Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test
14 september 2014
Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.
Het algemene doel van het volgende experiment is om RIC HIV-een envelop glycoproteïnen of ENV-bevestiging te ondervragen met monoklonale antilichamen. Dit wordt bereikt door eerst adhesiecellen te transecteren om chimerische HIV-een E NV-eiwitten op het celoppervlak tot expressie te brengen. Als tweede stap worden de cellen geïncubeerd met anti ENV-monoklonale antilichamen, die ENV zullen binden, afhankelijk van de blootstelling van het epitoop.
Vervolgens wordt een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam toegevoegd om de antilichaaminteractie te kwantificeren door middel van een chemiluminescentie-assay. Er worden resultaten verkregen die relatieve niveaus van VNV-gebonden antilichamen laten zien op basis van de relatieve lichteenheden die voor elk zijn verkregen. Nou, het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals feiten-gebaseerd binden, is dat deze techniek kan worden uitgevoerd met een lage hoeveelheid antilichamen en met een hoge doorvoer, een postdoc in het lab zal deze techniek uitvoeren.
Menselijke osteosarcoma-cellen worden gebruikt in dit experiment één dag vóór de transfectieplaat, twee keer 10 tot de vierde cellen per putje. In een ondoorzichtige 96-putjes celkweekplaat geschikt voor luminescentie-meting. Gebruik delcos gemodificeerd arendsmedium gesupplementeerd met foetaal bovien serum en penicilline-streptomycine. Bewaar de cellen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide op de volgende dag.
Bereid het transfectiemengsel. Leg eerst twee buisjes neer, twee bay en twee B naar twee bay. Voeg vijf microliters DMEM toe dat is gesupplementeerd met 25 millimolair hippies, gevolgd door 10 nanogram tat en coating plasmide, en 150 nanogram van chimerisch HIV-een envelop glycoproteïne coderend plasmide.
Merk op dat het TAT-coderende plasmide alleen vereist is wanneer een tat-afhankelijk HIV-een envelop glycoproteïne coderend plasmide wordt gebruikt om twee B op vijf microliters DMM en 450 nanogram polyethyleen of PEI te maken. De hoeveelheden van de reagentia en DNA moeten worden aangepast aan het aantal putjes dat met hetzelfde HIV-een envelop glycoproteïne moet worden getransfecteerd. Voeg vervolgens de inhoud van twee B naar twee bay toe en meng grondig door 10 seconden te vortexen.
Bewaar het transfectiemengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 10 minuten 10 microliters van het transfectiemengsel per putje van de 96-putjesplaat toe en bewaar 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofoxide. De Ali SA om de herkenning van chimerisch HIV-een envelop glycoproteïne door monoklonale antilichamen te bestuderen, wordt twee dagen na de transfectie van de menselijke osteosarcoma-cellen uitgevoerd.
Bereid 250 milliliter wasbuffer per plaat voor die tegelijkertijd wordt gebruikt. Bereid 125 milliliter blokkeerbuffer per plaat door 1% vetvrij melkpoeder en vijf millimolair tris pH 8,0 toe te voegen aan de wasbuffer. Verwijder het celkweekmedium en transfectiemengsel van de 96-putjesplaat.
Voeg 100 microliter blokkeerbuffer per putje toe en bewaar gedurende 20 minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en voeg 50 microliter antilichaam per putje toe, verdund tot de juiste concentratie in blokkeerbuffer. Bewaar gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Was drie keer met 100 microliter blokkeerbuffer en herhaal vervolgens het wasproces drie keer. Was drie keer met 100 microliter blokkeerbuffer en was vervolgens drie keer met 100 microliter wasbuffer na de laatste wasbeurt. Verwijder de sate.
Voeg 100 microliter blokkeerbuffer toe en bewaar gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en voeg 50 microliter secundair antilichaam toe, verdund 1 tot 3000 in blokkeerbuffer. Bewaar gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur na 40 minuten.
