Name: Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Verken RNA-seq analyse van fotoperiodische diapauze in Aedes albopictus. Dit protocol combineert experimentele opzet met bio-informatica om genexpressie te bestuderen zonder referentiegenoom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie 5R21AI081041-02 en Georgetown University.

1. opkweek van larven van Two A. albopictus Groepen naar volwassenheid <ol><li> Stel twee fotoperiode kasten met programmeerbare verlichting bij 21 ° C voor optimale expressie diapause 16 en circa 80% relatieve vochtigheid. <ol><li> Programma een kast voor een 16L: 8D licht: donker cyclus (een niet-diapause inducerende LD fotoperiode). Stel de tweede kast voor een 8L: 16D licht: donker cyclus (diapause inducerende) 13. </li><li> &#39;Lichten aan&#39; programma op hetzelfde moment in beide kasten te circadiane tijd tussen fotoperiodiciteit synchroniseren. </li></ol></li><li> Bereken de hoeveelheid eieren die nodig zijn om het experiment uit te voeren. Streven naar 300-500 eieren per kooi. Ten minste drie repliceren diapause kooien en drie repliceren niet diapause kooien zijn nodig voor RNA genereren. Deze totalen op 1,800-3,000 eieren per experiment ca.. <ol><li> Luik van de eieren door onderdompeling ei papers in ca. 500 ml gedemineraliseerd H 2 O. </li><li> Voeg &lt;em&gt; ca. 1 ml voedsel slurry bestaande uit begane hondenvoer en pekelgarnalen zoals eerder beschreven 24. Bedek container met gaas, en houden het gaas op zijn plaats met een rubberen band. </li><li> Plaatsen in de LD fotoperiode kast voor ca. 24 uur. </li></ol></li><li> Overdracht uitgekomen larven 10 x 10 x 2 cm petrischalen gevuld met ongeveer 90 ml gedeïoniseerd H2O <ol><li> Onderhouden ca. 30 larven per gerecht. Transfer larven te reinigen gerechten elke 48-72 uur, bijvoorbeeld elke maandag, woensdag en vrijdag (MWF) 24. </li><li> Feed ca. 1 ml voedsel slurry bestaande uit begane hondenvoer en artemia in gedeïoniseerd water om de MWF zoals eerder beschreven 24. </li></ol></li><li> Opgezet 3-4 volwassen kooien voor elk fotoperiode behandeling, waarbij elke kooi bestaat uit een biologische repliceren. <ol><li> Van weerszijden van 9,5 L emmers, uitgesneden een 10-by-14 cm gat, en een ander gat met een diameter van 15 cm. CoVer de eerste met gaas. Knip ongeveer een voetlengte van orthopedische kous en plak ene uiteinde rond de binnenkant van de andere opening. </li><li> Snijd het voeteneinde van de kous af en knoop shut - geopend wanneer toegang tot het inwendige van de kooi nodig. Voor de kooi deksel, knip alle van het interieur, waardoor alleen de velg, en vervang het interieur plastic met gaas 24. </li><li> Let op de fotoperiode, repliceren nummer, kooi startdatum, en andere informatie om het experiment met een permanent marker op de zijkant van de kooi relevant. </li></ol></li><li> Lijn de onderkant van de volwassen kooien met natte filtreerpapier. Bevochtig het filter papier met genoeg gedeïoniseerd H 2 O aan lokale luchtvochtigheid te verhogen in de kooi, maar vermijd stilstaand water, die ovipositie kan stimuleren op het filterpapier 24. Controleer het filterpapier dagelijks drogen, opnieuw nat indien nodig. </li><li> Om voldoende eieren te produceren voor een RNA-bibliotheek, ten minste 100 wijfjes / 9.5 L cage, met niet meer dan 500 muggen per kooi. </li><li> Verzamel poppen MWF en plaats in een klein kopje schone H 2 O in een dichtheid van niet meer dan 50 poppen per 25 ml H 2 O. Breng de poppen beker aan een volwassene kooi. Plaats kooien in de respectieve fotoperiode kabinet - A. albopictus poppen zijn lichtgevoelige 15. </li><li> Dagelijkse zorgen dat H 2 O in de cups is schoon en helder, en het verwijderen van dode poppen, omdat ophoping van dode poppen massale sterfte kan veroorzaken. Verwijder H 2 O kopjes na alle poppen te voorschijn komen. </li><li> Plaats biologische rozijnen op de top gaas van de kooi aan suiker voor voortgekomen volwassenen. Monitor rozijnen, en elke 3-5 dagen te veranderen hen om schimmel stapeling te voorkomen. </li></ol> 2. Onderhoud van volwassenen aan het Koppelen en eieren toestaan <ol><li> Handhaaf kooien bij hoge luchtvochtigheid (ong. 80%) door langs de kooi bodem met een vochtig filtreerpapier, en toegang tot niet- beschimmelde rozijnen, zoals hierboven beschreven (sections 1.5 en 1.9). </li></ol> 3. Bloed van borstvoeding <ol><li> Bereid bloed toevoer vrouwen tussen 2-6 dagen na verpopping opdat vrouwen zijn blootgesteld aan ten minste acht ondubbelzinnige korte dagen vóór het leggen van eitjes begint bijna 100% diapause eieren 14. </li><li> Bereid de Hemotek Membrane Feeding systeem. Steek het voeden van eenheden in de voeding. Regel de temperatuur van elke eenheid tot 37 ° C met stelschroef. Gebruik een elektronische thermometer en sonde naar de temperatuur van de toevoereenheid tijdens de kalibratie te meten. </li><li> Bereid de maaltijd reservoir. Strek een vierkant van collageen voeden membraan over de opening van de maaltijd reservoir en zet hem vast met een O-ring. Trek de hoeken om rimpels te verwijderen zorgvuldig; trim de overtollige membraan met een schaar. OPMERKING: kan Collageen membraan niet goed werken voor alle soorten muggen, en het kan nodig zijn om verschillende soorten trachten de optimale membraan vinden als het werken met eenanders dan A. species albopictus. Parafilm werkt goed met Culex pipiens. <ol><li> Indien bloed wordt opgeslagen bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. </li><li> Houd het reservoir, zodat het membraan naar beneden is gericht, worden niet ondersteund, en de vulopeningen naar boven. Gebruik een pipet of een spuit aan het reservoir te vullen met ongeveer 3 ml volbloed uit kippen die natriumcitraat heeft als een anti-stollingsmiddel. Verzegelen vulopeningen met plastic pluggen. </li></ol></li><li> Bevestig het bereid reservoir naar de feeder door te schroeven op de nok van de warmteoverdracht plaat op de bodem van de feeder. Keer de feeder en plaats het op de top van de kooi, membraan naar beneden, zodat de muggen kunnen voeden door het gaas van de kooi. Houd de feeder op de kooi