Name: Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer single plane illumination microscopy voor 3D-celspheroïden met een lichtveldmodule voor omgekeerde microscopen. Deze methode maakt hoge-resolutiebeeldvorming van levende cellen en microfluïdische toepassing van fluorescentiekleurstoffen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gefinancierd door de deelstaat Baden-Württemberg, alsmede door de Europese Unie, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. De auteurs danken Rainer Wittig (ILM Ulm) voor het verstrekken van de U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellijn en Claudia Hintze voor bekwame technische bijstand.

1 Cel Sferoïde groeit en Incubation <ol><li> Experiment 1: Cell sferoïden geïncubeerd met een chemotherapeutisch geneesmiddel <ol><li> Bereid agarose 1,5% in kweekmedium door toevoeging van 0,45 g agarose met 30 ml kweekmedium (voldoende voor 6 platen). </li><li> Verwarm het mengsel uit stap 1.1.1 tot ten minste 80 ° C terwijl het roeren van tijd tot tijd. </li><li> Vul 50 ul van het verwarmde mengsel uit stap 1.1.2 in elk putje van een 96-well plaat en laten stollen in 1-2 uur. Bewaar de platen afgesloten en bedekt in de koelkast bij 5 ° C tot gebruik. </li><li> Seed ongeveer 150 MCF-7 borstkankercellen in elke well van de bereide 96-well plaat in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) en Ham&#39;s F-12 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS) en 1% penicilline / streptomycine . </li><li> Groei sferoïden voor 5-7 dagen tot een diameter van ongeveer 200-300 urn in een incubator bij 5% CO2 en 3776, C. </li><li> Incubeer de cel sferoïden met anthracycline antibiotische doxorubicine hydrochloride gedurende 6 uur bij een concentratie variërend tussen 2 pm en 8 urn (in kweekmedium) in een incubator bij 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> Was de cellen met kweekmedium sferoïden of Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS) voor microscopie. </li></ol></li><li> Experiment 2: Oxidatie proces in bolletjes uitdrukken van een redox sensor <ol><li> Seed ongeveer 400 U251-MG-L106 glioblastoomcellen permanent getransfecteerd met het glutathion gevoelige green fluorescent redox sensor Grx1-roGFP2 in agarose-gel beklede putjes (procedure beschreven in stap 1.1.1-1.1.3) van een 96-putjesplaat in DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FCS, 1% penicilline / streptomycine en hygromycine B (150 ug / ml). </li><li> Groei sferoïden voor 5-7 dagen tot een diameter van ongeveer 200-300 urn in een incubator bij 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> Voeg 10 &amp; #181, l waterstofperoxideoplossing (purum pa, ≥ 30%) en 990 gl bi-gedestilleerd water om een ​​100 mM voorraadoplossing te maken te worden gebruikt binnen 12 uur. </li><li> Verdun de stockoplossing van stap 1.2.3 tot 50 uM in EBSS vlak voor het experiment. </li><li> Incubeer de cel sferoïden via het microfluïdische systeem tijdens de meting met waterstofperoxide 50 uM in EBSS voor de oxidatie van de redox sensor. </li></ol></li><li> Experiment 3: Initiatie en etikettering van cellulaire necrose binnen sferoiden <ol><li> Seed ongeveer 400 cellen (bijvoorbeeld U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoma cellen) in agarose-gel beklede putjes (procedure beschreven in stap 1.1.1-1.1.3) van een 96-wells plaat in DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FCS, 1% penicilline / streptomycine en hygromycine B (150 mg / ml). </li><li> Groei sferoïden voor 5-7 dagen tot een diameter van ongeveer 200-300 urn in een incubator bij 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> Incubeer de celsferoïden met het mitochondriale elektronentransport inhibitor rotenon gedurende 3 uur bij een concentratie van 1 uM in kweekmedium cellulaire necrose. Daarnaast co-incuberen met een groene kleurstof cytotoxiciteit voor 3 uur bij een concentratie van 1 gl in 1 ml kweekmedium necrotische cellen te labelen. </li><li> Was de cel