Name: Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Leer een bloedkweekpellet voorbereiden voor snelle bacteriële identificatie en antibiotica gevoeligheidstesten. Deze methode versnelt de diagnose van bloedstroominfecties en verbetert patiëntuitkomsten aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de technici van de bacteriologie laboratorium van het Universitair Ziekenhuis Centrum van Lausanne voor hun hulp om de technieken in het laboratorium uit te voeren.

Dit protocol is ontwikkeld en gevalideerd na het onderzoek en de ontwikkeling van processen en ethische regels van onze instelling voor een routine-instrument wordt geïmplementeerd. 1 Voorbereiding van een Blood Culture bacteriepellet door Ammonium Chloride Erythrocyte-lyseren Procedure <ol><li> Bereiding van een positieve bloedkweek voor daaropvolgende centrifugatie. <ol><li> Steriliseer de bloedkweek dop. Voeg 70% ethanol op de dop van de fles en het branden. OPMERKING: Voer deze stap onder een laminaire stroming kap niet uitvoeren. </li><li> Beweeg de fles om een ​​laminaire stroming kap. Verzamel 5 ml van de bloedkweek met een 20 G injectiespuit. </li><li> Voeg 5 ml van bloedkweek in een 50 ml centrifugebuis die 45 ml steriel water (H2O) en meng het monster. </li></ol></li><li> Bereiding van een bloedkweek bacteriële pellet door centrifugeren lysis. <ol><li> Centrifugeer het monster bij 1000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Remove de supernatant met een laboratorium vacuümpomp (welke hoofdzakelijk H2O en bloedcellen bevat). </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml van zelfgemaakte ammoniumchloride lyserende oplossing (0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3). Breek de pellet door schrapen en door vortexen de buis en centrifugeer het monster bij 140 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant dat vooral bestaat uit rode bloedcellen puin. <ol><li> Indien de pellet bleef hemorrhagic, resuspendeer de pellet in 2 ml steriel gedistilleerd en H 2 0 verder lyseren resterende rode bloedcellen en de pellet te wassen. Centrifugeer het monster bij 140 xg gedurende 10 min bij RT en de bovenstaande vloeistof. </li></ol></li><li> Resuspendeer de pellet in 200 ui H2O </li></ol></li><li> Subcultuur van bloedkweek van verschillende selectieve en niet-selectieve agar. <ol><li> Verzamelen van 1 ml van de bloedkweek met een 20 G injectiespuit. </li><li> Te enten 1 druppel bloed cultuur into vier kwadranten op bloed agar, chocolade agar, McConkey agar en Schaedler agar. </li><li> Incubeer bij 37 ° C de agar en chocolade-agarplaten in een 5% CO2 atmosfeer, de McConkey agar in een normale atmosfeer en Schaedler agarplaat in anaërobe omstandigheden. </li><li> Volg bacteriegroei op de verschillende media. </li><li> Controleer voor bacteriële zuiverheid. </li></ol></li></ol> 2 Identificatie van MALDI-TOF MS <ol><li> Directe identificatie van het bloed pellet. <ol><li> Breng 1 pl van het bloed pellet op een MALDI doel bord en laat het drogen op een 42 ° C verwarmen platform. </li><li> Overlay van het monster met 1 pl 70% mierenzuur en laat het drogen op een 42 ° C verwarmen platform. </li><li> Overlay het monster met 1 pi MALDI matrix (verzadigde oplossing van α-cyano-4-hydroxykaneelzuur in 50% acetonitril-2,5% trifluorazijnzuur) en laat het drogen op 42 ° C verwarmen platform. </li><li> Ga verder met MALDI-TOF MS analyse van een MALDI-TOF MS zoals beschreven door de fabrikant. </li><li> Als de identificatie score ongeldig op species niveau (bijvoorbeeld met een score &lt;2), het uitvoeren van een eiwit-extractie van het bloed pellet monster. </li></ol></li><li> Identificatie na eiwit extractie uit de bloedkweek pellet. <ol><li> Meng 20 ul van het pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 25 ul van 70% mierenzuur en 25 ul 100% acetonitril de pellet. Vortex krachtig om de pellets mengen. Resuspendeer taaie pellets door het breken van hen neer met pipet tips voordat vortexen. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Breng 1 pl van het supernatant (die gewonnen eiwitten bevatten) op een MALDI doel bord en laat het drogen op een 42 ° C verwarmen platform. Ga te werk zoals beschreven in 2.1.2. </li></ol></li></ol> 3 Bacteriële Identificatie en antibiotica gevoeligheid testen met een geautomatiseerde Microbiële Systeem <ol><li> Bereiding van een bacteriële suspensie voor bacteriële identificatie en AST een geautomatiseerd microbieel systeem. <ol><li> Bereid een plastic buisje met 3 ml steriel 0,45% NaCl-oplossing verenigbaar met het automatische microbieel systeem. </li><li> Voeg een voldoende hoeveelheid van de bloedkweek pellet in het 0,45% NaCl-oplossing een bacteriesuspensie overeenkomt met een McFarland troebelheid van 0,6 tot 0,8 te verkrijgen. Meet de troebelheid met een densitometer machine. Opmerking: Het volume van de bloedkweek bacteriële pellet varieert van 50 tot 200 ul van een McFarland troebelheid van 0,6 tot 0,8 te bereiken. </li></ol></li><li> Inoculeer de geautomatiseerde Gram-positieve (GP) of Gram-negatieve (GN) kaarten voor identificatie en geautomatiseerde AST kaarten antimicrobiële gevoeligheidstest van Gram-positieve kokken en Gram-negatieve bacteriën zoals beschreven door de fabrikant. OPMERKING: Identification met de huisarts of GN-kaarten wordt niet toegepast als MALDI-TOF MS identificatie score waarde&gt; 2. Controleer de zuiverheid van de bacteriële suspensie door een subcultuur van de bacteriële suspensie op bloed-agar (GP en GN) en MacConkey agar (GN) platen. </li></ol> 4 antibiotica gevoeligheid testen door Disk Diffusion Assay De disk diffusie test wordt beschreven door de Europese commissie voor tests op antimicrobiële resistentie (EUCAST, Versie 3.0, april 2013, www.eucast.org). <ol><li> Voorbereiding van een bacteriële