Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus
30 november 2014
RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.
Het algemene doel van het volgende experiment is om transcriptionele componenten van de fotoperiodische diapause-respons te identificeren. Bij een non-model-mug eighties elbow pictus, wordt dit bereikt door eerst biologisch gerepliceerde monsters van diapause- en non-diapause-eieren te produceren via verschillende fotoperiodische behandelingen. Als tweede stap wordt RNA uit elk replicuur geëxtraheerd voor high-throughput RNA-sequencing.
De RNA-sequenties worden vervolgens computationeel verwerkt om ze samen te stellen in congs en om ze te annotereren. Uiteindelijk kunnen variaties in de genexpressie als reactie op diapause-inducerende versus niet-diapause-inducerende fotoperioden worden afgeleid van Reeds MAP naar de RNA-assemblage. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microray-analyse, is dat een voorafgaande genetische bron, zoals de genoomsequentie of een microarray, niet vereist is om globale schattingen van genexpressie als reactie op diapause-condities te verkrijgen.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van ecologische genomica te beantwoorden, zoals wat de transcriptionele basis is van DPO's of andere belangrijke ecologische aanpassingen bij non-model organismen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat het moeilijk kan zijn om voldoende hoeveelheden diapause- en non-DPO's-eieren te verkrijgen en de downstream bio-informatica-analyse kan een uitdaging zijn. We kregen het idee voor deze methode toen we merkten dat high-throughput DNA-sequencingtechnologieën goedkoper werden en een tractabele methode boden voor het verkrijgen van whole-genome expressieprofielen in non-model organismen voordat we met de procedure begonnen.
Stel twee fotoperiodekasten in met programmeerbare verlichting op 21 graden Celsius voor optimale diapause-expressie en ongeveer 80% relatieve luchtvochtigheid. Programmeer een kas voor een niet-diapause-inducerende fotoperiode met een 16 acht lichtdonkercyclus en de andere voor een diapause-inducerende acht 16 lichtdonkercyclus met de verlichting op hetzelfde tijdstip voor beide kasten om de circadiane tijd tussen de fotoperioden te synchroniseren. Dompel vervolgens eierpapieren voor het juiste aantal eieren onder in 500 milliliter gedeïoniseerd water en voeg een milliliter gezeefde hondenvoer en pekelgarnalenvoedingsslurry toe. Bedek de container met gaas en plaats een rubberen band rond het gaas om het op zijn plaats te houden.
Breng vervolgens de eieren in de 16 acht lichtdonker lange dag fotoperiode kas ongeveer 24 uur onder. Breng de volgende dag ongeveer 30 uitgekomen larven per groep over naar individuele 10 bij 10 bij twee centimeter petrischalen gevuld met 90 milliliter gedeïoniseerd water. Elke 48 tot 72 uur brengt u de larven over naar een schone schaal en voedt u ze bij elke overbrenging met verse voedingsslurry.
Na ongeveer zes dagen bekleedt u de bodem van drie tot vier volwassen kooien voor elke fotoperiodebehandeling met nat filterpapier en bevochtigt u het filterpapier met voldoende gedeïoniseerd water om de lokale luchtvochtigheid in de kooi te verhogen zonder dat er staand water ontstaat. Noteer de fotoperiode, replicaatnummer, startdatum van de kooi en andere voor het experiment relevante informatie met permanente marker op de zijkant van de kooi. Breng vervolgens elke twee dagen gedurende 10 dagen de puy over in kleine kopjes schoon water op niet meer dan 50 puy per 25 milliliter water in de geschikte volwassen kooien voor het experiment en plaats organische rozijnen op het bovenste gaas van de kooi om suiker te bieden voor de opgekomen volwassenen Om oöpositionering te stimuleren vier tot vijf dagen na de eerste bloedmaaltijd, vult u donkergekleurde 50 milliliter bekers, bekleed met een getextureerde niet-gebleekt papieren handdoek, voor de helft met gedeïoniseerd water en plaatst u één beker in elke kooi om de eieren te verzamelen en op te slaan.