bolletjes met kweekmedium of EBSS voor microscopie. </li></ol></li></ol> 2 Licht Gezinsblad Adjustment OPMERKING: Voor het bereiken van de beste resultaten moet worden gewaarborgd dat de bundeldiameter van licht plaat in de focus vlak van de objectieflens. De positie van de bundeldiameter alleen worden aangepast door het observeren van het licht blad in verticale positie ten opzichte van het capillair (zie stap 2,5-2,8). <ol><li> Gebruik een omgekeerde microscoop en zet de SPIM excitatie module, zoals beschreven in Ref. 16, op de voetplaat van de positioneertafel (zie figuur 1A). </li><li> Rust de microscoop met een 10X / 0.3 of 20X / 0,5 microscoop objectief en een geschikt long pass filter (bijvoorbeeld λ ≥ 515 nm) in het detectiepad van de microscoop. </li><li> Monteer een integrerende camera aan de detectie-poort van de microscoop. </li><li> Gebruik een parallelle gerichte lichtstraal van een laser of een laserdiode met een golflengte van 470 nm, bij voorkeur en pas het toe op de SPIM module. </li><li> Draai de cilindrische lens 90 graden, waarbij de lichtwaaier overdraagt ​​in een verticale positie voor een axiale aanpassing van de bundeldiameter van de lichtwaaier. </li><li> Plaats een capillair met een vloeistof met een fluorescerende kleurstof in de monsterhouder. </li><li> Bevestig de monsterhouder met de capillaire de positioneertafel van de microscoop en lijn de positie van de capillaire zodat deze gecentreerd en de bundeldiameter van licht vel in focus. </li><li> Stel de bundeldiameter door variatie van de axiale positie van de cilindrische lens zelf. Terugdraaien van de lens na advertentieren. </li></ol> 3 Cell Sferoïde Toepassing en Microscoop Feed Synchronisatie <ol><li> Plaats de cel sferoïden afzonderlijk of in groepen in rechthoekige borosilicaatglas capillairen 16 met een inwendige dwarsdoorsnede van 600 urn x 600 urn en een wanddikte van 120 urn. Twee technieken voor het aanbrengen van een cel spheroïde hebben bewezen succesvol te zijn. <ol><li> Neem de lege capillaire rechtop, met de duim en middelvinger en sluit de bovenste opening met je wijsvinger. Breng de onderste opening dichtbij de cel sferoïde in omgeving vloeistof (EBSS of kweekmedium). Laat de wijsvinger van de bovenste opening. Vloeistof met de cel spheroïde daarin wordt meteen ondergedompeld in door capillaire krachten. Stel de positie van de sferoïde binnen de gevulde capillair door zwaartekracht in respectievelijke rechtop van de capillair. </li><li> Ook verzoeken de cel spheroid om de capillaire via pipetteren. Verzorgen that de opening van de punt van de pipet, enerzijds, groot genoeg voor de bolvormige grootte en, anderzijds, kleiner of even groot als de binnendiameter van het capillair. </li></ol></li><li> Plaats de capillair met sferoïde daarin in een speciale monsterhouder voor microscopie. </li><li> Bevestig de monsterhouder met de capillaire de positioneertafel van de microscoop en lijn de positie van de cel sferoïde zodat wordt gecentreerd en geconcentreerd. </li><li> Stel de matching tussen het licht plaat en het brandvlak van de microscoop objectief lens in het detectiepad door de positie van de reflecterende spiegel en de cilindrische lens (zie stelschroef in figuur 1B). </li><li> Stel de micrometer (zie Figuur 1B) overeenkomstig de brekingsindices en de numerieke apertuur van de objectieflens het aquarium effect te compenseren. OPMERKING: Verschillende refractie indices van het monster en de media rondom thij objectief leiden tot een verschil tussen de verschuiving van het objectief en de verschuiving van de focal plane. Aangezien de lichtwaaier wordt bewogen door de doelstelling toren wordt de mismatch tussen de verschuiving van de lichtwaaier (overeenkomend met de verschuiving van de objectieflens) en de verschuiving van het brandvlak gecompenseerd door een hefboomarm (zie figuur 1B). De micrometer wordt gebruikt om de afstand tussen de bovenste en de onderste pen aanpassen aan de verschuiving van het licht plaat