Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop

Het algemene doel van deze procedure is om single plane verlichtingsmicroscopie uit te voeren met behulp van een lichtbundel excitatiemodule voor omgekeerde microscopen en deze toe te passen op driedimensionale celsferoïden. Dit wordt bereikt door eerst een pipette te gebruiken om een celsferoïde over te brengen van de put van een microtiterplaat naar een tweede put om na het wassen te incuberen. De S-sferoïde wordt vervolgens geïntroduceerd in een rechthoekige capillair.

De tweede stap is om de lichtbundelverlichtingsmodule te monteren op de basisplaat van de positioneringstabel van de omgekeerde microscoop. Vervolgens wordt de capillair met de steroïd in een speciale monsterhouder voor microscopie geplaatst. De laatste stap is om de afstemming tussen de lichtbundel en het brandvlak van de microscoopobjectieflens in het detectiepad in te stellen.

Uiteindelijk kunnen driedimensionale fluorescentiemetingen worden uitgevoerd door de variatie van het brandvlak binnen de celsferoïde om informatie te verkrijgen van enkele beelden of Zacks over de opname van geneesmiddelen of de structuur van de S-sferoïde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande lichtbundelmicroscopen is dat het kosteneffectief en zeer veelzijdig is, omdat het bestaat uit een module die kan worden aangepast aan een bestaande microscoop en een grote mate van vrijheid biedt voor onderzoek. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar onderzoek naar geneesmiddelen en middelen die worden gebruikt voor therapie en diagnose, met name omdat aanpassing van het microfluïdische systeem onderzoek mogelijk maakt van snelle processen onder stromingsomstandigheden.

Nu kan deze excitatiemethode in combinatie met elke detectietechniek inzicht geven in levende celsteroïden bij lage lichtopbrengsten. Het kan ook worden toegepast op andere levende systemen zoals cipro-vissen, artila-embryo's, evenals optische CLE-weefselmonsters. Om te beginnen, voegt u 50 microliter verwarmde 1,5 aeros toe in kweekmedium in elke put van een 96-welplaat en laat het een tot twee uur stollen.

Zaai vervolgens ongeveer 150 MCF zeven borstkankercellen in elke put van de voorbereide 96-welplaat bruto S gedurende vijf tot zeven dagen, tot een diameter van ongeveer 200 tot 300 micrometer in een incubator bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Vermeerder vervolgens de celsteroïd met de anthracycline-antibioticum doxorubicinehydrochloride gedurende zes uur bij een concentratie variërend tussen twee micromolair en acht micromolair in kweekmedium. Na incubatie worden de cellen gewassen met kweekmedium of Earl's balanceerzout-oplossing vóór microscopie.

Gebruik een omgekeerde microscoop en monteer de enkele planenverlichtingsmicroscopie of SPM-excitatiemodule op de basisplaat van de positioneringstabel. Rust de microscoop uit met een 10 keer of 20 keer vergroten microscoopobjectieflens en een geschikte longpass-filter in het detectiepad van de microscoop. Monteer vervolgens een integrerende camera op de detectiepoort van de microscoop.

Gebruik een parallel gecollimeerde bundel van een laser of een laserdiode met een excitatiegolflengte van bij voorkeur 470 nanometer en pas deze toe op het spinmodule. Draai vervolgens de cilindrische lens 90 graden, waardoor de lichtbundel in een verticale positie wordt gebracht voor een axiale aanpassing van de bundelhals van de lichtbundel. Plaats een capillair met een vloeistof met een fluorescente kleurstof in de monsterhouder.

Bevestig de monsterhouder met de capillair aan de positioneringstabel van de microscoop. Richt de positie van de capillair zodanig uit dat deze gecentreerd is en de bundelhals van de lichtbundel in focus staat. Pas de bundelhals aan door variatie van de axiale positie van de cilindrische lens zelf.

Keer de lens terug na aanpassing. Plaats de celsteroïd afzonderlijk of in groepen binnen rechthoekige bo silicaatglas capillairen met een binnendoorsnede van 600 bij 600 micrometer en een wanddikte van 120 micrometer. Om dit te bereiken, neem de lege capillair rechtop met duim en middelvinger en verzegel de bovenste opening met de wijsvinger.

Breng de onderste opening dicht bij de celsferoïde in zijn omringende vloeistof, laat de wijsvinger van de bovenste opening vrij en breng de vloeistof met de steroïd in. Het zal onmiddellijk worden gedrenkt door capillaire krachten. Pas de positie van de S-sferoïde binnen de gevulde capillair aan door middel van zwaartekracht.

Alternatief kan de steroïd via pipettering op de capillair worden aangebracht. Zorg ervoor dat de opening van de punt van de pipetter enerzijds groot genoeg is voor de grootte van de S-sferoïde en anderzijds kleiner of gelijk is aan de binnendiameter van de capillair. Plaats vervolgens de capillair met de S-sferoïde in een speciale monsterhouder voor microscopie.

Bevestig de monsterhouder met de capillair aan de positioneringstabel van de microscoop en richt de positie van de celsteroïd zodanig uit dat deze gecentreerd en scherp staat. Stel de afstemming tussen de lichtbundel en het brandvlak van de microscoopobjectieflens in het detectiepad in door de positie van de reflectiespiegel en de cilindrische lens aan te passen. Vul de capillair gedurende 30 minuten met foetaal kalfsserum of FCS om latere cellulaire adhesie van een celsteroïd aan de binnenglasoppervlakte te ondersteunen.

Laat de resterende FCS-coating in de uitgeputte capillair minimaal 12 uur drogen na het introduceren van de celsteroïd in de FCS-gecoate capillair. Laat de capillair zoals eerder in de incubator nog eens twee tot vier uur staan om cellulaire adhesie van de steroïd te veroorzaken. Stel vervolgens de flx-gedeelte van het microfluïdische systeem op, inclusief een luchtbelval.

Gebruik een peristaltische pomp om de flx van de slang te vullen met kweekmedium dat de fluorescente kleurstof geneesmiddel of middel bevat. Klem eerst de luchtbelvrije capillair op de uitstroomslang en klem vervolgens de andere kant van de capillair op de afvoerslang. Stel de vloeistoftemperatuur van het waterbad in op de gewenste waarde.

Stel vervolgens de peristaltische pomp in op de gewenste pompsnelheid. Verzamel het gepompte vloeistof in een ontvanger met een open lusopstelling voor dataverwerving en analyse. Stel he