Name: Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer efficiënte gentransfer in embryonale kippenretina's via ex ovo elektroporatie. Deze methode verhoogt transflectie-efficiëntie vijfvoudig voor functionele studies in fotoreceptorbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen David O'Brien bedanken voor zijn ondersteuning bij de gegevensanalyse en alle leden van het Canto-Soler lab voor hun kritische besprekingen. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies EY004859 en EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765 en een onbeperkte afdelingssubsidie van Research to Prevent Blindness, Inc.

Alle procedures in dit werk beschreven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen zoals aanbevolen door de Animal Care en gebruik Comite aan de Johns Hopkins University. 1. Ahead of Time: Voorbereiding van instrumenten, reagentia en gerechten <ol><li> Bereiding van Eieren: Incubate Witte Leghorn bevruchte kippeneieren bij 37,5 ° C en 60% relatieve vochtigheid gedurende 5 dagen in een broedmachine. OPMERKING: Een incubator met rockende capaciteit kan nuttig zijn voor het standaardiseren en synchroniseren van de embryonale ontwikkeling, maar rockende is niet strikt noodzakelijk is voor de uitkomst van dit protocol. </li><li> Plasmide Bereiding: <ol><li> Ontwerp plasmide construct voor genoverexpressie of neerwaartse regulatie (bijvoorbeeld door middel van RNAi technologie 1,34) indien nodig. Neem een ​​reportergen (zoals EGFP, RFP of LacZ) in het construct waar mogelijk. OPMERKING: Sommige algemeen gebruikte promoters zoals CMV, kunnen raken na verloop van tijd het zwijgen opgelegd. De CAG PromotER (kip beta-actine-promotor met CMV-versterker) is een zeer goed alternatief, een efficiënte lange termijn expressie van het gen van belang 35-37. </li><li> Bereid een plasmide oplossing bij een concentratie van 1,5 ug / ul in steriele PBS. OPTIE: Bereid plasmide oplossing van tevoren en op te slaan bevroren totdat klaar voor gebruik. OPMERKING: Hogere plasmide concentraties niet leiden tot een aanzienlijk efficiënter, terwijl door minder plasmide concentraties lager de transfectie-efficiëntie 1. </li></ol></li><li> Elektroden: <ol><li> Voor de anode gebruik een dikke gouden tip elektrode (zie Tabel van specifieke materialen / Equipment). Veeg schoon met 70% ethanol. OPMERKING: Isolatie van de gouden tip elektrode, waardoor ongeveer 0,5 mm blootgesteld, is het raadzaam om lekkage van de elektrische stroom te minimaliseren. Informatie voor isolerend materiaal kan worden gevonden in tabel van specifieke materialen. </li><li> Maak een kathode uit een 2,5 mm vierkante bos gloeidraad, 4,5 mm breed (normaal in micropipet trekkers). Met behulp van een tang, verwijder de doos plein en recht filament in een lange strook. Vervolgens onder dissectie microscoop en met een liniaal als leidraad, buig het filament in een vierkante U-vorm 3 mm aan de basis en 2 mm aan één zijde met de andere zijde de resterende lengte van de draad (Figuur 1 , C - D). Met behulp van een tang, dompel de elektroden in 96% ethanol en vlam te steriliseren. Bevestig dan een elektrische leiding met een kleine alligator clip op de langere arm van de elektrode. </li></ol></li><li> Elektroporatie kamer Setup: <ol><li> Bereid de elektroporatie kamer door het snijden van de deksel van een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en aanbrenging, platte kant naar beneden, een 100 mm petrischaal met tape (figuur 1E). OPMERKING: Andere container in de vorm van een putje van dezelfde grootte zou werken; Maar een microcentrifugebuis deksel is gemakkelijk toegankelijk en autoclaveerbaar. De bronmoet groot genoeg zijn om een ​​kuiken oog en kathode-elektrode te huisvesten, maar niet zo groot zijn dat resulteert in een verspilling van plasmide oplossing. </li></ol></li></ol> 2. Ex ovo Elektroporatie Procedure <ol><li> Voorbereiding van instrumenten: <ol><li> Steriliseren micro-dissectie-instrumenten (2 paar grote gebogen Moloney tang voor het openen van eierschalen en scheppen uit embryo&#39;s, 2 paar fine-tip gebogen Dumont pincet voor het verwijderen van RPE, een paar van Bonn getande tang voor het verwijderen van de lens en het glasvocht) door dompelen de tips in 96% ethanol en vlammen. Schoon dissectie scope behulp doekjes gedompeld in 70% ethanol. Warm een ​​fles van steriele Calcium-Magnesium-vrije Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (CMF-HBSS) in een 37 ° C