Vervang de eierpapieren in elke kooi door vers papier en plaats de recent verwijderde papieren in petrischalen en bewaar ze in de acht 16 lichtdonker korte dag fotoperiode kas om verwarrende effecten op de eieropslag te voorkomen. Ongeveer 48 uur na de verzameling, droogt u de eierpapieren in de open lucht zodat ze slap en licht vochtig aanvoelen, maar niet zo nat dat de papieren donker zijn van water of het uitkomen stimuleren. Om de diapause-incidenten te meten, noteert u het aantal eieren op elk eierpapier.
Dompel vervolgens de afzonderlijke papieren volledig onder in een 90 milliliter petrischaal met ongeveer 80 milliliter gedeïoniseerd water. Voeg ongeveer 0,25 milliliter voedingsslurry toe om hun uitkomen te stimuleren en breng de petrischaal na 24 uur over op een zwart oppervlak. Plaats nu een lichtbron aan één kant van de, de larven zullen zich van het licht afwenden, waardoor een duidelijke telling van de individuele eerste sterlarven mogelijk is.
Gebruik een pipette om elk larve na het tellen te verwijderen om hertelling van individuen te voorkomen. Plaats vervolgens de eierpapieren in een nieuwe petrischaal om opnieuw te drogen. Na het tellen van een tweede batch uitgekomen larven een week later, plaatst u de eierpapieren met de resterende onuitgekomen eieren in nieuwe 90 milliliter petrischalen met ongeveer 80 milliliter verse bleekvloeistof, waarbij u ervoor zorgt dat de papieren volledig in de bleekvloeistof zijn ondergedompeld.
Laat de papieren een nacht onder een afzuigkap en gebruik de volgende dag een lichtmicroscoop om het aantal onuitgekomen eieren te tellen. Als een ei embryonair is, zal het een ivoorkleurige kleur vertonen met de ogen die als twee kleine zwarte stippen tegenover elkaar op de dorsale zijde verschijnen. Om te beginnen, reinigt u zorgvuldig de werkbank met RNA-decontaminatieoplossing om eventuele resterende nucleasen te verwijderen en RNA-degradatie te voorkomen.
Gebruik vervolgens een kamelharen borstel om minstens 400 muggeneieren met zich ontwikkelende embryo's op het ontwikkelingstijdstip te borstelen. Punt van belang in glazen molens. Voeg in een afzuigkap een milliliter triol toe en maal de eieren tot ze volledig verpulverd zijn en voer vervolgens de RNA-extractie in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het identificeren van differentieel tot expressie gebrachte genen in Aedes albopictus-muggen tijdens diapauze- en niet-diapausetoestanden. De aanpak omvat het fokken van muggen onder verschillende fotoperioden, gevolgd door RNA-extractie en high-throughput sequencing om variaties in genexpressie te analyseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genomics
- Ecologie
Achtergrond
- Diapause is een cruciale adaptieve eigenschap bij veel organismen.
- Aedes albopictus is een niet-modelorganisme met een aanzienlijke ecologische impact.
- RNA-Seq is een krachtig instrument voor het bestuderen van genexpressie zonder voorafgaande genetische bronnen.
- Inzicht in genexpressie als reactie op omgevingsfactoren kan bijdragen aan ecologische en evolutionaire studies.
Doel van de studie
- Om transcriptionele componenten van de fotoperiodieke diapauze-respons te identificeren.
- Om genexpressie tussen diapauze- en niet-diapausetoestanden te vergelijken.
- Om het begrip van adaptieve eigenschappen in niet-modelorganismen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Biologisch gerepliceerde monsters van eieren in diapause en eieren buiten diapause werden geproduceerd.
- RNA werd uit elk replica geëxtraheerd voor sequencing.
- High-throughput RNA-sequencing werd uitgevoerd.
- Computationele verwerking werd gebruikt om RNA-sequenties te assembleren en te annoteren.
Belangrijkste resultaten
- Variaties in genexpressie werden geïdentificeerd als reactie op verschillende fotoperioden.