suspensie voor antimicrobiële gevoeligheid getest door disk diffusie test uit te voeren. <ol><li> Bereid een glazen buis bevattende 3 ml steriele 0,9% NaCl-oplossing. </li><li> Voeg een voldoende hoeveelheid van de bloedkweek pellet in 0,9% NaCl-oplossing een bacteriesuspensie overeenkomt met een McFarland troebelheid van 0,5 te verkrijgen. Meet de troebelheid met een densitometer machine. Opmerking: Het volume van de bloedkweekbacteriële pellet varieert van 50 tot 200 ul van een McFarland troebelheid van 0,6 tot 0,8 te bereiken. </li><li> Vortex de bacteriële suspensie. </li></ol></li><li> Inoculatie bacteriesuspensie op Mueller-Hinton agar (MH) of Mueller-Hinton agar-agar veeleisende organismen (MHF) (MH gesupplementeerd met 5% gedefibrineerd paardenbloed en 20 mg / L van β-nicotinamide adenine dinucleotide). <ol><li> Dompel een steriel wattenstaafje in de bacteriële suspensie en verwijder voorzichtig overtollige vloeistof door de wattenstaafje op de binnenwand van de glazen buis. </li><li> Spreid de bacteriële suspensie gelijkmatig op het gehele oppervlak van de MH / MHF agarplaat door zwabberen in drie richtingen, of met een geautomatiseerde plaat rotator. </li></ol></li><li> Toepassing van antimicrobiële schijven op geënt agarplaten. <ol><li> Breng nauwkeurig de schijven op het oppervlak van de gedroogde geïnoculeerde agar platen handmatig of met een gevoeligheid schijf dispenser. </li><li> Incubeer de plaat op de juiste temperatuur en sfeer, zoals beschreven in de antimicrobiële gevoeligheid getest EUCAST disk diffusie methode (Versie 3.0, april 2013, www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5 Geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische test voor de detectie van MRSA <ol><li> Met een micropipet, overdracht 50 ul van de bloedkweek pellet in de monsterhouder reagensflesje voorzien MRSA geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische testkit en vortex gedurende 20 seconden. </li><li> Met behulp van een 1 ml micropipet, bereid het monster in de monster-poort van de patroon. Plaats de cartridge in de geautomatiseerde PCR-systeem en start de test zoals beschreven door de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Alberti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+sepsis+and+infection+in+ICU+patients+from+an+international+multicentre+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study.</a> Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).</li>
<li>Angus, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States%3A+analysis+of+incidence%2C+outcome%2C+and+associated+costs+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+in+European+intensive+care+units+results+of+the+SOAP+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study.</a> Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).</li>
<li>Micek, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empiric+combination+antibiotic+therapy+is+associated+with+improved+outcome+against+sepsis+due+to+Gram-negative+bacteria+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).</li>
<li>Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+importance+of+microbiological+findings+in+the+diagnosis+and+management+of+bloodstream+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections.</a> Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).</li>
<li>Barenfanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+mortality+associated+with+prompt+Gram+staining+of+blood+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures.</a> American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).</li>
<li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection%3A+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+the+clinical+management+of+patients+with+Gram-negative+bacteremia+a+prospective+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study.</a> Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).</li>
<li>Meex, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+bacteria+from+BacT%2FALERT+anaerobic+positive+blood+cultures+by+MALDI-TOF+MS+MALDI+Sepsityper+kit+versus+an+in-house+saponin+method+for+bacterial+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction.</a> Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).</li>
<li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%25+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).</li>
<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).</li>
<li>Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).</li>
<li>Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bacterial+identification+in+positive+blood+cultures+by+use+of+two+commercial+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems.</a> J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).</li>
<li>Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+for+direct+bacterial+identification+from+positive+blood+culture+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets.</a> J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).</li>
<li>Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li>
<li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li>
<li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+emergency+medicine%22%5BJournal%5D)">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li>
<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Vergeleken met conventionele positieve bloedkweek diagnostische benaderingen snelle verwerving van een bacteriële pellet met de ammoniumchloride lysis centrifugatie benadering verminderen de tijd tot identificatie rapporteren door 16 tot 24 uur en de tijd AST door 24 rapporteren aan 48 uur (Figuren 1 en 3). Snelle invoering van geschikte antibiotica therapie is van cruciaal belang voor de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren. Aldus vroeg...