ongeveer 45 min voedering maximaliseren. </li></ol> 4. Stimuleer Ovipositie <ol><li> Vier tot vijf dagen na het bloedmeel, uitrusten elke kooi met een donker gekleurde 50 ml cbekleed met ongebleekt zaadontkieming papier (ei papier) of structuur niet gebleekt papier handdoek en vul de helft met gedemineraliseerd water 9. Indien meer dan 250 muggen in een kooi, gebruikt twee kopjes. OPMERKING: Voor kleine kooien of single-vrouw flacons, kan &quot;hooi infuus&quot; in ovipositie containers ovipositie toenemen als gevolg van de geur van de microbiële flora 25. </li></ol> 5. Verzamel en Store Eieren <ol><li> Aanvangen eierverzameling binnen 4-5 dagen bloed geeft, omdat de productie van eieren piekt meestal ongeveer vijf dagen na het bloed voeden, en dan zakt de komende week. </li><li> Variëren eierverzameling frequentie op behoeften van het experiment. Voor algemene doeleinden, verzamelen ei papers over een MWF schema. Verwijder ei papers uit elke kooi en te vervangen door nieuw papier. Plaats onlangs verwijderd papieren in petrischaaltjes en op te slaan in SD fotoperiode kabinet om verstorende effecten van ei opslag te vermijden. </li><li> Laat ei papieren om opnieuw<html> belangrijkste nat voor 2 dagen na het leggen van eitjes te serosale cuticula vorming, die ei verdroging weerstand 26 verhoogt mogelijk te maken. </li><li> Ongeveer 48 uur na inzameling, droge eieren in de open lucht. Droog het papier zodanig dat het slap en licht vochtig aanvoelt, maar niet zo nat dat het papier is donker van H 2 O of stimuleert het uitbroeden van de eieren. OPMERKING: een 6.5 &quot;x 4&quot; papier kan ongeveer 3,5 uur duren om te drogen. Wees voorzichtig niet te over-droog ei papers, omdat dit zal resulteren in ei verdroging 27. </li><li> Extra reserve eieren van zowel LD en SD fotoperiodiciteit om diapause incidentie te beoordelen en de fotoperiodische effect (zie Meten diapause, hoofdstuk 6). </li><li> Voor de lange termijn opslag, houden ei papieren bij 21 ° C en ongeveer 80% vochtigheid in petrischaaltjes. Houd petrischalen in een Tupperware opslaghouder met een fles water plaatselijke vochtigheidsgraad te handhaven embryonale ontwikkeling vindt 4-5 dagen bij 21 ° C. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Meet diapause Incidentie <ol><li> Gebruik extra gereserveerd embryo&#39;s (zie Stimuleer Ovipositie, hoofdstuk 4) die 7-20 dagen oud aan het diapause reactie te kwantificeren zijn. </li><li> Noteer het aantal eieren aanwezig op elk ei papier. </li><li> Stimuleer eieren uit te broeden door het volledig onder te dompelen individuele ei papieren in een 90 ml petrischaal met ongeveer 80 ml ​​gedeïoniseerd H 2 O. Voeg ongeveer 0,25 ml voedsel drijfmest. </li><li> Na 24 uur tally het aantal larven gearceerde eerste instar. Plaats de petrischaal op een zwarte ondergrond larven visualiseren en plaats een lichtbron aan één zijde van de schaal. Larven af ​​te stappen van de lichtbron, waardoor een duidelijke aantekening van individuele larven. Verwijder individuele larven met een pipet, terwijl het tellen te voorkomen vertellen individuele larven. </li><li> Plaats ei papieren in een nieuwe petrischaal en opnieuw droog. Re-hatch eieren na ~ 1 week en opnieuw tally eieren uitgebroed met behulp van de bovenstaande methode. </li><li> Plaats ei papieren met de resterende u<html> n-uitgebroede eieren in nieuwe 90 ml Petrischalen met ongeveer 80 ml ​​bleeksop 28. Zorg ervoor dat het ei papieren volledig worden ondergedompeld in het bleken oplossing en laat onder een zuurkast &#39;s nachts om de geur van bleekwater te voorkomen. Opmerking bleken oplossing kan worden bewaard ~ 1 week bij 4 ° C, maar moet verder worden vers gemaakt. </li><li> Inspecteer de eieren met behulp van een lichtmicroscoop als het bleken zal het chorion wissen en visualisatie van bevruchte, niet-uitgekomen eieren. Wanneer het bevruchte ei wordt het ei een gebroken witte kleur met ogen die als twee kleine zwarte stippen tegenover elkaar op de dorsale zijde. Tally het aantal niet-uitgekomen, bebroede eieren 13. </li><li> Bepaal diapause incidentie met de volgende formule:% diapause = geen. bebroede un-uitgebroede eieren / (no. uitgebroede eieren + no. bebroede un-uitgebroede eieren) x 100 13. </li></ol> 7. RNA-extractie uit Eieren / pharate Larven NHOUD &quot;&gt; LET OP: Gebruik Trizol in een laminaire stroming kap. <ol><li> Borstel mug eieren met de ontwikkeling van embryo&#39;s of pharate larven op verschillende tijdstippen ontwikkeling van ei papieren om glas slijpmachines met behulp van een kameel-borstel. Maal de eieren in Trizol (1 ml per 50-100 mg weefsel) tot het volledig verpulverd. Gebruik minimaal 400 eieren per bibliotheek voldoende RNA verkregen. <ol><li> Alternatief snap bevriezen eieren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C in microcentrifuge buisjes tot een maand voor malen in Trizol. </li></ol></li><li> Voer RNA extractie Trizol gevolgd door isopropanol precipitatie volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Behandel de bank met RNase decontaminatie-oplossing of andere middelen om eventuele resten nucleases verwijderen om RNA degradatie te voorkomen. <ol><li> Behandel de geëxtraheerde RNA met DNase. Volgens de instructies van de fabrikant, incubeer de RNA monsters met DNase gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gebruik 1 &amp; #181, l DNase tot 10 ug RNA in 50 pl reactie. Verhoog de hoeveelheid DNase als er meer dan 10 ug RNA in één reactie. </li><li> DNase inactiveren door toevoeging van 5 pi gesuspendeerd DNase inactivatie reagens. