacties tonen verminderde overleving. Gedetailleerde protocollen voor naald en laser verwonden en assays voor kwantificering en visualisatie van wond reacties en herstelprocessen (Ca dynamiek, actine dynamiek, antimicrobiële peptide inductie en overleving) gepresenteerd.

Laser of naald verwonding zal een snelle en aanhoudende verhoging veroorzaken in epidermale Ca niveaus, zoals zichtbaar gemaakt met Ca sensoren zoals GCaMPs (figuur 1). De Ca verhoging plaatsvindt binnen seconden en blijft gedurende tientallen minuten. Naald reproduceerbaar verwonding resulteert in de vorming van F-actine ringen aan wondplaatsen (figuur 2); deze verschijnen binnen enkele minuten, en geleidelijk aan dicht dan 1-2 uur na verwonding. Actine ringen zijn minder vaak gevormd ...

De huid van de volwassen C. elegans is een hanteerbaar model voor studies van epitheliale wondreacties, inclusief wondgenezing, littekenvorming en aangeboren immuniteit.

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om methoden te demonstreren die worden gebruikt om elegantie te zien wonden en om de epidermale reacties op wonden te visualiseren. Dit kan worden bereikt door de epidermis te verwonden met kleine prikjes veroorzaakt door prikken van een micro-injectienaalden. Een tweede methode voor het veroorzaken van wonden maakt gebruik van laserbestraling.Dit kan worden uitgevoerd op dieren die zijn gemonteerd voor microscopie en maakt onmiddellijke beeldvorming van de wondreactie mogelijk. De resultaten tonen aan dat wonden een snelle verhoging van het epidermale calcium veroorzaken, gevolgd door de ophoping van een actine-ring rond de wondplaats die binnen enkele uren sluit, waardoor de wond kan genezen De naald. En de laserwondmethoden die hier worden getoond, zijn momenteel de meest gebruikte methoden voor huidwonden bij de nematode C Elgan.Deze methoden worden gebruikt om belangrijke vragen in het wondnierveld aan te pakken, zoals hoe huicellen verwondingen detecteren en reageren. Plaats een plaat met jonge volwassen wormen ongeveer een half uur op ijs om de dieren te vertragen. Deze koude geïnduceerde torpor is belangrijk voor nauwkeurige naaldwonden.Aangezien wormen normaal gesproken te snel rondlopen om onder de stereomicroscoop te wonden, bekijk de wormen en gebruik een punt om ze allemaal naar het midden van de plaat te verplaatsen. Grijp vervolgens een getrokken naald zoals die wordt gebruikt voor micro-injectie met een 100 microliter pipettentip. Breng de naaldpunt als naaldhouder naar een van de uiteinden van een worm, vermijd de geslachtsklieren, ofwel tussen de achterste pH farynx en de binnenkant van het gonaad, of tussen het achterste gonaad en het rectum.Voeg vervolgens een ongeveer recht hoek toe aan de cuticula. Maak een kortzaam prikken dat ongeveer vijf tot 10 micrometer in de worm doordringt. Deze naaldwonden kunnen ook inwendige organen zoals de darm beschadigen.Wacht even om cellulaire inhoud uit de wond te lekken. Een paar seconden lekkage is oké, maar meer dan dat suggereert dat de wond dodelijk zal zijn. Het beeldvormen van de wondreacties zal het gemakkelijkst zijn als de wond in het laterale epidermale syncytium of de laterale naad wordt gemaakt.Bij het wonden met een naald is het van cruciaal belang om een kleine punctie te veroorzaken in plaats van een grote prik. Aangezien de ladder de wormen snel kan doden, is oefening nodig om reproduceerbaar de minimale schade te veroorzaken die nodig is om een wondreactie te induceren. Ga door met het wonden van elk dier met dezelfde naald totdat deze breekt of vuil wordt. Met ervaring is het binnen vijf minuten heel goed haalbaar om alle 25 dieren op de plaat precies te wonden.Dit protocol gebruikt een femto-segmentlaser die is bevestigd aan een spindisfocale microscooplijn of puntscans met behulp van femto femtosecondenliters zoals die in twee fotomicroscopen. Mocht ook voldoende zijn. Begin met het verzamelen van 10 jonge volwassenen op een auger-pad.Verlam ze in een druppel van twee microliter 12 millimolair lail-oplossing. Bedek ze vervolgens met een dekglas en wacht een paar minuten terwijl ze verlamd worden. Het is essentieel dat het dier volledig verlamd is.12 milli meer zal alleen de respons niet beïnvloeden. Er kunnen echter ook andere methoden van immobilisatie worden gebruikt. Zorg ervoor dat het vermogen van de femtosecondlaser is ingesteld op 140 milliwatt zoals gemeten voor het objectief en dat de herhalingssnelheid van de laser 80 megahertz is.Lokaliseer nu de wormen onder een spindisconfocale microscoop met een 100 x objectief met een hoge numerieke apertuur focus op de laterale, anterieure of posterieure syncitiële epidermis van de doelworm, gericht op het apicale oppervlak van de epidermale cel. Laat de laser twee pulsen van 200 milliseconden schijnen, gescheiden door 20 milliseconden. Dit zou voldoende moeten zijn om de epidermis te wonden.Wacht even en observeer de lokale verstoring van het cytoplasma, die als borrelen zal verschijnen. Als er een fluorescente marker aanwezig is, kan gelokaliseerde bleking worden waargenomen. Dit protocol maakt gebruik van C elegance die calciumsensoren in de epidermis tot expressie brengt, zoals G Camp drie en ook een rood fluorescent eiwit zoals TD-tomaat als interne controle voor de expressieniveau van het transgen.Hoewel beide wondmethoden calciumverhoging veroorzaken om dit te beeldvormen door spindisconfocale microscopie, moet laserwonden worden gebruikt na het wonden om time-lapse beelden te achterhalen met een intervaltijd van twee seconden en een excitatie en een laserblootstelling van 114 milliseconden. Dezelfde vergroting die voor laserwonden wordt gebruikt, is geschikt over langere tijdsverlopen, zoals twee uur kunnen beelden om de 30 seconden of langer worden genomen. Het tekstprotocol suggereert analyseroutines.Dit protocol gebruikt wormen die een F-actine marker GFP mosin tot expressie brengen onder controle van een epidermaal specifiek promotor, zoals call 19 na naaldwonden cultuur. De gewonde wormen bij 20 graden Celsius in een incubator gedurende een uur en neem vervolgens Zacks om de vorming van de actine-ring te beeldvormen om actinedynamica onmiddellijk na naaldwonden te onderzoeken, breng de gewonde dieren over naar een auger-pad op een dia en verdoof ze met lail. Beeld vervolgens de dieren af met conventionele confocale microscopie.Verzamel Zacks met een interval van 0,5 micrometer gedurende één tot twee uur om de actine-ring te meten om de ringdiameter te kwantificeren. Maak eerst een maximale intensiteitsprojectie van de Z-stack en teken vier lijnscans met 45 graden van elkaar over de GFP MOIs en ring. Bereken vervolgens de diameter van de ring als de gemiddelde piek-topafstand van de vier scans voor ringen die zijn gesloten.De diameter wordt gedefinieerd als nul O laser of naaldwonden veroorzaakt een snelle en aanhoudende stijging van de epidermale calciumniveaus zoals gevisualiseerd door de calciumsensor G camp. Een laterale weergave van de epidermis in het voorste lichaam toont de laserwond gemarkeerd met een X en N DeMars de epidermale nucleair. De calciumstijging verspreidt zich snel vanaf de wondplaats Kwantificering van de calciumniveaus op 2040 en 60 micrometer van één wondplaats helpt deze vroege calciumresponskinet