Bloedbaan infecties en sepsis bij gehospitaliseerde patiënten een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Zo is de sterfte gerelateerd aan infecties bloedbaan waargenomen bij ongeveer 14% tot 37% van de gehospitaliseerde patiënt en kan op de intensive care-patiënten 1-3 te verhogen tot 35%. De snelle identificatie van de ziekteverwekker is cruciaal voor een optimale antimicrobiële behandeling te begeleiden en om de goede afloop van de antimicrobiële therapie 4,5 te verhogen. De snelle analyse van Gramkleuringen van positieve bloedkweek reeds een aanzienlijke invloed op de aanpassing van antimicrobiële therapie 6,7 maar nauwkeurige identificatie van het infectueuze agens moet de meest geschikte antibiotica om de patiënt te voorzien. Bijvoorbeeld, verschillende antibiotica behandelingen moeten worden uitgevoerd na bacteriëmie met enterokokken en streptokokken die moeilijk te onderscheiden door Gram-kleuring zijn. Ook de identificatie van de soort Level moet Gram negatieve enterobacteriën detecteren codeert AmpC een chromosomaal gen dat een verhoogde resistentie tegen 8-lactamen β. Met een positieve bloedkweek, conventionele diagnostische benadering is de ziekteverwekker van verschillende agarplaten, die verscheidene uren extra incubatie voorafgaande identificatie met verschillende benaderingen zoals biochemische tests groei van verschillende selectieve media en geautomatiseerde microbiële identificatiesystemen vereist subcultuur. De tijd om resultaten van een conventionele diagnostische benadering is van ongeveer 1 tot 3 dagen. De opkomst van de matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF) techniek voor snelle identificatie van micro-organismen is een nieuw hulpmiddel om snel micro-organismen kolonies gekweekt op agarplaten ook direct identificeren van positieve bloed ontvangen kweken (figuur 1) 9-12. The gebruik van MALDI-TOF om een ​​infectueus agens te identificeren van bloedkweken is aanzienlijk verminderd de tijd om de resultaten om een ​​paar minuten in plaats van de uren en dagen die door de traditionele methoden. Zoals besproken door Croxatto e.a.. 13, de efficiëntie van MALDI-TOF identificatie berust op verschillende parameters zoals zuiverheid en hoeveelheid van de micro-organisme. Deze twee criteria worden gemakkelijk verkregen uit afzonderlijke kolonies gekweekt op agarplaten maar vereist een pre-analytische behandeling van bacteriële verrijking en zuivering uit complexe monsters zoals bloed cultuur, die meerdere cellulaire en eiwit componenten die kunnen interfereren met MALDI-TOF identificatie bevatten. Isolatiemethoden van bloedkweek Verschillende micro-organismen &quot;zijn gebruikt in een aantal studies waaronder saponine of andere milde detergentia vormen voor bacteriële extractie 9,14, serumscheidingsbuisjes methode 10, lysis centrifugatiewerkwijzen 12 </sup&gt; en commercieel oplossingen zoals het sepsityper kit. Onze bacteriologie diagnostisch laboratorium heeft een eenvoudige bloed-kweek bacteriële pellet bereiding op basis van ammoniumchloride erytrocyt-lysis dat snelle identificatie van bacteriën en gist door MALDI-TOF en automatische identificatiesystemen (figuur 2) 15 toe ontwikkeld. Dit bloed-kweek pellet preparaat ook een voorbeeld voor andere directe verdere toepassingen zoals Gram kleuring, geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische testen zoals POCT-PCRs voor de snelle detectie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en antibioticum gevoeligheidstests met AST geautomatiseerde systemen en / of disk diffusie assays op agarplaten (figuur 3). In dit werk beschrijven we de verschillende stappen voor de bereiding van de bloed-kweek bacteriële pellet zoals door Prod&#39;hom e.a.. 15 (figuur 4). We zullen ook Deschrijver de protocollen voor drie van de belangrijkste toepassingen die worden uitgevoerd op de bloedkweek pellet: Identificatie met MALDI-TOF 15, identificatie (ID) en antibiotica gevoeligheidstests (AST) met geautomatiseerde systemen 16 voor Enterobacteriaceae en stafylokokken en geautomatiseerde PCR gebaseerde diagnostische test voor de detectie van MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>20 G naald</td><td>Terumo, Leuven, België</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon buis</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, VS</td><td>352070</td><td>50 ml centrifuge buizen</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumwaterstoffosfaat</td><td>Fluka, St. Louis, MO, VS&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Ontvlambaar, corrosief</td></tr><tr><td>α-Cyaan-4-hydroxycininezuur</td><td>Fluka, St. Louis, MO, VS&nbsp;</td><td>70990</td><td>Acute