- De studie demonstreerde de effectiviteit van RNA-Seq in niet-modelorganismen.
- Er werden inzichten verkregen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diapause.
- De resultaten kunnen toekomstig onderzoek naar adaptieve kenmerken bij andere soorten informeren.
Conclusies
- RNA-Seq is een waardevolle methode voor het bestuderen van genexpressie in niet-modelorganismen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van adaptieve kenmerken in relatie tot veranderingen in de omgeving.
- Deze benadering kan worden toegepast op andere soorten die met soortgelijke ecologische uitdagingen worden geconfronteerd.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit protocol maakt targetvalidatie in niet-modelorganismen mogelijk door omgevingsprikkels te koppelen aan transcriptionele responsen, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in de vroege fase van ontdekking. Het biedt een schaalbare aanpak voor fenotypische screening van adaptieve kenmerken zonder dat voorafgaande genomische bronnen vereist zijn, waardoor de afhankelijkheid van modelsystemen wordt verminderd. De workflow ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij targetidentificatie door de fotoperiode als onafhankelijke variabele te isoleren en genexpressie als kwantitatieve afhankelijke variabele te meten.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om transcriptionele responsen op omgevingsstimuli te onderzoeken voor het testen van doelhypothesen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door genen te identificeren die differentieel tot expressie komen in diapause- versus non-diapause-toestanden.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door fotoperiodieke behandeling te koppelen aan meetbare transcriptionele output.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gevalideerde biologische systemen (diapauze- en niet-diapauze-eieren) voor downstream screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding en RNA-extractie voor reproduceerbare high-throughput sequencing.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor verschillende muggensoorten en levensgeschiedeniskenmerken met geringe aanpassingen aan het protocol.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt bevindingen over genexpressie uit de ontdekkingsfase met fenotypische uitkomsten, zoals ontwikkelingsstilstand en metabole suppressie.
- Mechanistische risicoreductie: Identificeert transcriptionele netwerken die ten grondslag liggen aan diapause, wat bijdraagt aan de selectie van biomarkers voor preklinische validatie.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door kwantitatieve drempelwaarden te bieden voor differentiële expressie (bijv. 3.128 DEGs over verschillende tijdspunten).
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot leadidentificatie, in het bijzonder voor targets die betrokken zijn bij omgevingsdetectie en stressresponsroutes.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door de fotoperiode als onafhankelijke variabele te isoleren en transcriptionele veranderingen als afhankelijke variabelen te meten.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde kweek, diapauze-inductie en stappen voor RNA-kwaliteitscontrole.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van genexpressie (bijv. contig-assemblage, differentiële expressie) die vergelijking tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Koppelt transcriptionele veranderingen aan fenotypische diapauze-uitkomsten, wat de afstemming van biomarkers in preklinische modellen ondersteunt.
- Enterprise Reuse: De workflow is aanpasbaar aan andere muggen en ecologische kenmerken, waardoor investeringen op platformniveau worden gestimuleerd in plaats van assays voor eenmalig gebruik.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in omgevingsresponspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door biologisch gerepliceerde monsters en gestandaardiseerde RNA-extractieprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door screening in niet-modelorganismen mogelijk te maken zonder voorafgaande investering in het genoom.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door transcriptioneel bewijs te leveren voor de verdere ontwikkeling van targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het kweken van muggen, fotoperiodecontrole en RNA-handling onder RNase-vrije omstandigheden.
- Is afhankelijk van toegang tot Illumina-sequencers en computationele infrastructuur voor de novo transcriptoomassemblage en annotatie.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams van entomologie, moleculaire biologie en bio-informatica.
- Vereist aanpassing van de condities voor diapause-inductie (bijv. licht:donker-cycli, temperatuur) voor verschillende soorten of stammen.
- Praktische beperkingen omvatten het tijdintensieve karakter van diapause-inductie (6–8 maanden) en uitdagingen bij het verkrijgen van voldoende opbrengsten aan diapause-eieren.
