Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Het algemene doel van deze procedure is om op betrouwbare wijze humane THP een macrofagen te transfecteren met een hoge celviabiliteit en geen celactivatie. Dit wordt bereikt door eerst THP een monocyten gedurende 48 uur voor te differentiëren. De tweede stap van de procedure is om de premature TP een macrofagen los te maken.

De derde stap is om de cellen te transfecteren met IRNA of plasmide DNA, met behulp van de nucleo factor technologie van Lonza. De laatste stappen zijn het opnieuw zaaien en verder differentiëren van de cellen. Uiteindelijk kan succesvolle gen-knockdown of overexpressie worden aangetoond door middel van kwantitatieve realtime PCR, Western blot back, enzovoort.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek vergeleken met andere transfectie-aanpakken zoals lipofectie, is dat we hoge transfectie-efficiëntie kunnen bereiken samen met een hoge celviabiliteit, en dat we de functie en het gedrag van macrofagen niet veranderen. Helaas is deze techniek niet geschikt voor hoge sput-toepassingen omdat er geen intenser transfect kan worden uitgevoerd op een tijdstip Voor dit protocol. THP een cellen gekweekt in RPMI 1640 met 10%FCS en met 1%pen strep L glutamine 24 uur vóór de transfectie, splits de cellen en voorzie ze van vers medium.

De volgende dag. Predifferentiëer de cellen door 10 tot 15 miljoen cellen te zaaien in een 75 vierkante centimeter weefselkolf met de volgende toevoegingen aan het aangevulde RPMI-medium, 1%niet-essentiële aminozuren, 1%natriumpyruvaat, 10 nanogram per milliliter, PMA en 50 micromolair bèta mercaptoethanol na 48 uur, aspeer het medium en vervang het door zes milliliter Accutane. Een opgewarmd tot 37 graden Celsius om de cellen los te maken.

Incubeer ze gedurende 30 minuten tijdens de incubatie. Bereid voldoende transfectiemedium en kweekmedium voor voor de post-nucleo-affectie-zorg van de cellen. Controleer na 30 minuten of de cellen losgekomen zijn en er rond uitzien.

Als sommige cellen nog steeds hechten, pomp dan voorzichtig de kolf met een micropipet of gebruik eenvoudige agitatie om ze los te maken. Gebruik geen schraper. Breng de suspensie over in een 15 milliliter buis en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 300 Gs en bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant door aspiratie en suspendeer het cellenpellet.

In één milliliter RPMI-medium voorgewarmd tot 37 graden Celsius, tel de cellen en maak micro verwijderbuisjes met twee tot twee en een half miljoen cellen voor onmiddellijke transfectie. Een snelle uitvoering van dit protocol is essentieel. Om verlies van celdodelijkheid te voorkomen, zorg ervoor dat alle materialen van tevoren zijn voorbereid. Centrifugeer eerst alle transfectie-aliquots gedurende 10 minuten bij 250 GS en bij kamertemperatuur terwijl ze naar beneden draaien, laad alle nucleo effector vets met een halve microgram plasmide DNA of één microgram SI RNA Gebruik zeer geconcentreerde verdunningen zodat ze een minimaal volume van de vet bezetten.

Aspeer nu het supernatant van slechts één van de cel-aliquots resus. Suspensie de cellen tot 100 microliter in nucleo factor oplossing. Laat de cellen niet langer dan 15 minuten blootgesteld aan de oplossing.

Breng de cellen over naar de Q vet en meng ze rond met zachtjes tikken. Transfecteer vervolgens de cellen met behulp van programma Y 0 0 1 op een model twee B nucleo factor. Gebruik een wegwerppipet om de geëlektroporeerde cellen naar een reactiebuis te verplaatsen en voeg onmiddellijk een halve milliliter voorgewaarschuwde transfectiemedium toe aan de cellen.

Herhaal nu het proces met elk afzonderlijk aliquot van cellen tot ze allemaal zijn getransfecteerd. Na het voltooien van de nucleo-affectie, breng elke transfectie van cellen over naar een put van een zesputtenplaat met 2,5 milliliter warm transfectiemedium. Meng elke put grondig met een micropipet.

Laat alle beladen platen vier uur incuberen en controleer vervolgens de status van de cellen onder een microscoop. Na vier uur zouden de meeste cellen aan de plaat moeten hechten, indien nodig. Ten hoogste.

Nog een uur incubatie zal voldoende zijn als je één put tegelijk bewerkt. Aspeer het transfectiemedium van de gehechte cellen en vervang het door een gelijk volume warm kweekmedium. Zorg ervoor dat de cellen niet worden losgemaakt tijdens deze stap.

Incubeer de cellen nu zo lang als nodig is. Vervang indien nodig het medium om de 48 uur en plan om behandelingen toe te passen zodat ze eindigen wanneer het getransfecteerde DNA of RNA zijn piekeffect heeft. Bij het behandelen van de cellen met effectoren, gebruik een serumvrij medium zonder PMA en zonder bèta mercaptoethanol.

Zorg ervoor dat de cellen niet langer dan 24 uur zonder serum worden geïncubeerd. Het protocol werd gebruikt om THP een macrofagen met IRNA te transfecteren, cellulaire morfologie werd beoordeeld. Volgens flowcytometrische meting.

De snelheid van apoptose en necrose in de cellen was laag in zowel getransfecteerde als controle culturen. Echter, zorgvuldige tellingen onthulden dat zowel apoptose als necrose iets hoger waren voor de getransfecteerde monsters. Dit kan zijn omdat getransfecteerde THP een macrofagen moeilijker los te maken waren van platen dan niet-getransfecteerde cellen.

Over het algemeen waren de transfectiepercentages hoger dan 90% zoals geanalyseerd door flowcytometrie. Met behulp van fluorescerende S-I-R-N-A werd de transfectie-efficiëntie ook bevestigd door middel van fluorescentiemicroscopie. De functionaliteit van de transfectie werd aangetoond door genetische knockdown van IL 10 RB expressie.

Gebruik kort interfererend RNA Eenmaal onder de knie, kan de transfectie in één tot anderhalf uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat het kweekmedium aanzienlijke invloed heeft op de prestaties. Dit wordt beschreven in het tekstprotocol.