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur mengen driemaal in incubatieperiode (zacht vortexen). </li><li> Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1,5 min. Breng het supernatant dat het behandelde RNA monsters verse buizen voor daaropvolgende stappen. </li></ol></li><li> Beoordeel de kwaliteit van de totale RNA monsters door fluorometrie. Stuur de monsters naar een specialiteit faciliteit met de juiste instrument voor deze taak. De faciliteit zal on-chip gelelektroforese uit te voeren om de grootte van de RNA-soorten in het monster, gevisualiseerd door fluorescerende kleurstof ingeprent in de chip te bepalen. De resultaten zullen worden geretourneerd als een elektroferogram. <ol><li> Bepaal de integriteit van totaal RNA monsters door de aanwezigheid of afwezigheid van afbraakproducten, zoals blijkt uit de aanwezigheid of pieken tussen het 18S en 5S ribosomale RNA pieken op het verkregen elektroferogram (Figuur 1B). </li></ol></li></ol> 8. RNA Sequencing <ol><li> Stuur totaal RNA monsters met een voldoende hoge kwaliteit (Figuur 1A) en hoeveelheid (meestal&gt; 3 ug per bibliotheek) naar een commercieel sequencing centrum voor de bouw van verrijkte gepaarde-end mRNA bibliotheken en mRNA sequencing, volgende standaard protocollen. </li><li> Indien meer dan één rijstrook wordt gebruikt voor het sequentiëren van een enkel experiment, opgesplitst in twee afzonderlijke bibliotheken rijstroken voor sequencing te verantwoorden technische variatie tussen lanen tijdens sequencing. </li></ol> 9. lllumina lezen Cleaning OPMERKING: Figuur 2 geeft een overzicht van de bioinformatica deel van dit protocol. Voor een volledige lijst van alle programma&#39;s en middelen gebruikt in de sectie bioinformatica van dit protocol, zie tabel 1. InDaarnaast Aanvullende Bestand 1 bevat command line voorbeelden voor elk van de volgende bioinformatica protocol stappen. <ol><li> Gebruik ssaha2 29 (tabel 1) groepjes van 95% identiteit of hoger identificeren de NCBI UniVec Core database (tabel 1), A. albopictus rRNA sequentie (GenBank # L22060.1), en sequencing adapters (gedetailleerde command-line voorbeelden in Aanvullende File 1). Verwijder gelezen paren met lucifers Perl of soortgelijk scriptingtool, bijvoorbeeld door aanpassing van het ontvangen Perl-script (Supplemental bestanden 2). </li><li> Schoon resterende leest met de SolexaQA pakket 30 (tabel 1; Aanvullende Bestand 1): trimmen regio&#39;s met een phred score equivalent van minder dan 20 met de standaardinstellingen van DynamicTrim.pl. <ol><li> Verwijder leest korter dan 25 bp met LengthSort.pl op zowel vooruit als achteruit tegelijk leest. Evalueer de kwaliteit van de gereinigde fastq bestanden met FastQC (Tabel 1 </strong&gt;) - in het bijzonder nagegaan dat de volgorde kwaliteit per-basis en de per-sequence kwaliteit scores zijn boven de 20. </li></ol></li></ol> 10. Digitale Normalisatie <ol><li> Voer een ronde van digitale normalisatie op het gereinigde leest met behulp van de khmer gereedschap 31 (tabel 1; Aanvullende File 1), in het bijzonder normalize-by-median.py (met behulp van k-mer grootte 20, een dekking cut-off van 20, en x = 1e10). </li><li> Als alternatief, als een machine met een hoge RAM beschikbaar is (honderden gigabytes), gebruik Trinity&#39;s normalize_by_kmer_coverage.pl script (tabel 1). </li></ol> 11. De Novo Transcriptome Vergadering <ol><li> Verkrijg toegang tot een computer of computer-cluster met 256 Gb RAM en CPU 24, afhankelijk van de grootte van het samenstel. </li><li> Gebruik Trinity 32 (Tabel 1; Supplemental bestanden 1) aan de digitaal genormaliseerde leesverzameling in contigs monteren. Te verminderengeheugengebruik, gebruiken --min_kmer_cov 2. </li></ol> 12. Vergadering Evaluatie <ol><li> Ren assemblathon_stats.pl uit de Assemblathon2 project 33 op de Drie-eenheid aaneengesloten uitgang. Dit script voert eenvoudige berekeningen te evalueren assemblage kwaliteit relevant, zoals het aantal steigers, N50, assemblage samenstelling, en meer (tabel 1; Aanvullende File 1). </li></ol> 13. Annotatie van de Gemonteerd Transcriptome <ol><li> Voeren BLASTX (tabel 1) van het geheel tegen een referentie-eiwit vast te stellen; voor muggen, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens en Aedes aegypti zijn geschikt gevonden. Specifiek, formatteer het referentie-eiwit fasta bestand voor ontploffing, gevolgd door blastx (Aanvullende File 1). </li></ol> 14. Kaart Leest aan de Vergadering Met behulp RSEM 34 (tabel 1) <ol><li> Een &quot;transcript naar gen-map&quot; file, waarbij deeerste kolom bevat de referentie-gen-id&#39;s, en de tweede kolom de aaneengesloten ID&#39;s. In een spreadsheet editor, wisselen de eerste en de tweede kolom van de BLASTX uitgang, en schrijf deze kolommen naar een .txt bestand. Gebruik de linebreak programma om regeleinden om te zetten in het resulterende .txt bestand naar Unix formaat. </li><li> Maak een verwijzing dataset van de transcriptome fasta bestand met de rsem-bereiden-referentie-script, mits in de RSEM pakket (Aanvullende File 1). </li><li> Afzonderlijk Bereken de expressie waarden voor elke bibliotheek met behulp van de rsem-berekenen-expressie opdracht, op voorwaarde dat in de RSEM pakket (Aanvullende File 1). Zoals leest, gebruik dan de gepaarde fastq bestanden als gevolg van de read-reiniging stap (stap 9.2). <ol><li> Als RNA uit een biologisch repliceren opgesplitst in twee rijstroken voor sequencing, zowel fastq bestanden in de expressie te brengen naar een enkel bestand te genereren. </li></ol></li><li> Zet de expressieresultaten van elke bibliotheek een matrix gemakkelijk verwerkt door andere programs met de meegeleverde script rsem-genereren-data-matrix, die in de RSEM pakket (Aanvullende File 1). </li></ol> 15. differentiële expressie Analyse <ol><li> Installeer R en Edger (tabel 1). </li><li> Gebruik read.delim de RSEM resultaten van stap 14.3 (Aanvullende File 1) laden. Indien nodig, rond de graven op het dichtstbijzijnde gehele getal. OPMERKING: De Edger gids beveelt het beperken van de dataset aan genen met hoog genoeg uitdrukking aan betekenis te detecteren. </li><li> Om de gegevens voor edger formatteren, het genereren van een DGEList object uit de geladen databestand (Aanvullende File 1). Dan, normaliseren van de gegevens met behulp van TMM normalisatie (Aanvullende File 1). Schat de gemeenschappelijke en tagwise dispersies van de gegevens (Aanvullende File 1). </li><li> Identificeren van differentieel tot expressie genen met een Benjamini-Hochberg gecorrigeerde p-waarde &lt;0,05 (Aanvullende File 1). Plot de verdeling van log-voudige-verandering versus overvloed (Aanvullende File 1). </li></ol>