waterbad. Vul 100 mm steriele petrischaaltjes tot 3/4 vol met warme CMF-HBSS. </li><li> Plaats elektroporatie kamer onder andere schone dissectie microscoop en vullen met 120 ul van het plasmide oplossing. Sluit elektroden op elektroporatie apparaat, waardoorervoor maat elektrode is verbonden met de negatieve pool en gouden tip elektrode naar de positieve pool. </li></ol></li><li> Embryo Collection: <ol><li> Reinig de eieren door vegen schelpen met doekjes bevochtigd in 70% ethanol. Onderhouden steriele procedure in de rest van het protocol om te voorkomen dat het dragen van verontreiniging in de culturen. Met behulp van grote gebogen Moloney pincet een gat in de eischaal zorgvuldig te openen door zachtjes tikken op de afgeronde top van een ei (meer dan de luchtkamer) en dan grijpen en uit te trekken shell stukken. </li><li> Met een andere pincet verwijder membranen en het verzamelen van embryo scheppen door het uit het ei (zorg dat u de embryo beschadigen). Plaats het in een schotel met CMF-HBSS. OPMERKING: als nodig Verzamel zoveel embryo&#39;s om het gewenste aantal retinale cups voor elektroporatie verkrijgen zoals gespecificeerd in 2.4.4 </li><li> Kritische stap: Stadium de embryo&#39;s volgens de Hamburger en Hamilton 38. OPMERKING: Om een ​​optimale efficiëntie embryo&#39;s te verkrijgenmoet in fase 27 (Figuur 2A). </li><li> Euthanaseren de embryo&#39;s door onthoofding met Moloney tang. </li></ol></li><li> Het verkrijgen van het netvlies Cups: <ol><li> Met behulp van fijne Dumont pincet voorzichtig ophelderen van de ogen en over te dragen aan een nieuwe CMF-HBSS gerecht. </li><li> Vanaf het achterste gedeelte van elk oog, dicht bij de optische zenuw kop, en met twee fijne Dumont pincet, voeren één uiteinde van elke pincet tussen de neurale retina en RPE en zorgvuldig ontleden de RPE waarbij voorzichtig de neurale niet beschadigen retina (Figuur 2B). Opmerking: Het ontbreken van Ca2 + en Mg2 + in de oplossing helpt de RPE losmaken van de neurale retina gemakkelijker. </li></ol></li><li> Elektroporatie: <ol><li> Parameters instellen electroporator tot 5 vierkante pulsen leveren van 15 volt, 50 ms duur, en 950 msec interval. Place &#39;U&#39; vormige negatieve elektrode in elektroporatie kamer (microcentrifuge deksel filled met 120 pl plasmide bevattende oplossing). </li><li> Gebruik gebogen Dumont pincet overdragen netvlies beker aan de elektroporatie kamer (door scheppen, niet persen) en plaats deze in de U-vormige elektrode, het achterste deel van de retina naar de bodem van de elektrode en de lens naar boven ( Figuur 2D). </li><li> Plaats de anode, zodat deze tegen de voorste deel van het oog, naast de lens en met de elektroporator het voetpedaal leveren van de elektrische pulsen. </li><li> Overdracht geëlektroporeerd netvlies cup een nieuwe petrischaal met CMF-HBSS en herhaal elektroporatieprocedure met elk van de overblijvende retinale cups. OPMERKING: tot 6 retinale kopjes worden geëlektroporeerd met hetzelfde plasmide oplossing zonder een significante afname van transfectie efficiency. </li><li> Verwijder de lens en het glasachtig lichaam van elk geëlektroporeerd netvlies beker door aangrijpend ze met Bonn getande pincet en zachtjes te trekken door middel van tHij pupilopening terwijl het oog vast met de achterzijde van de gekromde Dumont pincet. </li><li> Overgaan tot de dissociatie en de cultuur van de geëlektroporeerd netvlies cellen volgens standaardprocedures. LET OP: Voor een gedetailleerd protocol over de dissociatie en cultuur van chick retinale cellen verwijzen naar Vergara en Canto-Soler 2012, Aanvullende bestandsinformatie 4 21 In dit protocol worden de cellen gezaaid met lage dichtheid op polyornithine gecoate 6-well platen of 35. -mm gerechten (6 x 10 5 cellen / 35 mm diameter en of schaal). Het gebruikte medium is medium 199 met penicilline / glutamine, 10% foetaal kalfsserum (FCS) en linolzuur-BSA bij 100 ug / ml. De kweken worden gehandhaafd in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO 2. Met behulp van deze procedure, 5 - kan 6 x 10 6 cellen meestal verkregen worden per elke fase 27 geëlektroporeerd oog. OPMERKING: Idealiter zou niet meer dan 3 uur voorbij tussen het embryo en mobiele plating, om een ​​goede overleving van de cel te garanderenen stress te minimaliseren. Een typische timing voor observatie en verdere analyse na 4 dagen in kweek, omdat op dat moment de cellen goede morfologische en moleculaire differentiatie bereikt hebben en overleving nog steeds hoog. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells%3A+a+novel%2C+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li>
