Name: Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer een cel-gebaseerde ELISA-test voor de conformatie-evaluatie van HIV-1 Env-trimeren met behulp van monoklonale antilichamen. Deze methode maakt hoogdoorvoeranalyse van antilichaambinding mogelijk met lage hoeveelheden antilichamen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr James Robinson voor zijn gulle gift van de A32, 17b, 48d, en C11 mAbs. PGT 121 werd verkregen door het NIH AIDS reagens Program, Afdeling van aids, NIAID, NIH (Cat # 12343). Dit werk werd ondersteund door een Canada Foundation for Innovation Leader Programma # 29866, door een CIHR operationele # 257792, door een FRQS Oprichting van Young Scientist verlenen # 24639 voor AF en door een CRCHUM continuüm subsidie, alsmede door een CIHR katalysator subsidie ​​# 126630 naar AF en MR. AF is de ontvanger van een FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 fellowship # 24639. MV werd ondersteund door een CIHR Doctoral Research Award # 291485.

1 Dag 1 - Cell Culture <ol><li> Plate 2 x 10 4 humane osteosarcoom (HOS) cellen per putje in een ondoorzichtige, 96-well celcultuur plaat geschikt voor luminescentie lezen. Gebruik Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine. Incubeer tot de volgende dag bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 2 Dag 2 - Polyethylenimine (PEI) Transfection <ol><li> Bereid transfectie mix volgens daaropvolgende stappen. Pas reagentia en hoeveelheden DNA volgens het aantal putten die worden getransfecteerd met hetzelfde Env. </li><li> Buis A: Voeg 10 ng Tat-encoding plasmide (zoals ptat-III-27) en 150 ng env-encoding plasmide tot 5 pl DMEM aangevuld met 25 mM HEPES. </li><li> De Tat coderende plasmide alleen vereist wanneer Tat-afhankelijke env coderende plasmiden zoals pSVIII. </li><li> Tube B: Voeg 450 ng PEI (van een 1ug / ul oplossing) tot 5 pl DMEM. </li><li> Inhoud van buis B Naar buis A. Meng goed door vortexen gedurende 10 seconden en incubeer transfectiemengsel 10 min bij kamertemperatuur (22 ° C). </li><li> Voeg 10 ul van de transfectie mix per putje van de 96-well plaat. Incubeer 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 3 Dag 4 - ELISA <ol><li> Voer alle experimenten bij kamertemperatuur mogelijk endocytose van Env / antilichamen complexen te minimaliseren. </li><li> Bereid 250 ml wasbuffer per plaat gebruikt op hetzelfde moment. Wasbuffer is 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl), aangevuld met 1 mM MgCl2 en 1,8 mM CaCl2. </li><li> Bereid 125 ml Blocking Buffer per plaat door toevoeging van 1% magere melkpoeder en 5 mM Tris pH 8,0 tot wasbuffer. </li><li> Verwijder celkweek media en transfectie mix (supernatant) van 96-well plaat. </li><li> Voeg 100 μ, L Blocking Buffer per putje en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg 50 ul antilichaam (of serum) per putje, verdund tot de juiste concentratie in Blocking Buffer. Typisch, gebruiken een concentratie van 1 ug / ml. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 3x met 100 ul Blocking Buffer en herhaal wasproces 3x met 100 ul Washing Buffer. </li><li> Verwijder supernatant, voeg 100 pl Blocking Buffer en incubeer 5 min bij RT. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 50 ul van secundair antilichaam, verdund 1/3000 in Blocking Buffer. Variëren optimale verdunning Antilichaam volgens fabrikant verschillen. Incubeer 40 min bij kamertemperatuur. </li><li> Was 3x met 100 ul Blocking Buffer en herhaal wasproces 3x met 100 ul Washing Buffer. </li></ol> 4 Data Acquisition <ol><li> Verwijder supernatant uit de plaat en voeg 30 ul 1x versterkte chemiluminescentie (ECL) substraat per putje. </li><li> Verwerven chemiluminescence signaal voor 1 sec / well op een geschikte plaat-lezer volgens de instructies van de fabrikant. Leestijd kunnen verschillen afhankelijk van de hardware verschillen. </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
<li>Bonsignori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity-Mediating+Antibodies+from+an+HIV-1+Vaccine+Efficacy+Trial+Target+Multiple+Epitopes+and+Preferentially+Use+the+VH1+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family.</a> J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).</li>
<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Deze test is geoptimaliseerd om de interactie van specifieke mAbs gedetecteerd met HIV-1 trimere Env tot expressie op het celoppervlak. Nadat het protocol is vastgesteld, kan het gebruikt worden op de middellange tot hoge doorvoersnelheden met lage totale materiaalkosten en kleine hoeveelheden van antilichamen. Aangezien deze test is-gebaseerde transfectie, kan gemakkelijk worden gebruikt voor co-expressie van cellulaire eiwitten zoals CD4 om hun effecten op Env conformatiebepaling. De trans...