volgens de numerieke apertuur van de objectieflens en de brekingsindices passen. </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 (A) Foto van de enkel vlak verlichting module gemonteerd op de grondplaat van de positionering tafel van een omgekeerde microscoop, (B) instellen van de enkel vlak verlichtingmodule en de microscoop voer synchronisatie met de opheffing-mismatch (aquarium effect) tussen focal plane en verlichting vliegtuig te compenseren. Az o geeft de verschuiving van de objectieflens en Az f de verschuiving van het brandpuntsvlak en de lichtwaaier. De inlay toont dwarsdoorsneden van spheroïde bevatten haarvaten. Links: rechthoekig capillair met een inwendige diameter van 600 micrometer (wand 120 micrometer). Rechts: Setup gebruikt voor afwisseling. Een rond kanaal capillair (binnendiameter 400 urn, 550 urn buitendiameter) wordt geroteerd binnen de buitenste rechthoekige capillaire. De ruimte tussen de beide capillairen is gevuld met een vloeistof ondergedompeld. 4 Meting in Dynamic Liquid Milieu OPMERKING: De vorige protocol wordt gebruikt voor statische incubatie vóór een meting waarbij de cel bolvormige eerder geïncubeerd en vervolgens in plaats van het capillair door eenvoudige zwaartekracht. Er is geen aanvullende fixatiop. Voor metingen in stromende media waar een dynamisch incubatie en dus een dynamische omgeving wenselijk opnamekinetiek meten is, kan deze sub-protocol volbrengen. Stappen 4,5-4,9 zijn essentieel luchtbellen bereiken van het monster te voorkomen. <ol><li> Vul het capillair met FCS gedurende 30 minuten later cellulaire adhesie van een cel sferoïde het binnenste glazen oppervlak ondersteunen. </li><li> Laat de overblijvende FCS coating in het uitgeputte capillaire drogen gedurende ten minste 12 uur. </li><li> Breng de cel sferoïde de FCS beklede capillaire zoals beschreven in stap 3.2. </li><li> Laat het capillair in de incubator bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 2-4 uur tot extra cellulaire adhesie van de sferoïde veroorzaken. </li><li> Stel de toevloed van het microfluïdische systeem (zie figuur 2). Gebruik van een peristaltische pomp aan de toevloed van de buis vullen (binnendiameter: 0,89 mm) met kweekmedium dat de fluorescerende kleurstof, geneesmiddel of agens. </li><li> ConneCT toevloed van het microfluïdische systeem naar een opvanginrichting (zie figuur 2). </li><li> Klem eerst de capillaire luchtbellen de toevloed buis en klem de andere zijde van de capillaire de afvoerslangen. </li><li> Stem de vloeistof temperatuur van het waterbad de gewenste waarde (bijvoorbeeld 37 ° C). </li><li> Stel de peristaltische pomp naar de gewenste pomp snelheid (bijvoorbeeld, stroomsnelheid: 9 pl / min; pomp snelheid in de capillaire: 25 mm / min). </li><li> Verzamel de te verpompen vloeistof, hetzij in een ontvanger (open-loop setup), voer het terug naar de bron (closed-loop setup) of voer deze direct in de slang van de peristaltische pomp (strakke closed-loop setup). </li></ol><img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Microfluidic setup (open-loop en strakke closed-loop); inlay: Verlichting van een spheroid binnen een micro-capillaire middels lichtwaaier gebaseerd fluorescentie microscopie gekoppeld met een omgekeerde microscoop. 5 Data Acquisition and Analysis <ol><li> Stel het laservermogen en de integratie tijd voor de afbeelding overname. </li><li> Zorg ervoor dat de parameters gedefinieerd in stap 5.1 niet overschrijden lichte dosis waarden ongeveer 50-100 J / cm 2 voor inheemse cellen of 10-20 J / cm 2 voor de cellen geïncubeerd met een fluorescerende kleurstof of getransfecteerd met een fluorescerend eiwit coderen plasmide voorkomen fototoxiciteit (voor details zie Ref. 12). </li><li> Stel de stapgrootte voor de z-stapel Az = 5-10 urn die voorkeur 3 dimensionale data analyse licht plaatdikte ongeveer 10 urn. </li><li> Voeren metingen van afzonderlijke beelden of z-stacks door variatie van de focal plane in de cel spheroïde. </li></ol>