<li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74(2007).</li>
<li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li>
<li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations%3A+characterization+and+partial+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li>
<li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li>
<li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+survival%3A+identification+of+RdCVF%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li>
<li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEDGF%3A+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li>
<li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li>
<li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li>
<li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li>
<li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li>
<li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures%3A+Effects+of+PNPF%2C+a+substratum-bound%2C+neurite-promoting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li>
<li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li>
<li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li>
<li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li>
<li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro%3A+analysis+with+the+%27window-labeling%27+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li>
<li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li>
<li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22(2012).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+types+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li>
<li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li>
<li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies%2C+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li>
<li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li>
<li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li>
<li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11(2001).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li>
<li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li>
<li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transfected+genes+by+differentiated%2C+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li>
<li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li>
<li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten hebben.

De meest kritische stap voor het succes van dit protocol is het selecteren van de juiste fase van het embryo. In eerdere publicaties is een aantal embryonale stadia die voor deze culturen doorgaans bepaald door de tijd van incubatie of embryonale dag (ED); dus is het meestal aangenomen dat het gebruik van ED 5 tot ED 6 embryo&#39;s zullen gelijkwaardige resultaten opleveren. We hebben echter gevonden dat het podium 27 (ED 5), wordt transfectie-efficiëntie ongeveer 22% van de totale celpopulatie, zoals hierboven vermeld;...

Gedissocieerde celkweken uit embryonale kuiken netvlies zijn op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten van fotoreceptorcellen celbiologie, inclusief hun overleving 2-9, differentiatie 10-12, neuriet uitgroei 13 en meer bestuderen. De voordelen van dit systeem, in de jaren 1980 ontwikkeld door Ruben Adler en medewerkers en geperfectioneerd door zijn andere groepen 14-20, bevinden zich in de intrinsieke kenmerken van het kuiken als diermodel 21. De grote omvang van het kuiken oog, zelfs in embryonale stadia, levert grote hoeveelheden materiaal te kweken. Bovendien, wanneer cultures worden uitgevoerd met embryonale dag (ED) 5 - 6 retina, 55 - 80% van de stamcellen differentiëren fotoreceptoren 14,15,18,22,23, en omdat ongeveer 86% van de fotoreceptoren in dit dier kegels 24, deze culturen zijn bijzonder geschikt voor studies gericht op dit celtype. We hebben onlangs developed en het kenmerk van een eenvoudige techniek die zorgt voor hoge-efficiëntie plasmide transfectie van de cellen in deze kweken, is de bruikbaarheid van dit systeem verbreden door het faciliteren genetische studies missexpression 1. De ontwikkeling van deze techniek kwam voort uit een leegte in de wetenschappelijke literatuur methoden die een aanvaardbaar niveau van transfectie zou bieden om voor de studie van gen in een cel autonoom. Dit is voor een deel omdat de primaire