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) invoer, gemedieerd door de trimere virale envelop glycoproteïnen (Env) is de eerste stap van de infectieuze cyclus. Als enige zichtbare virale antigeen gepresenteerd op het oppervlak van virions, de Env trimeer wekt neutraliserende antilichamen en nonneutralizing. Als zodanig vertegenwoordigt een interessante kandidaat voor vaccin immunogeen design. Echter, vaccinatie studies met env in oplosbare of recombinante vormen uitgelokt reacties met slechts minimale effectiviteit tegen de meeste primaire HIV-1-isolaten 1-3. Toch gedeeltelijke werkzaamheid waargenomen in de RV144 vaccinproef 4 hernieuwde interesse in HIV-1 env als een immunogeen kandidaat. Dit werd bevestigd door een recente studie beschrijft dat vaccin opgewekte anti-Env antilichamen voldoende om een zekere mate van bescherming tegen SIV en HIV genereren uitdagingen 5. Na gesynthetiseerd in het endoplasmatisch reticulum, de Env glycoprotein precursor, gp160, ondergaat verschillende post-translationele modificaties die kritisch zijn voor zijn vermogen om het virale fusieproces brandstof. De Env voorloper moet goed en associate vouwen in trimers alvorens te worden gesplitst in de extra-cytoplasmatische gp120 en gp41 transmembraan subeenheden 6-10, met niet-covalente interacties handhaven van de gp120-gp41 liaison. De geïnfecteerde cel machine is ook verantwoordelijk voor zwaar glycosylerende Env, die ongeveer 50% van zijn totale massa 11,12. De resulterende complexe structuur laat Env te conformatie flexibele 13,14, terwijl het verstrekken van een metastabiliteit waarvan wordt gedacht om Env aan te passen en te verbergen bepaalde zeer immunogeen epitopen die anders zouden worden blootgesteld 15-19, met de nadruk op het belang om beter te begrijpen van de verschillende conformaties bemonsterd door de inheemse Env trimeer. Tot op heden zijn diverse technieken ontwikkeld en met succes gebruikt om Env conformationele ch studerenanges. Echter, ze verschillen in hun beperkingen, worden vaak beperkt tot specifieke contexten Env. Bijvoorbeeld, oppervlakte plasmon resonantie of immunoprecipitatie assays gebruikt conformatie specifieke monoklonale antilichamen (mAbs), beroepen op monomere oplosbare of gesolubiliseerde Env moleculen die bekend zijn immunogenetically verschillend van hun trimere vormen 20,21 zijn. Recente studies suggereren ook dat de splitsing van invloed Env conformaties waardoor de blootstelling van epitopen vooral herkend door nonneutralizing antilichamen 14,22,23. Hier beschrijven we in detail een werkwijze die zorgt voor gemakkelijk bepalen van de conformatie van-cellulair tot expressie Env trimeren 18,24-26. Na transiënte transfectie van Env in een menselijke hechtende cellijn de binding van Env-specifieke antilichamen gedetecteerd met behulp van een eenvoudige chemiluminescentie reactie. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de conformationele voorkeur karakteriseren van conformatie-afhankedent antilichamen. Aldus deze test verschaft een robuuste en zeer flexibele detectiemethode.

<table><tbody><tr><td>HOS cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Witte ondoorzichtige weefselkweekplaat, 96-well, Platte bodem</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenimien, lineair, 25.000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Bereidt in 1 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagles Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Geit Anti-menselijke IgG, Peroxidase Geconjugeerd</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced Chemiluminescence Substraat</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, Plate Reader</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

conformationele evaluatie van hiv-1 trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde elisa test

