Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus
November 30th, 2014
RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.
Het algemene doel van het volgende experiment is om transcriptionele componenten van de fotoperiodische diapause-respons te identificeren. Bij een non-model-mug eighties elbow pictus, wordt dit bereikt door eerst biologisch gerepliceerde monsters van diapause- en non-diapause-eieren te produceren via verschillende fotoperiodische behandelingen. Als tweede stap wordt RNA uit elk replicuur geëxtraheerd voor high-throughput RNA-sequencing.
De RNA-sequenties worden vervolgens computationeel verwerkt om ze samen te stellen in congs en om ze te annotereren. Uiteindelijk kunnen variaties in de genexpressie als reactie op diapause-inducerende versus niet-diapause-inducerende fotoperioden worden afgeleid van Reeds MAP naar de RNA-assemblage. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microray-analyse, is dat een voorafgaande genetische bron, zoals de genoomsequentie of een microarray, niet vereist is om globale schattingen van genexpressie als reactie op diapause-condities te verkrijgen.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van ecologische genomica te beantwoorden, zoals wat de transcriptionele basis is van DPO's of andere belangrijke ecologische aanpassingen bij non-model organismen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat het moeilijk kan zijn om voldoende hoeveelheden diapause- en non-DPO's-eieren te verkrijgen en de downstream bio-informatica-analyse kan een uitdaging zijn. We kregen het idee voor deze methode toen we merkten dat high-throughput DNA-sequencingtechnologieën goedkoper werden en een tractabele methode boden voor het verkrijgen van whole-genome expressieprofielen in non-model organismen voordat we met de procedure begonnen.
Stel twee fotoperiodekasten in met programmeerbare verlichting op 21 graden Celsius voor optimale diapause-expressie en ongeveer 80% relatieve luchtvochtigheid. Programmeer een kas voor een niet-diapause-inducerende fotoperiode met een 16 acht lichtdonkercyclus en de andere voor een diapause-inducerende acht 16 lichtdonkercyclus met de verlichting op hetzelfde tijdstip voor beide kasten om de circadiane tijd tussen de fotoperioden te synchroniseren. Dompel vervolgens eierpapieren voor het juiste aantal eieren onder in 500 milliliter gedeïoniseerd water en voeg een milliliter gezeefde hondenvoer en pekelgarnalenvoedingsslurry toe. Bedek de container met gaas en plaats een rubberen band rond het gaas om het op zijn plaats te houden.
Breng vervolgens de eieren in de 16 acht lichtdonker lange dag fotoperiode kas ongeveer 24 uur onder. Breng de volgende dag ongeveer 30 uitgekomen larven per groep over naar individuele 10 bij 10 bij twee centimeter petrischalen gevuld met 90 milliliter gedeïoniseerd water. Elke 48 tot 72 uur brengt u de larven over naar een schone schaal en voedt u ze bij elke overbrenging met verse voedingsslurry.
Na ongeveer zes dagen bekleedt u de bodem van drie tot vier volwassen kooien voor elke fotoperiodebehandeling met nat filterpapier en bevochtigt u het filterpapier met voldoende gedeïoniseerd water om de lokale luchtvochtigheid in de kooi te verhogen zonder dat er staand water ontstaat. Noteer de fotoperiode, replicaatnummer, startdatum van de kooi en andere voor het experiment relevante informatie met permanente marker op de zijkant van de kooi. Breng vervolgens elke twee dagen gedurende 10 dagen de puy over in kleine kopjes schoon water op niet meer dan 50 puy per 25 milliliter water in de geschikte volwassen kooien voor het experiment en plaats organische rozijnen op het bovenste gaas van de kooi om suiker te bieden voor de opgekomen volwassenen Om oöpositionering te stimuleren vier tot vijf dagen na de eerste bloedmaaltijd, vult u donkergekleurde 50 milliliter bekers, bekleed met een getextureerde niet-gebleekt papieren handdoek, voor de helft met gedeïoniseerd water en plaatst u één beker in elke kooi om de eieren te verzamelen en op te slaan.
Vervang de eierpapieren in elke kooi door vers papier en plaats de recent verwijderde papieren in petrischalen en bewaar ze in de acht 16 lichtdonker korte dag fotoperiode kas om verwarrende effecten op de eieropslag te voorkomen. Ongeveer 48 uur na de verzameling, droogt u de eierpapieren in de open lucht zodat ze slap en licht vochtig aanvoelen, maar niet zo nat dat de papieren donker zijn van water of het uitkomen stimuleren. Om de diapause-incidenten te meten, noteert u het aantal eieren op elk eierpapier.
Dompel vervolgens de afzonderlijke papieren volledig onder in een 90 milliliter petrischaal met ongeveer 80 milliliter gedeïoniseerd water. Voeg ongeveer 0,25 milliliter voedingsslurry toe om hun uitkomen te stimuleren en breng de petrischaal na 24 uur over op een zwart oppervlak. Plaats nu een lichtbron aan één kant van de, de larven zullen zich van het licht afwenden, waardoor een duidelijke telling van de individuele eerste sterlarven mogelijk is.