<ol><li>Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+of+gene+expression+in+extreme+cold+-+reference+transcriptome+for+the+high-Antarctic+cryopelagic+notothenioid+fish+Pagothenia+borchgrevinki%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki.</a> BMC Genomics. 14, 634(2013).</li>
<li>Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+divergence+during+speciation+driven+by+adaptation+to+altitude%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude.</a> Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).</li>
<li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympatric+ecological+speciation+meets+pyrosequencing%3A+sampling+the+transcriptome+of+the+apple+maggot+Rhagoletis+pomonella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella.</a> BMC Genomics. 10, 633(2009).</li>
<li>Barshis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+basis+for+coral+resilience+to+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genomic basis for coral resilience to climate change.</a> P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).</li>
<li>Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+element+of+the+diapause+program+in+the+Asian+tiger+mosquito%2C+Aedes+albopictus%2C+identified+by+suppressive+subtractive+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization.</a> J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+duck+genome+and+transcriptome+provide+insight+into+an+avian+influenza+virus+reservoir+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species.</a> Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).</li>
<li>Sessions, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+transcriptome+profile+during+wild-type+and+attenuated+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).</li>
<li>Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+reveals+complex+mechanisms+of+diapause+preparation+in+the+invasive+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22P.+R.+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus.</a> P. R. Soc B. 280, (2013).</li>
<li>Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+as+a+platform+to+elucidate+molecular+components+of+the+diapause+response+in+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus.</a> Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).</li>
<li>Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+de+novo+transcriptome+of+the+Asian+tiger+mosquito%2C+Aedes+albopictus%2C+to+identify+candidate+transcripts+for+diapause+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation.</a> BMC Genomics. 12, 619(2011).</li>
<li>Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+the+tiger%3A+Global+risk+of+invasion+by+the+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Vector-Borne+Zoonot%22%5BJournal%5D)">Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus.</a> Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).</li>
<li>Lounibos, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasions+by+insect+vectors+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Invasions by insect vectors of human disease.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).</li>
<li>Urbanski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+adaptive+evolution+of+photoperiodic+response+during+invasion+and+range+expansion+across+a+climatic+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient.</a> Am. Nat. 179, 490-500 (2012).</li>
<li>Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+evolution+of+photoperiodic+diapause+in+temperate+and+tropical+invasive+populations+of+Aedes+albopictus+%28Diptera+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).</li>
<li>Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).</li>
<li>Pumpuni, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Factors+influencing+photoperiodic+control+of+egg+diapause+in+Aedes+albopictus+%5B%5D%22">Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]</a>. , (1989).</li>
<li>Wang, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+influence+of+photoperiod+on+egg+diapause+in+Aedes+albopictus+Skuse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomol.+Sinica%22%5BJournal%5D)">Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse.</a> Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).</li>
<li>Sota, T., Mogi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival-time+and+resistance+to+desiccation+of+diapause+and+non-diapause+eggs+of+temperate+Aedes+%28Stegomyia%29+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol.+Exp.+Appl%22%5BJournal%5D)">Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).</li>
<li>Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+profiling+reveals+mechanisms+for+lipid+conservation+during+diapause+in+the+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus.</a> J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).</li>
<li>Andrewartha, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diapause+in+relation+to+the+ecology+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Diapause in relation to the ecology of insects.</a> Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).</li>
<li>Danks, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+Dormancy%3A+An+Ecological+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Survey+of+Canada+%28Terrestrial+Arthropods%29%22%5BJournal%5D)">Insect Dormancy: An Ecological Perspective.</a> Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).</li>
<li>Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Regulation of diapause.</a> Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).</li>
<li>Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).</li>
<li>Armbruster, P. A., Conn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+variation+of+larval+growth+in+North+American+Aedes+albopictus+%28Diptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Culicidae%29.+Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera).</a> Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).</li>
<li>Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+CDC+ovitrap+with+hay+infusions+for+daily+monitoring+of+Aedes+aegypti+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Mosquito+Contr.+Association%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations.</a> J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).</li>
<li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti%3A+presumptive+role+of+the+chitinized+serosal+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle.</a> BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).</li>
<li>Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMunstermann%2C+L+%22The+Molecular+Biology+of+Insect+Disease+Vectors%22">The Molecular Biology of Insect Disease Vectors</a>. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).</li>
<li>Trpis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bleaching+and+decalcifying+method+for+general+use+in+zoology%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoolog%22%5BJournal%5D)">A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology.</a> Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).</li>
<li>Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSAHA%3A+A+fast+search+method+for+large+DNA+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SSAHA: A fast search method for large DNA databases.</a> Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).</li>
<li>Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SolexaQA%3A+At-a-glance+quality+assessment+of+Illumina+second-generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).</li>
<li>Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at:
 