toxiciteit</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS&nbsp;</td><td>271004</td><td>Ontvlambaar, acute toxiciteit</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS&nbsp;</td><td>T6508</td><td>Corrosief, acute toxiciteit</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 instrument</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>27202</td><td>geautomatiseerd microbieel systeem instrument</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-positief (GP) kaart</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>21342</td><td>geautomatiseerde GP&nbsp; identificatiekaart</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 kaart</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>22233</td><td>geautomatiseerd microbieel AST systeem</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-negatief (GN) kaart</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>21341</td><td>geautomatiseerde GN&nbsp; identificatiekaart</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 kaart</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>413391</td><td>geautomatiseerd microbieel AST systeem</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, VS</td><td>GXMRSA-100N-10</td><td>nucleïnezuur-amplificatietechnologie MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV instrument</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, VS</td><td>GXIV-4-D</td><td>nucleïnezuur-amplificatietechnologie instrument</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS instrument</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Duitsland</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 doel staal BC</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Duitsland</td><td>280799</td><td>MALDI doelplaat</td></tr><tr><td>Densitometer Densicheck instrument</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Duitsland</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey agar</td><td>Biolife, Milano, Italië</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton agar</td><td>Oxoid, Hampshire, Engeland</td><td>CM0337</td><td>Mueller-Hinton agar (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>MHF agar</td><td>Biomérieux, Marcy-l'Etoile, Frankrijk</td><td>43901</td><td>Mueller-Hinton agar-gefingeerde organismen agar (MHF)</td></tr><tr><td>BD columbia III agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, VS</td><td>254071</td><td>bloedagar</td></tr><tr><td>BD chocolate agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, VS</td><td>254089</td><td>chocolate agar</td></tr><tr><td>BD schaedler agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, VS</td><td>254084</td><td>Schaedler agar</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van een bloed cultuur pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloedbaan infecties en sepsis zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. De succesvolle uitkomst van patiënten met bacteriëmie, hangt af van een snelle identificatie van de ziekteverwekker om een ​​optimale behandeling met antibiotica te begeleiden. De analyse van Gramkleuringen van positieve bloedkweek kan snel worden uitgevoerd en reeds een aanzienlijke invloed hebben op de antibiotica kuur. Echter, is de nauwkeurige identificatie van het infectueuze agens nog steeds vereist om de optimale gerichte behandeling stellen. We presenteren hier een eenvoudige en snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek die kan worden gebruikt als een monster voor meerdere essentiële verdere toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF MS, antibiotica gevoeligheidstest (AST) door disc diffusie assay of geautomatiseerde systemen AST en geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische test. De uitvoering van deze verschillende identificatie en AST die rechtstreeks aangebracht op de bloedkweek bacteriële pellets zeer siMilar de prestaties gewoonlijk verkregen uit geïsoleerde kolonies gekweekt op agarplaten. Vergeleken met conventionele benaderingen, de snelle verwerving van een bacteriële pellet vermindert de tijd zowel identificatie en AST rapporteren. Zo kan na bloedkweek positiviteit, identificatie door MALDI-TOF worden gemeld binnen minder dan 1 uur, terwijl de resultaten van AST door geautomatiseerde AST systemen of disc diffusie testen binnen 8 tot 18 uur, respectievelijk. Evenzo kunnen de resultaten van een snelle PCR gebaseerde bepaling de clinici worden meegedeeld minder dan 2 uur na het verslag van een bacteremia. Samen tonen deze resultaten aan dat de snelle voorbereiding van een bloedkweek bacteriële pellet heeft een belangrijke invloed op de identificatie en de AST doorlooptijd en dus op de goede afloop van de patiënten die lijden aan infecties in het bloed.