<ol><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1990).</li>
<li>Webb, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Confocal optical microscopy.</a> Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>König, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).</li>
<li>Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+obtaining+optical+sectioning+by+using+structured+light+in+a+conventional+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope.</a> Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high+throughput+screening%3A+the+multi-cellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+fluorescence+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells.</a> J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).</li>
<li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027(2010).</li>
<li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li>
<li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518(2012).</li>
<li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li>
<li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li>
<li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li>
<li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007(2013).</li>
<li>Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , 7,787,179 B2 (2010).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li>
<li>Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , EP 13 184 931.7 (2013).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De onderhavige manuscript beschrijft een lichtwaaier of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) inrichting die is geoptimaliseerd voor 3-dimensionele celsystemen, bijvoorbeeld meercellige bolvormige tumoren (MCTS). Drie illustratieve toepassingen omvatten (1) opname van een cytostaticum en de gedeeltelijke omzetting in een afbraakproduct (waarvan de bijdrage aan chemotherapeutische werkzaamheid nog worden geëvalueerd), (2) metingen van de redox toestand door toepassing van een genetisch gecodeerde glutathion ...

Naast gevestigde werkwijzen (confocale of meerdere foton laser scanning microscopie 1-4, gestructureerde verlichting microscopie 5,6) lichtwaaier of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) blijkt een waardevolle werkwijze voor 3D beeldvorming 7,8 zijn, 9. Van bijzonder belang is de toepassing ervan op 3-dimensionale celculturen, bijvoorbeeld, meercellige bolvormige tumoren (MCTS), die steeds meer worden gebruikt voor het geneesmiddelenonderzoek 10,11. Bovendien SPIM een preferentieel methode wanneer zelfs na langdurige blootstelling of herhaalde metingen lage lichtdosis moeten levensvatbaarheid van het monster te handhaven aangezien voor het meten van elk vlak van het monster enige dit vlak wordt blootgesteld aan licht. Dit in tegenstelling tot andere microscopische technieken, waarbij voor detectie van elke focal plane het gehele monster wordt verlicht, zodat bij opnamen van meerdere vlakken de lichtdosis vat en kan als monster 12 worden beschadigd. </p&gt; Lichtwaaier microscopie of SPIM is gebaseerd op verlichting van het monster in loodrechte richting op de waarneming pad hetzij door gebruik van een cilindrische lens of door het scannen van de spannende laserstraal (voor een overzicht zie Ref. 8). Dit vereist vaak speciale monstercompartimenten 13,14 of matrices, bijvoorbeeld agarose 7,15, in speciale high-cost microscopen geïmplementeerd. Als alternatief voor deze systemen een relatief eenvoudige verlichtingsinrichting voor SPIM ontwikkeld en aangepast om een conventionele omgekeerde microscoop 16 (zie figuur 1). Het bestaat uit een laserstraal uitgebreid tot een diameter van 8 mm en gefocusseerd door een cilindrische lens (brandpuntsafstand: 50 mm, numerieke opening: 0,08) een lichte vel van 6-10 urn dikte over een scherptediepte van ongeveer 100 urn . Monsters worden in een rechthoekige capillaire van 600-900 urn binnendiameter geplaatst voor het microscoopobjectief lens voor fluorescentiedetectie. De voornaamste kenmerken worden thans voltooid en geoptimaliseerd door het gebruik van geavanceerde micro-capillaire benaderingen voor het vasthouden en roteren van de monsters, de synchrone aanpassing van het lichtdoorlatende lichtwaaier (in axiale richting) en de objectieflens voor fluorescentiedetectie (identiek lichtweg lengten van verplaatsing vereisen een correctie van de mechanische aanvoer), en het aanpassen van een microfluïdische systeem voor de toepassing van fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen, waardoor de vereiste hoeveelheden en kosten minimaliseren.

<table><tbody><tr><td>Microtiterplaat</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>Voor celsferoïden groei</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>Voor celsferoïden groei</td></tr><tr><td>MCF-7 cel lijn</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>Cel lijn</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 cel lijn</td><td></td><td></td><td>Cel lijn</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Kweekmedium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Cel kweeksupplement</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>PAA Laboratories&nbsp;&nbsp;</td><td>P02-015</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Cel kweeksupplement</td></tr><tr><td>Doxorubicine</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Fluorescente kleurstof (VOORSICHT: acute toxiciteit)</td></tr><tr><td>Groene cytotoxiciteitskleurstof</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluorescente cytotoxiciteitskleurstof</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Cellulaire remmer (VOORSICHT: acute toxiciteit)</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Reagens voor oxidatie (VOORSICHT: acute toxiciteit)</td></tr><tr><td>Capillair</td><td>VitroCom&nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Steekproefvoorbereiding</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-camera</td></tr><tr><td>AxioVision data-acquisitiesoftware</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>versie 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Laserdiode</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Gebruikt met driver PDL800-B</td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Opnieuw gekalibreerd om de minimale pompsnelheid met 1/10 te verminderen&nbsp;</td></tr><tr><td>Siliconen buizen</td><td>IDEX Health &amp; Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

single plane verlichting module en micro-capillaire aanpak voor een wide-field microscoop