 <a target="_blank" href="http://arxiv.org/abs/1203.4802">http://arxiv.org/abs/1203.4802</a> (2012).</li>
<li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-Seq+data+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome.</a> Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).</li>
<li>Bradnam, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblathon+2%3A+evaluating+de+novo+methods+of+genome+assembly+in+three+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species.</a> GigaScience. 2, 10(2013).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+BN+%22Analytical+Biochemistry+of+Insects%22">Analytical Biochemistry of Insects</a>. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).</li>
<li>Hawley, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Mosq.+Contr.+Assoc%22%5BJournal%5D)">The biology of Aedes albopictus.</a> J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).</li>
<li>Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowling%2C+Z+%22J.+Med+Entomol%22">J. Med Entomol</a>. 50, 764-772 (2013).</li>
<li>Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).</li>
<li>Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dengue+infections+in+mosquitoes+%28A.+aegypti%29+and+infection+phenotype+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination.</a> J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).</li>
<li>Goff, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iPlant+collaborative%3A+cyberinfrastructure+for+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology.</a> Plant Sci. 2 (34), (2011).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).</li>
<li>Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCHIME+improves+sensitivity+and+speed+of+chimera+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.</a> Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).</li>
<li>Goecks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), 86(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol biedt methoden om differentieel tot expressie genen wijten ontdekken geïnduceerde diapause in A. photoperiodically albopictus. Het protocol is van belang omdat het een unieke combinatie van mosquito opfok en bio-informatica technieken om alle experimentele aspecten van een moleculaire fysiologie programma toegankelijk is voor beginnende gebruikers te maken - in het bijzonder voor degenen die zich richt op de fotoperiodische diapause respons. Bestaande methoden, voor zover wij weten, niet z...