In de studie van Prod&#39;hom e.a.. 15, werden bacteriële pellets verkregen door ammoniumchloride lysis centrifugering van 122 positieve bloedkweek van 78 patiënten geanalyseerd met MALDI-TOF MS. Van de 122 positieve bloedkweek, 95 (77,9%) werden correct geïdentificeerd op het niveau van soorten en een (0,8%) op het genus-niveau. De overige 26 (21,3%) bloedkweek pellets gaven geen betrouwbare identificatie door MALDI-TOF. Van deze 21 waren gram-positieve bacteriën, waaronder 13 streptokokken en 5 coa...

Een snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek kan worden gebruikt als een monster voor toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF, Gram-kleuring, antibiotica gevoeligheidstesten en PCR-gebaseerde test. De resultaten kunnen snel worden meegedeeld aan artsen om de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren.

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Het algemene doel van deze procedure is om een bacteriële pellet te bereiden uit een positieve bloedcultuur die kan worden gebruikt als monster voor verschillende toepassingen. Dit wordt bereikt door eerst een positieve bloedcultuur te mengen met steriel water. Na centrifugatie. De pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in ammoniumchloride om de rode bloedcellen te lyzeren na een tweede centrifugatie. De pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in water. De laatste stap is om de verkregen pellet te gebruiken voor bacteriële identificatie door matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie, time of flight, gramkleuring, antischimmelgevoeligheidstesten en/of PCR-gebaseerde tests. De verkregen resultaten kunnen snel worden gecommuniceerd aan clinici om de uitkomst van patiënten met bloedbaaninfecties te verbeteren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals bacteriële subcultuur van positieve bloedculturen, is om de bacteriële identificatie met ongeveer zes tot 24 uur te verminderen en om de tijd tot antischimmelresultaten met ongeveer 24 uur te verminderen. Deze methode kan helpen om de antibioticabehandeling snel aan te passen en om de uitkomst van patiënten met bloedbaaninfecties te verbeteren. Hoewel deze methode kan worden toegepast op routinematige identificatiemethoden zoals OV en op conventionele aanpak van duurzaamheid van antischimmelmiddelen, kan deze ook worden toegepast op nieuwe technologieën die zijn gericht op de identificatie van VUL-factoren en/of resistente mechanismen zoals ESBL en CARBAPENEMASE-activiteiten.Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat de bacteriële PAL-voorbereiding cruciaal is om voldoende microbieel materiaal te verkrijgen voor downstream-toepassingen, waardoor de procedure wordt Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti en Kim Giza, allemaal laboratoriumtechnici uit mijn lab Om een positieve bloedcultuur voor te bereiden voor daaropvolgende centrifugatie. Steriliseer de bloedcultuurkap door 70%ethanol op de dop van de fles toe te voegen en deze te verbranden. Breng vervolgens de fles naar een laminaire stroomkap.Verzamel vijf milliliter van de bloedcultuur met een naald van 20 gauge. Voeg vervolgens de vijf milliliter bloedcultuur toe aan een 50 milliliter centrifugeerbuis met 45 milliliter steriel water en meng het monster. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 1000 Gs.Bij kamertemperatuur verwijdert u het supernatant met een laboratoriumvacuümpomp. Resuspendeer vervolgens de pellet in één milliliter zelfgemaakte ammoniumchloride. Lyseringsoplossing.Breek de pellet af door te schrapen en te vortexen voordat u het monster centrifugeert bij 140 gs gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur verwijdert u na centrifugatie het supernatant, dat voornamelijk rode bloedcelresten bevat. Als de pellet hemorragisch bleef, resuspendeert u de pellet in twee milliliter steriel en gedestilleerd water om resterende rode bloedcellen verder te lyzeren en om de pellet te wassen. Na centrifugatie van het monster zoals eerder, verwijdert u het supernatant, resuspendeert u de pellet in 200 microliter water en vortex de buis voor directe identificatie van het bloedpellet. Breng eerst één microliter van de pellet over naar een MALDI-doelplaat en laat het drogen op een verwarmingsplatform van 42 graden Celsius.Bedek het monster met één microliter 70%mierenzuur en laat het drogen op het verwarmingsplatform. Bedek vervolgens het monster met één microliter MALDI Matrixx en laat het opnieuw drogen op het verwarmingsplatform. Ga verder met maldi TOF MS-analyse met een MALDI TOF MS-systeem zoals beschreven door de fabrikanten.Als de identificatiescore ongeldig is op soortniveau, voer een eiwitextractie uit van het bloedpelletmonster door eerst 20 microliter van de pellet te mengen met één milliliter 70%ethanol. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende twee minuten bij 13.000 Gs bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en voeg 25 microliter 70%mierenzuur en 25 microliter 100%acetonitril toe aan de pellet. Vortex krachtig om de pellet te resuspenderen, gevolgd door centrifugatie gedurende twee minuten bij 13.000 Gs. Breng bij kamertemperatuur één microliter van het supernatant over naar een MALDI-doelplaat en laat het drogen op een verwarmingsplatform van 42 graden Celsius.Om bacteriële identificatie en antischimmelgevoeligheidstesten uit te voeren of een ST, bereid eerst een plastic buis met drie milliliter steriele 0,45%natriumchlorideoplossing voor die compatibel is met het geautomatiseerde microbiële systeem. Voeg een voldoende volume van het bloedcultuurpellet toe aan de oplossing en vortex om een bacteriële suspensie te verkrijgen die overeenkomt met een McFarland-troebelheid van 0,6 tot 0,8 zoals gemeten met een densitometer. Injecteer vervolgens de geautomatiseerde gram-positieve of gram-negatieve kaarten voor identificatie.Injecteer ook de geautomatiseerde a ST-kaarten voor antischimmelgevoeligheidstesten van gram-positieve cocci en gram-negatieve bacteriën zoals beschreven door de fabrikant. Om antischimmelgevoeligheidstesten uit te voeren door middel van schijfdiffusie-assay. Bereid eerst een glazen buis met drie milliliter steriele 0,9%natriumchlorideoplossing voor.Voeg vervolgens een voldoende volume van het bloedcultuurpellet toe aan de oplossing om een bacteriële suspensie te verkrijgen die overeenkomt met een McFarland-troebelheid van 0,5 zoals gemeten door een densitometer. Vortex de bacteriële suspensie om de bacteriële suspensie te inoculeren. Dompel eerst een steriele wattenstaafje in de bacteriële suspensie en verwijder voorzichtig overtollig vocht door de staaf aan de binnenwand van de glazen buis te draaien.Verspreid vervolgens de bacteriële suspensie gelijkmatig over het gehele oppervlak van Mueller. Hint en auger of Mueller hint en auger voor veeleisende organismen door in drie richtingen te vegen of door een geautomatiseerde plaatrotatie te gebruiken voor het aanbrengen van antischimmelschijven op geïnoculeerde augerplaten. Breng vervolgens de schijven dicht bij het oppervlak van de gedroogde geïnoculeerde augerplaten aan, handmatig of met behulp van een gevoeligheidsschijfdispenser.Breid vervolgens de plaat uit bij de juiste temperatuur en atmosfeer zoals beschreven in de Europese commissie