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelop glycoproteïnen (Env) mediëren virale binnenkomst in doelcellen en zijn essentieel voor de infectiecyclus. Het begrijpen hoe deze glycoproteïnen in staat zijn om het fusieproces aan te drijven door hun conformationele veranderingen, zou kunnen leiden tot het ontwerp van betere, effectievere immunogenen voor vaccinstrategieën. Hier beschrijven we een celgebaseerde ELISA-test die het mogelijk maakt om de herkenning van trimere HIV-1 Env door monoklonale antilichamen te bestuderen. Na expressie van HIV-1 trimere Env aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, worden conformatiespecifieke anti-Env antilichamen geïncubeerd met de cellen. Een paardradischen peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam en een eenvoudige chemiluminescentiereactie worden vervolgens gebruikt om gebonden antilichamen te detecteren. Dit systeem is zeer flexibel en kan Env-conformationele veranderingen detecteren die worden geïnduceerd door oplosbaar CD4 of cellulaire eiwitten. Het vereist een minimale hoeveelheid materiaal en geen hooggespecialiseerd materiaal of knowhow. Dus kan deze techniek worden toegepast voor gemiddeld tot hoog doorvoerscreening van antigenen en antilichamen, zoals nieuw geïsoleerde antilichamen.

Met behulp van de hierboven beschreven algemene procedure, we passen het protocol om de impact van oplosbaar CD4 (sCD4) en coexpressed cellulaire CD4 op de blootstelling van CD4i epitopen assay aan beide (wt) wild-type of gemuteerd Env, zoals eerder beschreven 18,24, 25,28. Figuur 1 schematisch de algemene procedure en de blootstelling van CD4i epitopen na behandeling met sCD4 of door co-expressie van cellulaire CD4 18. In figuur 2 hebben we gebruikt sCD4 om Env vo...

Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om RIC HIV-een envelop glycoproteïnen of ENV-bevestiging te ondervragen met monoklonale antilichamen. Dit wordt bereikt door eerst adhesiecellen te transecteren om chimerische HIV-een E NV-eiwitten op het celoppervlak tot expressie te brengen. Als tweede stap worden de cellen geïncubeerd met anti ENV-monoklonale antilichamen, die ENV zullen binden, afhankelijk van de blootstelling van het epitoop.Vervolgens wordt een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam toegevoegd om de antilichaaminteractie te kwantificeren door middel van een chemiluminescentie-assay. Er worden resultaten verkregen die relatieve niveaus van VNV-gebonden antilichamen laten zien op basis van de relatieve lichteenheden die voor elk zijn verkregen. Nou, het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals feiten-gebaseerd binden, is dat deze techniek kan worden uitgevoerd met een lage hoeveelheid antilichamen en met een hoge doorvoer, een postdoc in het lab zal deze techniek uitvoeren.Menselijke osteosarcoma-cellen worden gebruikt in dit experiment één dag vóór de transfectieplaat, twee keer 10 tot de vierde cellen per putje. In een ondoorzichtige 96-putjes celkweekplaat geschikt voor luminescentie-meting. Gebruik delcos gemodificeerd arendsmedium gesupplementeerd met foetaal bovien serum en penicilline-streptomycine. Bewaar de cellen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide op de volgende dag.Bereid het transfectiemengsel. Leg eerst twee buisjes neer, twee bay en twee B naar twee bay. Voeg vijf microliters DMEM toe dat is gesupplementeerd met 25 millimolair hippies, gevolgd door 10 nanogram tat en coating plasmide, en 150 nanogram van chimerisch HIV-een envelop glycoproteïne coderend plasmide.Merk op dat het TAT-coderende plasmide alleen vereist is wanneer een tat-afhankelijk HIV-een envelop glycoproteïne coderend plasmide wordt gebruikt om twee B op vijf microliters DMM en 450 nanogram polyethyleen of PEI te maken. De hoeveelheden van de reagentia en DNA moeten worden aangepast aan het aantal putjes dat met hetzelfde HIV-een envelop glycoproteïne moet worden getransfecteerd. Voeg vervolgens de inhoud van twee B naar twee bay toe en meng grondig door 10 seconden te vortexen.Bewaar het transfectiemengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 10 minuten 10 microliters van het transfectiemengsel per putje van de 96-putjesplaat toe en bewaar 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofoxide. De Ali SA om de herkenning van chimerisch HIV-een envelop glycoproteïne door monoklonale antilichamen te bestuderen, wordt twee dagen na de transfectie van de menselijke osteosarcoma-cellen uitgevoerd.Bereid 250 milliliter wasbuffer per plaat voor die tegelijkertijd wordt gebruikt. Bereid 125 milliliter blokkeerbuffer per plaat door 1% vetvrij melkpoeder en vijf millimolair tris pH 8,0 toe te voegen aan de wasbuffer. Verwijder het celkweekmedium en transfectiemengsel van de 96-putjesplaat.Voeg 100 microliter blokkeerbuffer per putje toe en bewaar gedurende 20 minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en voeg 50 microliter antilichaam per putje toe, verdund tot de juiste concentratie in blokkeerbuffer. Bewaar gedurende één uur bij kamertemperatuur.Was drie keer met 100 microliter blokkeerbuffer en herhaal vervolgens het wasproces drie keer. Was drie keer met 100 microliter blokkeerbuffer en was vervolgens drie keer met 100 microliter wasbuffer na de laatste wasbeurt. Verwijder de sate.Voeg 100 microliter blokkeerbuffer toe en bewaar gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en voeg 50 microliter secundair antilichaam toe, verdund 1 tot 3000 in blokkeerbuffer. Bewaar gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur na 40 minuten.Was drie keer met 100 microliter blokkeerbuffer, gevolgd door drie wasbeurten met 100 microliter wasbuffer. Om de monsters voor data-acquisitie voor te bereiden, verwijder het supernatant van de 96-putjesplaat en voeg 30 microliter van een x verbeterde chemiluminescentie-substraat per putje toe. Verkrijg chemiluminescentie-signaal gedurende één seconde per putje op een geschikte platenlezer.Volgens de instructies van de fabrikant werd de invloed van oplosbaar CD vier of S CD vier op de blootstelling van CD vier I-epitopen op envelop glycoproteïnen of ENV geëvalueerd door interactie van CD vier met ENV induceert ENV-conformatieveranderingen die 17 B en 48 D-epitopen blootleggen die overlappen met de co-receptor bindingsplaats, maar heeft geen invloed op het buitenste domein dat antilichaam twee G 12 herkent. Om de impact van puntmutaties in de NV-bevestiging te beoordelen, werden twee ENV-mutanten gebruikt H 66 A, die een verminderde neiging heeft om spontaan de CD vier gebonden conformatie te bemonsteren, en S3 75 W, die de NV predisponeert voor de CD vier gebonden toestand. Normalisatie van de ruwe gegevens volgens expressieniveaus, onthult dat H 66 A de CD vier I 17 B-herkenning vermindert, terwijl S3 75 W het 17 B-signaal verbetert en voldoende is om het fenotype van de H 66 te herstellen.Een mutant testende cellen cot getransfecteerd met toenemende hoeveelheden van een CD vier expressor. Samen met de NV blauwe balken werden toenemende signalen voor CD vier I monoklonale antilichamen A drie, twee en C 11 onthuld, die discontinuële epitopen in het binnenste domein van het ENV-glycoproteïne herkenden. GP een 20 ENV-herkenning door het twee G 12-antilichaam werd niet beïnvloed.Ten slotte werden de ruwe gegevens genormaliseerd naar twee G 12, het ontbreken van een 32 en C 11-modulatie wanneer ENV werd cot getransfecteerd met een CD vier-mutant met verminderd vermogen om met ENV te interageren, geeft aan dat de toegenomen signalen afhankelijk zijn van E NV