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video introduceert een methode van laserwonden, die wordt gebruikt om zeer nauwkeurige verwondingen in de wormepidermis te veroorzaken.  Het monsterprotocol is afkomstig van een onderzoek naar wondrespons en herstel.

Epidermale laserwonden: gelokaliseerde schade veroorzaken om reparatieprocessen in C. elegans te onderzoeken

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

Een protocol wordt beschreven dat gebruikt anoxie / uithongering C. elegans model ischemie / reperfusie. Functionele resultaten omvatten een verhoogde mortaliteit, zichtbare afwijkingen in GFP-gelabelde neuronale processen, en verminderde gedragsreacties die neuronale functie nodig hebt.

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.

Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Een niet-invasieve in vivo imaging protocol dat is gestroomlijnd en kosteneffectieve, beschrijven we met behulp van L-012, een chemiluminescentie luminol-analoog, om te visualiseren en te kwantificeren van reactieve zuurstof soorten (ROS) gegenereerd in een excisional wond muismodel.

In Vivo Beeldvorming van reactieve zuurstof soorten in een RattenUitrustingen wond Model

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Hier worden twee murine wondgenezingsmodellen beschreven, een ontworpen om cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties te beoordelen en de andere om de snelheid van wondsluiting te kwantificeren. Deze methoden kunnen worden gebruikt met complexe ziektemodellen zoals diabetes om mechanismen van verschillende aspecten van slechte wondgenezing te bepalen.

Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models.

Wond-geïnduceerde polyploïdie is een geconserveerde weefsel herstel strategie waar cellen groeien in grootte in plaats van te delen om te compenseren voor celverlies. Hier is een gedetailleerd protocol over hoe de fruitvlieg te gebruiken als een model om ploidy en de genetische regulatie in epitheelwond herstel te meten.

Een Drosophila Model om wound-geïnduceerde polyploïdie te bestuderen

Hier demonstreren we een geoptimaliseerde techniek voor het beoordelen van wondherstel met behulp van ex vivo menselijke huid in combinatie met een whole-mount kleuringsbenadering. Deze methodologie biedt een preklinisch platform voor de evaluatie van mogelijke wondtherapieën.

Menselijke Ex vivo wondmodel en whole-mount staining benadering om huidherstel nauwkeurig te evalueren

Dit artikel beschrijft een methode om wonden te creëren in het epitheel van een levende Clytia hemisphaerica medusa en wondgenezing in beeld te brengen met een hoge resolutie in vivo. Daarnaast wordt een techniek gepresenteerd om kleurstoffen en medicijnen te introduceren om signaalprocessen in de epitheelcellen en extracellulaire matrix tijdens wondgenezing te verstoren.

Karakterisering van epitheliale wondgenezing in vivo met behulp van het Cnidarische modelorganisme Clytia hemisphaerica

Leer methoden voor huidverwondingen en wondreacties in C. elegans. Deze technieken met micro-injectienaald en laser beelden calciumsignalen en actine-ringvorming af om epitheliale wondgenezing te bestuderen.

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in C. elegans

Meer video's verkennen