Snelle vooruitgang in next-generation sequencing (NGS) technologieën biedt spannende mogelijkheden om de moleculaire basis van een breed scala aan genetisch complexe ecologische aanpassingen te onderzoeken in een grote diversiteit aan niet-modelorganismen1–3. Deze aanpak is uiterst krachtig omdat het een basis legt voor populatie- en functionele genoomstudies van organismen met een bijzonder interessante en/of goed beschreven ecologie of evolutionaire geschiedenis, evenals organismen van praktisch belang, zoals landbouwplagen en ziektevectoren. Daarom leiden NGS-technologieën tot snelle vooruitgang op het gebied van ecologie en hebben ze het potentieel om problemen aan te pakken zoals het begrijpen van de mechanistische basis van biologische reacties op snelle hedendaagse klimaatverandering4, de verspreiding van invasieve soorten5 en gastheer-pathogeeninteracties6,7.
Het buitengewone potentieel van NGS-technologieën voor het beantwoorden van fundamentele en toegepaste vragen in ecologie en evolutionaire biologie is gedeeltelijk te danken aan het feit dat deze benaderingen op elk organisme kunnen worden toegepast tegen een matige kostprijs die haalbaar is voor de meeste onderzoekslaboratoria. Bovendien bieden deze benaderingen genoombrede informatie zonder de vereiste van a priori genetische bronnen zoals een microarray-chip of complete genoomsequentie. Niettemin vereist het maximaliseren van de productiviteit van NGS-experimenten zorgvuldige overweging van experimenteel ontwerp, inclusief kwesties zoals de ontwikkelingstiming en weefselspecificiteit van RNA-bemonstering. Bovendien zijn de technische vaardigheden die vereist zijn om de enorme hoeveelheden gegevens te analyseren die door deze experimenten worden geproduceerd, vaak tot enkele honderden miljoenen DNA-sequentie-lezingen, een bijzondere uitdaging geweest en hebben ze de wijdverbreide implementatie van NGS-benaderingen beperkt.
Recente RNA-Seq-onderzoeken naar de transcriptionele basis van diapause bij de invasieve en medisch belangrijke mug Aedes albopictus bieden een nuttig voorbeeld van enkele van de experimentele protocollen die kunnen worden toegepast om NGS-technologie met succes toe te passen op het bestuderen van de moleculaire basis van een complexe ecologische aanpassing in een niet-modelorganisme8–10. A. albopictus is een zeer invasieve soort die inheems is in Azië, maar onlangs Noord-Amerika, Zuid-Amerika, Europa en Afrika heeft geïnvasieerd11,12. Net als veel gematigde insecten overleven gematigde populaties van A. albopictus de winter door een type dormantie in te gaan dat fotoperiodische diapause wordt genoemd. In A. albopictus leidt blootstelling van poppen en volwassen vrouwtjes aan korte (herfst) daglengtes tot de productie van diapause-eieren waarin embryologische ontwikkeling is voltooid, maar de pharate-larve in het chorion van het ei een ontwikkelingsstilstand ingaat die het ei ongevoelig maakt voor het uitkomen-stimulus15–17. Diapause-eieren zijn beter bestand tegen uitdroging5,18 en bevatten meer totale lipiden19 dan niet-diapause-eieren. Fotoperiodische diapause in A. albopictus is dus een door de moeder gecontroleerde, adaptieve fenotypische plasticiteit die essentieel is voor het overleven van de barre omstandigheden van de winter in gematigde omgevingen. Ondanks de goed begrepen ecologische betekenis van fotoperiodische diapause bij een breed scala aan insecten20,21, is de moleculaire basis van deze cruciale aanpassing niet goed gekenmerkt in welk insect22. In organismen zoals A. albopictus die een embryonale diapause ondergaan in het pharate-larvestadium, blijft het een bijzonder aantrekkelijke uitdaging om te begrijpen hoe het fotoperiodische signaal dat door de moeder wordt ontvangen aan het nageslacht wordt doorgegeven en blijft bestaan gedurende het verloop van de embryonale ontwikkeling om arrestatie in het pharate-larvestadium te veroorzaken.
Dit protocol beschrijft muggenkwekerij, experimenteel ontwerp en bioinformatica-analyses voor NGS-experimenten (transcriptoomsequentie) uitgevoerd om transcriptionele componenten van fotoperiodische diapause in A. albopictus te verduidelijken. Dit protocol kan worden gebruikt voor aanvullende studies van diapause in A. albopictus, kan worden aangepast om diapause in andere nauw verwante soorten te onderzoeken, zoals andere aedine muggen die eidiapause ondergaan23, en is ook meer algemeen relevant voor het toepassen van NGS-benaderingen om de transcriptionele basis van elke complexe aanpassing in elk insect te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Incubator - Model 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Controlled environment room</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/</td></tr><tr><td>Cool Fluorescent bulb</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Petri Dish 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper 20.5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9.5 L Bucket</td><td>Plastican</td><td>Bway Products</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utility Fabric-Mosquito Netting White</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Orthopedic stockings</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>product no. 081420</td></tr><tr><td>Organic Raisins</td><td>Newman's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Oviposition cups (brown)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.</td></tr><tr><td>Recycled Paper Towels</td><td>Seventh Generation</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Modular Mates Square Tupperware Set</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>Glass Grinder</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.</td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution &#8212; this reagent is toxic.</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Place up to 12 RNA samples on one chip.</td></tr><tr><td>Hemotek Membrane Feeder</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>This system&nbsp; provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Digital Thermometer and Probe</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.</td></tr><tr><td>Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 &#176;C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.</td></tr></tbody></table>