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Een module voor lichte sheet of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen, bijvoorbeeld meercellige bolvormige tumoren (MCTS). De SPIM excitatie module vormen en buigt het licht zodanig dat het monster wordt verlicht door een lichtbron plaat loodrecht op het detectiepad van de microscoop. Het systeem wordt gekenmerkt door het gebruik van een rechthoekige capillaire voor het houden (en in een geavanceerde versie ook een micro-capillaire benadering voor het roteren) de monsters bij synchrone verstelling van de lichtdoorlatende plaat licht en de objectieflens voor fluorescentiedetectie en door aanpassing van een microfluïdische systeem voor de toepassing van fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden. Een protocol voor het werken met dit systeem wordt gegeven, en enkele technische gegevens gerapporteerd. Representatieve resultaten omvatten (1) metingen van de upnemen van een cytostaticum (doxorubicine) en de gedeeltelijke omzetting in een afbraakproduct, (2) redox metingen met behulp van een genetisch gecodeerde glutathion sensor na toevoeging van een oxidatiemiddel, en (3) initiatie en etikettering van celnecrose op remming van de mitochondriale ademhalingsketen. Verschillen en voordelen van de onderhavige SPIM module ten opzichte van bestaande systemen worden besproken.

Experiment 1: Cell sferoïden geïncubeerd met een chemotherapeutisch geneesmiddel A z-stack scan van een eerder geïncubeerd MCF-7 cellen sferoïde (8 uM doxorubicine, 6 uur) is weergegeven in figuur 3. Het geeft gedetailleerde informatie over de cellulaire opname en verdeling van doxorubicine 17 en het afbraakproduct 18,19. Binnen de buitenste cellaag van de bolvormige rode fluorescerende doxorubicine wordt hoofdzakelijk gelokaliseerd in ...

Een module voor enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een ​​omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen. Het monster is gelegen in een rechthoekige capillaire en via een microfluïdische systeem fluorescente kleurstoffen kunnen farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden worden toegepast.

Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

Het algemene doel van deze procedure is om single plane verlichtingsmicroscopie uit te voeren met behulp van een lichtbundel excitatiemodule voor omgekeerde microscopen en deze toe te passen op driedimensionale celsferoïden. Dit wordt bereikt door eerst een pipette te gebruiken om een celsferoïde over te brengen van de put van een microtiterplaat naar een tweede put om na het wassen te incuberen. De S-sferoïde wordt vervolgens geïntroduceerd in een rechthoekige capillair.De tweede stap is om de lichtbundelverlichtingsmodule te monteren op de basisplaat van de positioneringstabel van de omgekeerde microscoop. Vervolgens wordt de capillair met de steroïd in een speciale monsterhouder voor microscopie geplaatst. De laatste stap is om de afstemming tussen de lichtbundel en het brandvlak van de microscoopobjectieflens in het detectiepad in te stellen.Uiteindelijk kunnen driedimensionale fluorescentiemetingen worden uitgevoerd door de variatie van het brandvlak binnen de celsferoïde om informatie te verkrijgen van enkele beelden of Zacks over de opname van geneesmiddelen of de structuur van de S-sferoïde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande lichtbundel

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Een lensless on-chip fluorescentie microscopie platform is aangetoond dat kan afbeelding fluorescerende voorwerpen over een ultra-breed-of-view van bijvoorbeeld,&gt; 0,6-8 cm2 met &lt;4μm resolutie met behulp van een steekproef op basis van compressie-algoritme decodering. Zo'n compacte en wide-field fluorescerende on-chip beeldvormende modaliteit kan waardevol zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en microarray-analyse.

Lensless fluorescentie microscopie op een chip

De complete bouw van een aangepaste, real-time confocale scanning imaging-systeem is beschreven. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden gebruikt voor video-rate microscopie en microendoscopy, zorgt voor een scala aan imaging-geometrieën en toepassingen die niet toegankelijk zijn met behulp van standaard commerciële confocale systemen, tegen een fractie van de kosten.

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van &lt;1 um heeft x &lt;1 um x &lt;3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100...

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Een gedetailleerde instructies wordt beschreven op het bouwen van een sterk geneigd geveegd Tegel (HIST.) Microscoop en het gebruik ervan voor single-molecuul imaging.

Een gids voor het bouwen van een sterk geneigd geveegd tegel Microscoop voor uitgebreide veld-of-view Single-molecuul Imaging

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Leer single plane illumination microscopy voor 3D-celspheroïden met een lichtveldmodule voor omgekeerde microscopen. Deze methode maakt hoge-resolutiebeeldvorming van levende cellen en microfluïdische toepassing van fluorescentiekleurstoffen mogelijk.

Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop

Meer video's verkennen