Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

Het algemene doel van deze procedure is om het migratiegedrag van cellen binnen de driedimensionale omgeving te analyseren. Eerst worden de cellen van belang ingebed in een driedimensionale collageenmatrix. Vervolgens wordt de beweging van de cellen geregistreerd door middel van time lapse videomicroscopie, vervolgens worden de migratieparameters bepaald door computerondersteund celtracking en wordt de celtrackinggegevens geanalyseerd met behulp van een spreadsheetsoftwaretoepassing.

Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om te onderzoeken welke factoren en signaaltransductiepaden de migratie van kankercellen of normale cellen zoals leukocyten, lymfocyten en stamcellen reguleren in de context van kanker. Kennis van celmigratie, modulerende factoren en geassocieerde signaaltransectiepaden kan nuttig zijn voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om de migratie van tumorcellen en metastatische verspreiding te belemmeren. Voor de migratiekamers veeg je snel twee lagen gesmolten paraffinewas, vaselinemix naar het midden van een glasplaatje, voeg een deksel toe, schuif en verzegel met twee lagen van de paraffinewas, vaselinemix.

Plaats vervolgens de migratiekamers in een rechtopstaande positie in een rek naar 1,5 milliliter reactiebuisjes. Voeg 20 microliter van de celsuspensie toe aan de collageensuspensie. Combineer 50 microliter van 10 XMEM en 27 microliter van 7,5% natriumbicarbonaat oplossingmix grondig.

Voeg vervolgens 375 microliter vloeibare collageensuspensie toe en meng grondig voor een lichtpaarse kleur die een pH van 7,5 aangeeft. Voeg nu 100 microliter van de uiteindelijke collageensuspensie toe aan 50 microliter van de celsuspensie en meng grondig terwijl de initiatie van collageenvezel.Polymerisatie wordt opgemerkt. Bij pH 7,5, breng de mix over naar de migratiekamers.

Tik voorzichtig op de migratiekamer om de collageensuspensiecelmix gelijkmatig te verdelen op de bodem van de migratieketenkamer. Plaats de migratiekamers in een rechtopstaande positie in rek en incubeer gedurende 30 minuten. Wanneer het gepolymeriseerde collageenraster licht troebel is, maar nog steeds een lichtpaarse kleur heeft, vul de migratiekamers met het juiste medium en verzegel de migratiekamer met paraffinewas.

Vaselinemix. Stel de microscooptrapverwarming in op 37 graden Celsius met behulp van een 10 x vergroting op de migratiekamer. Focus ongeveer 50 cellen of meer in het gezichtsveld.

Neem de celmigratie op in time lapse-modus met behulp van een multi-camera videobewakingssoftwaretoepassing. Sla de celmigratiefilms op in een geschikt bestandsformaat. Koppel de celmigratiefilmbestanden aan een database met ondersteunende informatie zoals celtype en experimentele omstandigheden.

Analyseer vervolgens de celmigratiefilms met behulp van een geschikte celtrackingsoftwaretoepassing voor een onbevooroordeelde analyse. Selecteer willekeurig de cellen voor analyse zonder de kennis of cellen in totaal migratief actief zijn, bepaal ongeveer 60 XY-coördinaten per cel in een typisch celmigratie-experiment. Kies in geval van celdeling willekeurig één dochtercel om in te volgen.

Analyseer celtrackinggegevens met behulp van een geschikte softwaretoepassing zoals een spreadsheetprogramma om de totale afstand die een cel heeft gemigreerd te berekenen. Vermenigvuldig de som van de numerieke pixelwaarden met een correctiefactor voor conversie in micrometer. Definieer de cellen die minder zijn gemigreerd dan de 25 micrometerdrempel als niet-bewegende cellen en vervang de numerieke waarden met een komma.

Bereken vervolgens de locomotorische activiteit als een percentage van cellen van de bijgehouden celpopulatie die tussen twee tijdstippen zijn verplaatst. Bereken ook de tijd van actieve beweging als een percentage van de totale tijd dat een cel is gemigreerd in verhouding tot de tijdsperiode van de observatieperiode. Bereken vervolgens de statistische significantie met behulp van de man Whitney U test en toon de celmigratiegegevens.

Een typisch celtrackinggegevensbestand lijkt op een tabel waarbij elke kolom staat voor één bijgehouden cel. De rijen bevatten de positionele informatie over celbeweging. Na verloop van tijd kan het locomotief gedrag van cellen worden gekenmerkt door de gemiddelde locomotorische activiteit van de geanalyseerde celpopulatie en ook de tijd van actieve beweging.

Dit voorbeeld toont de migratieactiviteiten van 120 cellen uit vier onafhankelijke experimenten. Elke diamant geeft aan dat een cel tussen ten minste twee tijdstippen is verplaatst. De grijze lijnen onderscheiden de bewegende en niet-bewegende cellen.

De parameter van locomotief activiteit kan worden weergegeven als een XY-diagram of een boxplot. Om de dynamica van de geanalyseerde celpopulatie te visualiseren, toont een histogram effectief de tijd actief van diezelfde cellen. Deze analyse van het migratiegedrag van MDA HER2 en M-D-A-N-E-O borstkankercellijnen geeft aan dat beide cellijnen een vergelijkbare spontane locomotorische activiteit vertoonden.

De parameter tijd actief onthulde een iets hoger aantal spontaan bewegende M-D-A-H-E-R cellen in vergelijking met M-D-A-N-O borstkankercellen. Stimulatie met 100 nanogram per milliliter EGF resulteerde in een significant verhoogde migratieactiviteit van MDA HER2 zoals gemeten door het aantal bewegende cellen en tijd van actieve beweging. Interessant is dat M-D-A-N-E-O cellen migreerden als reactie op EGF-stimulatie en een verschoven tijd actief patroon vertoonden. Behandeling met fosfolipase c gamma een remmer uc 3 1 22 verminderde zowel de spontane als EGF-geïnduceerde migratie van zowel M-D-E-E-R twee als MDAN.

EEO cellen. Analyse van de tijd actief parameter onthulde dat behandeling van MDAN EEO cellen met twee micromolar van U 7 3 1 2 2 resulteerde in een duidelijk verminderde locomotorische activiteit, voornamelijk toegeschreven aan een verhoogd aantal niet-bewegende cellen. Eenmaal beheerst migratie van lymfocyten en leukocyten in een driedimensionale collageenletters en ment kan worden geregistreerd in ongeveer twee uur waar tumorcellen worden geregistreerd overnacht.