een experimentele en bioinformatica protocol voor rna-seq analyses van fotoperiodische diapause in de aziatische tijgermug, aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Fotoperiodische diapauze is een belangrijke aanpassing die individuen in staat stelt om te ontsnappen aan barre seizoensomstandigheden via een reeks fysiologische veranderingen, met name ontwikkelingsarrestatie en verminderde stofwisseling. Wereldwijd genexpressieprofiel via RNA-Seq kan belangrijke inzichten bieden in de transcriptionele mechanismen van fotoperiodische diapauze. De Aziatische tijgermug, Aedes albopictus, is een uitstekend organisme voor het bestuderen van de transcriptionele basis van diapauze vanwege zijn gemakkelijke opvoeding, gemakkelijk geïnduceerde diapauze en de beschikbare genomische bronnen. Dit manuscript presenteert een algemene experimentele workflow voor het identificeren van door diapauze geïnduceerde transcriptionele verschillen in A. albopictus. Opvoedingstechnieken, voorwaarden die nodig zijn om diapauze en niet-diapauze ontwikkeling te induceren, methoden om het percentage diapauze in een populatie te schatten, en RNA-extractie en integriteitsbeoordeling voor muggen worden gedocumenteerd. Een workflow om RNA-Seq-gegevens van Illumina-sequencers te verwerken, culmineert in een lijst van differentieel tot expressie gebrachte genen. De representatieve resultaten laten zien dat dit protocol kan worden gebruikt om effectief genen te identificeren die differentieel gereguleerd zijn op transcriptioneel niveau in A. albopictus als gevolg van fotoperiodische verschillen. Met bescheiden aanpassingen kan deze workflow gemakkelijk worden aangepast om de transcriptionele basis van diapauze of andere belangrijke levensgeschiedeniskenmerken in andere muggen te bestuderen.