Gebruik een pipette om elk larve na het tellen te verwijderen om hertelling van individuen te voorkomen. Plaats vervolgens de eierpapieren in een nieuwe petrischaal om opnieuw te drogen. Na het tellen van een tweede batch uitgekomen larven een week later, plaatst u de eierpapieren met de resterende onuitgekomen eieren in nieuwe 90 milliliter petrischalen met ongeveer 80 milliliter verse bleekvloeistof, waarbij u ervoor zorgt dat de papieren volledig in de bleekvloeistof zijn ondergedompeld.
Laat de papieren een nacht onder een afzuigkap en gebruik de volgende dag een lichtmicroscoop om het aantal onuitgekomen eieren te tellen. Als een ei embryonair is, zal het een ivoorkleurige kleur vertonen met de ogen die als twee kleine zwarte stippen tegenover elkaar op de dorsale zijde verschijnen. Om te beginnen, reinigt u zorgvuldig de werkbank met RNA-decontaminatieoplossing om eventuele resterende nucleasen te verwijderen en RNA-degradatie te voorkomen.
Gebruik vervolgens een kamelharen borstel om minstens 400 muggeneieren met zich ontwikkelende embryo's op het ontwikkelingstijdstip te borstelen. Punt van belang in glazen molens. Voeg in een afzuigkap een milliliter triol toe en maal de eieren tot ze volledig verpulverd zijn en voer vervolgens de RNA-extractie in
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het identificeren van differentieel tot expressie gebrachte genen in Aedes albopictus muggen tijdens diapause en niet-diapause toestanden. De aanpak omvat het kweken van muggen onder verschillende fotoperioden, gevolgd door RNA-extractie en high-throughput sequencing om genexpressie variaties te analyseren.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomiek
- Ecologie
Achtergrond
- Diapause is een cruciale adaptieve eigenschap bij veel organismen.
- Aedes albopictus is een niet-modelorganisme met een significant ecologisch effect.
- RNA-Seq is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van genexpressie zonder voorafgaande genetische bronnen.
- Het begrijpen van genexpressie in reactie op omgevingssignalen kan ecologische en evolutionaire studies informeren.
Doel van Studie
- Om transcriptionele componenten van de fotoperiodische diapause respons te identificeren.
- Om genexpressie te vergelijken tussen diapause en niet-diapause toestanden.
- Om het begrip van adaptieve eigenschappen in niet-modelorganismen te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Biologisch gerepliceerde monsters van diapause en niet-diapause eieren werden geproduceerd.
- RNA werd uit elke replicatie geëxtraheerd voor sequencing.
- High-throughput RNA sequencing werd uitgevoerd.
- Computationele verwerking werd gebruikt om RNA-sequenties te assembleren en te annoteren.
Belangrijkste Resultaten
- Variaties in genexpressie werden geïdentificeerd in reactie op verschillende fotoperioden.
- De studie toonde de effectiviteit van RNA-Seq in niet-modelorganismen aan.
- Inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diapause werden verkregen.
- Resultaten kunnen toekomstig onderzoek naar adaptieve eigenschappen bij andere soorten informeren.
Conclusies
- RNA-Seq is een waardevolle methode voor het bestuderen van genexpressie in niet-modelorganismen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van adaptieve eigenschappen gerelateerd aan omgevingsveranderingen.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere soorten die voor soortgelijke ecologische uitdagingen staan.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables target validation in non-model organisms by linking environmental cues to transcriptional responses, supporting mechanistic de-risking in early discovery. It provides a scalable approach for phenotypic screening of adaptive traits without requiring prior genomic resources, reducing dependency on model systems. The workflow supports predictive confidence in target identification by isolating photoperiod as an independent variable and measuring gene expression as a quantitative dependent variable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to environmental stimuli for target hypothesis testing.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying genes differentially expressed in diapause versus non-diapause states.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking photoperiodic treatment to measurable transcriptional outputs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems (diapause and non-diapause eggs) for downstream compound screening.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducible high-throughput sequencing.
- Scalability: Enables platform reuse across mosquito species and life history traits with modest protocol adjustments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase gene expression findings to phenotypic outcomes like developmental arrest and metabolic suppression.
- Mechanistic De-risking: Identifies transcriptional networks underlying diapause, informing biomarker selection for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for differential expression (e.g., 3,128 DEGs across timepoints).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly for targets involved in environmental sensing and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating photoperiod as an independent variable and measuring transcriptional changes as dependent variables.
- Screening: Enables assay readiness through standardized rearing, diapause induction, and RNA quality control steps.
- Analytics: Generates quantitative gene expression measurements (e.g., contig assembly, differential expression) that allow cross-condition comparison.
- Translational Research: Links transcriptional changes to phenotypic diapause outcomes, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other mosquitoes and ecological traits, promoting platform-level investment over single-use assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in environmental response pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through biologically replicated samples and standardized RNA extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening in non-model organisms without prior genome investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing transcriptional evidence for target advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, photoperiod control, and RNA handling under RNase-free conditions.
- Depends on access to Illumina sequencers and computational infrastructure for de novo transcriptome assembly and annotation.
- Necessitates cross-team standardization between entomology, molecular biology, and bioinformatics groups.
- Requires adaptation of diapause induction conditions (e.g., light:dark cycles, temperature) for different species or strains.
- Practical limitations include the time-intensive nature of diapause induction (6–8 months) and challenges in obtaining sufficient diapause egg yields.