Was drie keer met 100 microliter blokkeerbuffer, gevolgd door drie wasbeurten met 100 microliter wasbuffer. Om de monsters voor data-acquisitie voor te bereiden, verwijder het supernatant van de 96-putjesplaat en voeg 30 microliter van een x verbeterde chemiluminescentie-substraat per putje toe. Verkrijg chemiluminescentie-signaal gedurende één seconde per putje op een geschikte platenlezer.
Volgens de instructies van de fabrikant werd de invloed van oplosbaar CD vier of S CD vier op de blootstelling van CD vier I-epitopen op envelop glycoproteïnen of ENV geëvalueerd door interactie van CD vier met ENV induceert ENV-conformatieveranderingen die 17 B en 48 D-epitopen blootleggen die overlappen met de co-receptor bindingsplaats, maar heeft geen invloed op het buitenste domein dat antilichaam twee G 12 herkent. Om de impact van puntmutaties in de NV-bevestiging te beoordelen, werden twee ENV-mutanten gebruikt H 66 A, die een verminderde neiging heeft om spontaan de CD vier gebonden conformatie te bemonsteren, en S3 75 W, die de NV predisponeert voor de CD vier gebonden toestand. Normalisatie van de ruwe gegevens volgens expressieniveaus, onthult dat H 66 A de CD vier I 17 B-herkenning vermindert, terwijl S3 75 W het 17 B-signaal verbetert en voldoende is om het fenotype van de H 66 te herstellen.
Een mutant testende cellen cot getransfecteerd met toenemende hoeveelheden van een CD vier expressor. Samen met de NV blauwe balken werden toenemende signalen voor CD vier I monoklonale antilichamen A drie, twee en C 11 onthuld, die discontinuële epitopen in het binnenste domein van het ENV-glycoproteïne herkenden. GP een 20 ENV-herkenning door het twee G 12-antilichaam werd niet beïnvloed.
Ten slotte werden de ruwe gegevens genormaliseerd naar twee G 12, het ontbreken van een 32 en C 11-modulatie wanneer ENV werd cot getransfecteerd met een CD vier-mutant met verminderd vermogen om met ENV te interageren, geeft aan dat de toegenomen signalen afhankelijk zijn van E NV
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de conformatie van HIV-1 envelop-glycoproteïnen en hun interactie met monoklonale antilichamen. Er wordt gebruikgemaakt van een celgebaseerde ELISA-assay om de binding van specifieke anti-Env-antilichamen te evalueren aan trimerisch HIV-1 Env dat tot expressie komt op het oppervlak van getransfecteerde cellen.
Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek
Wetenschappelijk vakgebied
- Virologie
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van virale oppervlakteantigenen is cruciaal voor de ontwikkeling van vaccins.
- Antilichaamneutralisatie wordt beïnvloed door de conformatie van deze antigenen.
- Bestaande methoden vereisen mogelijk grotere hoeveelheden antilichamen en zijn minder efficiënt.
- Deze studie introduceert een high-throughput techniek voor het bestuderen van antilichaaminteracties.
Doel van de studie
- Om de conformatie van HIV-1 Env-eiwitten te onderzoeken.
- Om de binding van monoklonale antilichamen aan deze eiwitten te beoordelen.
- Om een efficiëntere assay te ontwikkelen voor de analyse van antilichaamsinteracties.
Gebruikte methoden
- Transfectie van adherente cellen om chimere HIV-1 Env-eiwitten tot expressie te brengen.
- Incubatie van cellen met anti-Env monoklonale antilichamen.
- Gebruik van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen voor kwantificering.
- Meting van chemiluminescentie om de bindingsniveaus van antilichamen te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Aangetoonde binding van antilichamen aan HIV-1 Env op basis van epitopenblootstelling.
- Relatieve niveaus van antilichaaminteractie weergegeven in lichteenheden.
- Voordelen van de assay ten opzichte van traditionele methoden aangetoond.
- Analyse mogelijk gemaakt met lagere hoeveelheden antilichamen en een hogere doorvoer.
Conclusies
- De celgebaseerde ELISA-assay is effectief voor het bestuderen van HIV-1 Env-conformaties.