conformational-evaluation-hiv-1-trimeric-envelope-glycoproteins-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De kroon van de verschillende regio V3 lus sequenties van het oppervlak enveloppe glycoproteïne (gp120) van HIV-1 kan structureel worden gekarakteriseerd in veel gevallen door in silico vouwing van de posities 10 tot 22 van de lus met behulp van een...

Beoordeling van immunologisch relevante Dynamic tertiaire structurele kenmerken van de HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence door Ab initio Folding

We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek...

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

We illustreren hier een in vitro membraanbindingstest waarin interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembraan visueel worden geanalyseerd met behulp van YFP-gelabelde Gag gesynthetiseerd in een tarwekiem-gebaseerd in vitro translatiesysteem en GUV's bereid door middel van een elektrovormingstechniek.

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP's). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP's wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP's worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke...

Detectie van neutralisatiegevoelige epitopen in antigenen die worden weergegeven op op virusachtige deeltjes (VLP) gebaseerde vaccins met behulp van een capture-assay

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde multiplex fluorescerende immunoassay die gebruikmaakt van een dual-reporter flowcytometrisch systeem om tegelijkertijd twee unieke spike-eiwitepitopen te detecteren op intacte virale deeltjes van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) die waren opgevangen door angiotensine-converterend enzym-2-gekoppelde magnetische microsferen.

Profilering van oppervlakte-eiwitepitopen op virale deeltjes door multiplex dual-reporter-strategie

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

Leer een cel-gebaseerde ELISA-test voor de conformatie-evaluatie van HIV-1 Env-trimeren met behulp van monoklonale antilichamen. Deze methode maakt hoogdoorvoeranalyse van antilichaambinding mogelijk met lage hoeveelheden antilichamen.

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

Meer video's verkennen