preparation-blood-culture-pellet-for-rapid-bacterial-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle protocol voor de directe identificatie van Enterococcus faecalis en Enterococcus andere soorten uit een positieve bloedkweek met behulp van een Peptide Nucleic Acid fluorescente in situ hybridisatie assay (PNA FISH).

Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Het ontwerp van een eenvoudige een-dag workflow regeling voor bacteriële pathogenen diagnostiek maakt het mogelijk snelle herkenning van infecties in het bloed. Het opnemen van acht klinisch relevante bacteriële doelen en de resistentie tegen antibiotica profielen biedt de arts een eerste inzicht op dezelfde dag, wat kan leiden tot meer adequate therapie.

Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Source: Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the broth microdilution method for determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of a lipoglycopeptide antibiotic against Gram-positive bacteria. It covers bacterial colony isolation, dilution, inoculation of microplate wells with varying antibiotic concentrations, and verification of culture...

A Broth Microdilution Method for Antibiotic Susceptibility Testing of Gram-Positive Bacteria

De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

Antimicrobiële synergie testen wordt gebruikt ter beoordeling van het effect van twee of meer antibiotica in combinatie gebruikt en worden doorgaans uitgevoerd door een van twee methoden: de dambord array of de bepaling van de tijd-doden. Hier presenteren we een geautomatiseerd, inkjet printer-bijgewoonde dambord matrix synergie techniek en een studie van de klassieke tijd-kill synergie.

Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en identificatie van antibioticaresistente bacteriën uit water en de moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen (ARGs). Het gebruik van op cultuur gebaseerde en niet-cultuurgebaseerde (metagenomische analyse) technieken biedt volledige informatie over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in zoet water uit Mumbai, India.

Isolatie en identificatie van watergedragen antibioticaresistente bacteriën en moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen

EUCAST heeft een protocol voor directe antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) ontwikkeld voor geautomatiseerde bloedculturen. De afhankelijkheid van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie kan echter worden vermeden door gebruik te maken van een direct protocol voor de bereiding van inoculum in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem. Deze aanpak kan AST-rapporten opleveren binnen 24 uur na monsterafname.

Directe microbiële identificatie met behulp van een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem om de EUCAST RAST-methode zonder massaspectrometrie te vergemakkelijken

Leer een bloedkweekpellet voorbereiden voor snelle bacteriële identificatie en antibiotica gevoeligheidstesten. Deze methode versnelt de diagnose van bloedstroominfecties en verbetert patiëntuitkomsten aanzienlijk.

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Meer video's verkennen