- Deze methode kan het ontwerp van betere vaccinimmunogenen faciliteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek voor verder onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze celgebaseerde ELISA-assay maakt high-throughput evaluatie van HIV-1 Env conformationele toestanden mogelijk met minimale hoeveelheden antilichamen, wat vroegtijdige screening van immunogenen en karakterisering van antilichamen ondersteunt. Door veranderingen in epitopenblootstelling te detecteren die worden geïnduceerd door CD4 of cellulaire eiwitten, biedt de assay kwantitatieve resultaten die beslissingen over vaccinontwerp informeren en mechanistische ambiguïteit bij doelwitvalidatie verminderen. De aanpasbaarheid van de methode voor de analyse van mutante Env en screening van oplosbare liganden positioneert deze als een herbruikbaar discovery-instrument voor het prioriteren van kandidaten met gunstige antigenische profielen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door conformationele-afhankelijke antilichaambinding aan HIV-1 Env-trimeren te meten.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van Env-doelwitten mogelijk via epitooppspecifieke detectie onder gedefinieerde condities.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door antigenen te identificeren die sleutelepitopen zoals 17B of 48D blootleggen bij CD4-binding.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde, door cellen tot expressie gebrachte trimerische Env voor voor downstream antilichaamscreeningcampagnes.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, op chemiluminescentie gebaseerde read-outs die geschikt zijn voor medium- tot high-throughput formaten.
- Schaalbaarheid: Vereist minimale gespecialiseerde apparatuur, waardoor brede adoptie in discovery-labs mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Koppelt de blootstelling van conformationele epitopen aan functionele resultaten die relevant zijn voor door vaccins opgewekte immuniteit.
- Mechanische risicoreductie: Evalueert hoe puntmutaties (bijv. H66A, S375W) de sampling van CD4-gebonden toestanden door Env veranderen, wat inzicht geeft in de stabiliteit van het immunogeen.
- Preklinische afstemming: Ondersteunt de beoordeling van antilichaamherkenningspatronen die correleren met de neutralisatiebreedte.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van antigeendesign tot identificatie van leidende antilichamen, waardoor iteratieve verfijning van Env-immunogenen op basis van conformationele profilering mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Onderzoekt hoe oplosbare liganden of mutaties de Env-conformatie en de toegankelijkheid van epitopen beïnvloeden.
- Screening: Genereert kwantitatieve antibody-bindingsgegevens via chemiluminescentie voor de selectie van hits in antibody-panels.
- Analytics: Normaliseert het signaal ten opzichte van expressiecontroles (bijv. 2G12) om conformatiespecifieke effecten te isoleren van expressievariabiliteit.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de blootstelling van epitopen in het binnenste domein (bijv. 17B, 48D) met de toegankelijkheid van de co-receptorbindingsplaats, wat relevant is voor het ontwerp van entry-inhibitoren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een modulair platform voor het evalueren van diverse Env-varianten, antibodies of liganden zonder de kernworkflow opnieuw te hoeven formatteren.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in antigeniciteit door conformatie te koppelen aan antilichaamsherkenning.
- Operationele waarde: Vermindert het verbruik van reagentia en de assaytijd, wat snelle iteraties bij de optimalisatie van antilichamen/antigenen ondersteunt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig kwantitatief inzicht te bieden in de structurele toestanden van Env.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunogenen mogelijk op basis van hun vermogen om vaccine-relevante conformaties aan te nemen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in transfectie van zoogdiercellen en het hanteren van antilichamen.
- Afhankelijk van toegang tot een plaatlezer met luminescentiemeting en een standaard infrastructuur voor celkweek.
- Vereist standaardisatie van blokkeer- en wasbuffers tussen teams voor een reproduceerbaar signaal.
- Moet rekening houden met variabiliteit in Env-expressieniveaus bij het vergelijken van mutanten of condities.
- Beperkt tot op het oppervlak tot expressie gekomen, conformationeel intacte trimeren; vangt mogelijk geen intracellulaire intermediairen op.
