Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Het algemene doel van deze procedure is om de diffusiewet van lipiden en eiwitten in levende celmembranen te meten om dit te doen. Eerst wordt de puntspreidingsfunctie van de microscoop gekalibreerd door middel van beeldvorming van nanoscopische fluorescente kralen. Vervolgens worden liposoom-gebaseerde vectoren, inclusief een fluorescent gelabeld molecuul van belang, bereid en geïntroduceerd in levende cellen, hetzij door transfectie of directe incorporatie.

Snelle beeldvorming van het plasmamembraan van levende cellen wordt uitgevoerd door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Ten slotte wordt de correlatiefunctie berekend en wordt de moleculaire diffusiewet geëxtraheerd door Gaussische aanpassing. De resulterende gegevens.

Identificeer de bewegingsmodus van het lipide of eiwit dat onderzocht wordt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele fluorescentie herstel na fotobleken benadering of klassieke enkele puntfluorescentie correlatiespectroscopie is dat het mogelijk maakt om de moleculaire diffusiewet te meten. We kennen een prioriteit kennis van het systeem.

Ook in tegenstelling tot klassieke enkele deeltje tracking methodologieën. Hier worden moleculaire verplaatsingen gemeten zonder dat er deeltjesbanen hoeven te worden geëxtraheerd. Als gevolg hiervan kan deze methode gemakkelijk worden gebruikt in combinatie met relatief dichte en dicht gelabelde moleculen, zoals bijvoorbeeld genetisch gecodeerde fluorescente eiwitten.

In het algemeen kan deze methode helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de cellulaire moleculaire biologie, zoals hoe de beweging van eiwitten of lipiden de structuur en functionele organisatie van het plasmamembraan reguleert. Antwoorden op deze en gerelateerde vragen zullen beschikbaar worden gesteld voor iedereen en door alleen een commerciële microscoop te gebruiken, zal de demonstratie van de algemene procedure worden uitgevoerd door zo, een promovendus uit het lab. Begin dit protocol door de puntspreidingsfunctie van het beeldvormingssysteem te kalibreren. Begin door 10 microliter van een oplossing met fluorescente kralen te verdunnen in 90 microliter gedistilleerd water dat eerder werd toegevoegd aan een centrifugebuis van 500 microliter.

Sonifiseer de oplossing gedurende 20 minuten in een sauna catheterbehandeling met behulp van een scalpel, snijd een vierkant stuk van één centimeter van 3% AGA rose gel en plaats het in een petrischaal. Deponeer 10 microliter van de verdunde fluorescente kraaloplossing bovenop het gel. Gebruik vervolgens een pincet om het gel in een glazen petrischaal van twee centimeter te keren.

Gebruik weer een pincet. Druk op het stuk gel om de druppel te verspreiden. Schakel vervolgens de opname-instelling in, die bestaat uit een commerciële totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop.

Uitgerust met een incubator en een snelle E-M-C-C-D camera die is aangesloten op een computer die een li a-toepassingssuite, geavanceerde fluorescentiesoftware en en of Solis beeldverwervingssoftware uitvoert. Plaats het monster in de houder op het microscoopplatform met behulp van het I-stuk en doorgelaten licht. Richt je op de rand van het gel.

Centreer vervolgens het gel boven het objectief en pas de focus aan om de laseruitlijnprocedure in de Leica toepassingssuite, geavanceerde fluorescentiesoftware te starten. Selecteer auto-uitlijnen en volg de automatische uitlijnprocedure. Nadat de laser is uitgelijnd in de en of Solis acquisitiesoftware, klikt u op de knop instellingen. Er wordt een venster geopend.

Stel de camera-expositie in op 100 milliseconden, de EM-versterking op 1000, de herhaling op 100 en vink het selectievakje voor frameoverdracht aan. Klik vervolgens op het venster automatisch opslaan en voer de naam van het experiment in. Zoek een gezichtsveld met geïsoleerde enkele spots.

Richt u op een heldere spot, die meestal een kralenaggregat vertegenwoordigt. Verwerf vervolgens 100 frames. Herhaal deze stap vijf tot zes keer om afbeeldingen van verschillende enkele spots te verkrijgen.

Importeer de verworven serie in een dataverwerkingsprogramma zoals MATLAB en gemiddeld de stack in de tijd. Toon vervolgens het gemeten gemiddelde intensiteitsbeeld. Zoom in op een heldere, kleine fluorescente spot en identificeer grof het centrum als het helderste pixel van de spot.

Selecteer tenslotte de grootte van het gebied van interesse dat u rond het deeltje wilt tekenen, typisch een micrometer, ernaast om de geselecteerde intensiteitsverdeling met een Gauss-functie te passen. Selecteer de opdracht gause-aanpassing. Inspecteer de verkregen restwaarden om de goedheid van de pas te verifiëren.

Calibreer tenslotte de camera zoals beschreven in het bijbehorende document. Zodra het systeem is gekalibreerd, is het tijd om de cellen te labelen voor beeldverwerving. Begin met het voorbereiden van de liposomen die nodig zijn voor lipide-incorporatie door een milligram DOPE, een milligram D-O-T-A-P en een milligram PPE ADO 4 88 elk op te lossen in een afzonderlijke microcentrifugebuis die een milliliter chloroform bevat.

Combineer vervolgens 0,5 milliliter van de DOPE- en D-O-T-A-P-oplossingen met 25 microliter PPE ATO 4 88-oplossing. Plaats de buis in een centrifugaal verdamper en start de draai met 280 gs. Start de vacuümpomp en laat deze 24 uur draaien.

De volgende dag voegt u 0,5 milliliter van 20 millimolair heis-buffer toe aan de buis en schudt deze gedurende 15 minuten. Plaats vervolgens de buis in een sonische catheterbehandeling en sonifiseer gedurende 15 minuten bij 40 graden Celsius. Om de cellen voor te bereiden, spoelt u een P 100 schaal met confluent Chinese hamster ovary of CHOK een cellen drie keer met 10 milliliter PBS.

Voeg vervolgens een milliliter trypsine toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na de incubatie voegt u negen milliliter D-M-E-M-F 12 toe, aangevuld met 10% FBS, om de cellen te suspenderen. Zaai 150 microliter van deze celbevattende oplossing in een 22 millimeter glazen bodem petrischaal die 800 microliter van hetzelfde medium bevat.

Incubeer de cellen gedurende