Fluorometrie twee representatieve RNA monsters vertoonde twee banden bij ongeveer 2000 nt (Figuur 1A, B). Het insect 28S ribosomaal RNA uit twee polynucleotide ketens bijeengehouden door waterstofbindingen, die gemakkelijk worden verstoord door korte verhitting of middelen die waterstofbindingen 35 verstoren. De resulterende twee componenten ongeveer even groot als de 18S ribosomale RNA. De tweede RNA-monster toonde een hoge mate van afbraak (Figuur 1B). <p class="jove_co...

RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om transcriptionele componenten van de fotoperiodische diapause-respons te identificeren. Bij een non-model-mug eighties elbow pictus, wordt dit bereikt door eerst biologisch gerepliceerde monsters van diapause- en non-diapause-eieren te produceren via verschillende fotoperiodische behandelingen. Als tweede stap wordt RNA uit elk replicuur geëxtraheerd voor high-throughput RNA-sequencing.De RNA-sequenties worden vervolgens computationeel verwerkt om ze samen te stellen in congs en om ze te annotereren. Uiteindelijk kunnen variaties in de genexpressie als reactie op diapause-inducerende versus niet-diapause-inducerende fotoperioden worden afgeleid van Reeds MAP naar de RNA-assemblage. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microray-analyse, is dat een voorafgaande genetische bron, zoals de genoomsequentie of een microarray, niet vereist is om globale schattingen van genexpressie als reactie op diapause-condities te verkrijgen.Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van ecologische genomica te beantwoorden, zoals wat de transcriptionele basis is van DPO's of andere belangrijke ecologische aanpassingen bij non-model organismen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat het moeilijk kan zijn om voldoende hoeveelheden diapause- en non-DPO's-eieren te verkrijgen en de downstream bio-informatica-analyse kan een uitdaging zijn. We kregen het idee voor deze methode toen we merkten dat high-throughput DNA-sequencingtechnologieën goedkoper werden en een tractabele methode boden voor het verkrijgen van whole-genome expressieprofielen in non-model organismen voordat we met de procedure begonnen.Stel twee fotoperiodekasten in met programmeerbare verlichting op 21 graden Celsius voor optimale diapause-expressie en ongeveer 80% relatieve luchtvochtigheid. Programmeer een kas voor een niet-diapause-inducerende fotoperiode met een 16 acht lichtdonkercyclus en de andere voor een diapause-inducerende acht 16 lichtdonkercyclus met de verlichting op hetzelfde tijdstip voor beide kasten om de circadiane tijd tussen de fotoperioden te synchroniseren. Dompel vervolgens eierpapieren voor het juiste aantal eieren onder in 500 milliliter gedeïoniseerd water en voeg een milliliter gezeefde hondenvoer en pekelgarnalenvoedingsslurry toe. Bedek de container met gaas en plaats een rubberen band rond het gaas om het op zijn plaats te houden.Breng vervolgens de eieren in de 16 acht lichtdonker lange dag fotoperiode kas ongeveer 24 uur onder. Breng de volgende dag ongeveer 30 uitgekomen larven per groep over naar individuele 10 bij 10 bij twee centimeter petrischalen gevuld met 90 milliliter gedeïoniseerd water. Elke 48 tot 72 uur brengt u de larven over naar een schone schaal en voedt u ze bij elke overbrenging met verse voedingsslurry.Na ongeveer zes dagen bekleedt u de bodem van drie tot vier volwassen kooien voor elke fotoperiodebehandeling met nat filterpapier en bevochtigt u het filterpapier met voldoende gedeïoniseerd water om de lokale luchtvochtigheid in de kooi te verhogen zonder dat er staand water ontstaat. Noteer de fotoperiode, replicaatnummer, startdatum van de kooi en andere voor het experiment relevante informatie met permanente marker op de zijkant van de kooi. Breng vervolgens elke twee dagen gedurende 10 dagen de puy over in kleine kopjes schoon water op niet meer dan 50 puy per 25 milliliter water in de geschikte volwassen kooien voor het experiment en plaats organische rozijnen op het bovenste gaas van de kooi om suiker te bieden voor de opgekomen volwassenen Om oöpositionering te stimuleren vier tot vijf dagen na de eerste bloedmaaltijd, vult u donkergekleurde 50 milliliter bekers, bekleed met een getextureerde niet-gebleekt papieren handdoek, voor de helft met gedeïoniseerd water en plaatst u één beker in elke kooi om de eieren te verzamelen en op te slaan.Vervang de eierpapieren in elke kooi door vers papier en plaats de recent verwijderde papieren in petrischalen en bewaar ze in de acht 16 lichtdonker korte dag fotoperiode kas om verwarrende effecten op de eieropslag te voorkomen. Ongeveer 48 uur na de verzameling, droogt u de eierpapieren in de open lucht zodat ze slap en licht vochtig aanvoelen, maar niet zo nat dat de papieren donker zijn van water of het uitkomen stimuleren. Om de diapause-incidenten te meten, noteert u het aantal eieren op elk eierpapier.Dompel vervolgens de afzonderlijke papieren volledig onder in een 90 milliliter petrischaal met ongeveer 80 milliliter gedeïoniseerd water. Voeg ongeveer 0,25 milliliter voedingsslurry toe om hun uitkomen te stimuleren en breng de petrischaal na 24 uur over op een zwart oppervlak. Plaats nu een lichtbron aan één kant van de, de larven zullen zich van het licht afwenden, waardoor een duidelijke telling van de individuele eerste sterlarven mogelijk is.Gebruik een pipette om elk larve na het tellen te verwijderen om hertelling van individuen te voorkomen. Plaats vervolgens de eierpapieren in een nieuwe petrischaal om opnieuw te drogen. Na het tellen van een tweede batch uitgekomen larven een week later, plaatst u de eierpapieren met de resterende onuitgekomen eieren in nieuwe 90 milliliter petrischalen met ongeveer 80 milliliter verse bleekvloeistof, waarbij u ervoor zorgt dat de papieren volledig in de bleekvloeistof zijn ondergedompeld.Laat de papieren een nacht onder een afzuigkap en gebruik de volgende dag een lichtmicroscoop om het aantal onuitgekomen eieren te tellen. Als een ei embryonair is, zal het een ivoorkleurige kleur vertonen met de ogen die als twee kleine zwarte stippen tegenover elkaar op de dorsale zijde verschijnen. Om te beginnen, reinigt u zorgvuldig de werkbank met RNA-decontaminatieoplossing om eventuele resterende nucleasen te verwijderen en RNA-degradatie te voorkomen.Gebruik vervolgens een kamelharen borstel om minstens 400 muggeneieren met zich ontwikkelende embryo's op het ontwikkelingstijdstip te borstelen. Punt van belang in glazen molens. Voeg in een afzuigkap een milliliter triol toe en maal de eieren tot ze volledig verpulverd zijn en voer vervolgens de RNA-extractie in

an-experimental-bioinformatics-protocol-for-rna-seq-analyses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing...

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

Met twee methodologie om genexpressie in grote smaak aanhangsels van Aedes aegypti, hebben we de set genen vermoedelijk onderliggende neuronale reacties op bitter en afstotende verbindingen geïdentificeerd, zoals bepaald door elektrofysiologische onderzoeken.

Fysiologische Recordings en RNA Sequencing van de Smaak Appendages van de Gele-koorts Mosquito Aedes aegypti

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

IR-TEx verkent transcriptionele profielen van insecticide-resistentie in de soort Anopheles gambiae. Hier vindt u volledige instructies voor het gebruik van de toepassing, wijzigingen voor het verkennen van meerdere Transcriptomic-gegevenssets en het gebruik van het framework om een interactieve database te bouwen voor verzamelingen transcriptomische gegevens van elk organisme, gegenereerd in elk platform.

IR-TEx: een open source data-integratie tool voor Big Data transcriptomics ontworpen voor de malaria vector Anopheles gambiae

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor elektroporatie-gemedieerde RNA interferentie in insecten van de orde Odonata (libellen en jonkvliegen) met behulp van de blauwstaartdamselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) en de pied skimmer libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Elektroporatie-gemedieerde RNA Interferentie Methode in Odonata

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

Het huidige protocol beschrijft de kweekmethode van tortricid plaaginsecten in de laboratoria. De procedures om het geslacht van insecten te onderscheiden en nucleïnezuren te extraheren voor sequencing met hoge doorvoer worden vastgesteld met behulp van twee tortricid-plagen.

Massa-opfok en moleculaire studies in Tortricidae plaaginsecten

Verken RNA-seq analyse van fotoperiodische diapauze in Aedes albopictus. Dit protocol combineert experimentele opzet met bio-informatica om genexpressie te bestuderen zonder referentiegenoom.

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus

Meer video's verkennen