neuronale culturen zijn notoir moeilijk te transfecteren 25,26. Enkele van de meest gebruikte technieken die eerder voor dit doel opgenomen chemische transfectie werkwijzen zoals lipofectie of calcium-fosfaat-gemedieerde transfectie, die leiden tot efficiëntie in de orde van 3-5% en kan aanzienlijke toxiciteit 27-32 uitoefenen. Hoewel het gebruik van plasmiden met een enzymatische reporter systeem het probleem van slechte transfectie-efficiëntie kan omzeilen door het amplificeren van het signaal, ze nietdiscrimineren celspecifieke effecten en de resultaten zijn gebaseerd op een klein celpopulatie die niet representatief zijn voor het geheel kan zijn. Een andere veel gebruikte methode in de chick, RCAS virusinfectie, is alleen van toepassing op delende cellen en dus niet geschikt voor deze primaire retinale kweeksysteem 33. In het huidige protocol zijn embryonale kuiken ogen enucleatie in stadium 27 (ED 5), het retinale pigmentepitheel (RPE) is verwijderd en de retinale beker wordt geplaatst in een elektroporatie kamer gevuld met een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd met behulp maat elektroden, gevolgd door retinale dissociatie en cultuur met standaardtechnieken 21. Na optimalisatie procedure we in staat om consistent bereiken transfectie-efficiëntie in de orde van 22% van het totale aantal cellen in kweek en 25% binnen de fotoreceptor populatie alleen zijn geweest zonder de overleving en differentiatie kenmerken van de1 kweken. Hier geven we een gedetailleerd protocol waarin alle belangrijke stappen van de procedure teneinde het succes en de reproduceerbaarheid van deze techniek waarborgen.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Electro Square Porator</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0115 model 512</td><td>Goudgetinte elektrode gebruikt als anode</td></tr><tr><td>Polyimide Buizen</td><td>Vention Medical</td><td>op maat gemaakt</td><td>Interne diameter: 0,5 mm/wanddikte: 0,15 - 0,2 mm. Gebruikt voor het isoleren van goudgetinte elektrode</td></tr><tr><td>2,5 mm vierkante box gloeidraad, 4,5 mm breed</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>Gebruikt om kathode-elektrode te maken</td></tr><tr><td>HBSS, geen calcium, geen magnesium, geen fenol rood</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney-pincetten</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>Gekarteld; Licht gebogen; 4,5" Lengte</td></tr><tr><td>Dumont-pincetten 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Patroon #5, 45 graden hoek;.10 X.06mm Tip Grootte; 109mm Lengte</td></tr><tr><td>Bonn micro-pincetten, 1x2 tanden</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>Binding Platform; 1x2 Tanden, 0,12 mm Tanden; 3,75" Lengte; 0,3 mm Tipbreedte</td></tr></tbody></table>

efficiënte gene transfer in chick netvliezen voor primaire cel cultuurwetenschappen: an ex-ovo elektroporatie aanpak

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

De kegel fotoreceptor-verrijkte culturen afkomstig van embryonale kuiken netvlies hebben een onmisbaar instrument voor onderzoekers over de hele wereld het bestuderen van de biologie van retinale neuronen, in het bijzonder fotoreceptoren geworden. De toepassingen van dit systeem verder fundamenteel onderzoek, omdat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan high throughput technieken voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Echter, genetische manipulatie van retinale fotoreceptoren in deze culturen heeft bewezen zeer uitdagend, stellen een belangrijke beperking van de bruikbaarheid van het systeem. We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd ex ovo plasmide electroporatietechniek dat de snelheid van transfectie van retinale cellen in deze kweken stijgt met vijfvoudige vergelijking met andere momenteel beschikbare protocollen 1. Bij deze methode embryonale kuiken ogen enucleatie in stap 27, de RPE verwijderd en het netvlies beker wordt geplaatst in een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd gebruik gemakkelijk geconstrueerd custom-maakte elektroden. De netvliezen worden vervolgens gedissocieerd en gekweekt met behulp van standaardprocedures. Deze techniek kan worden toegepast op overexpressie studies en de neerwaartse regulatie van genexpressie, bijvoorbeeld via het gebruik van plasmide-aangedreven RNAi technologie, vaak bereiken transgenexpressie in 25% van de fotoreceptor bevolking. De video-indeling van de huidige publicatie zal deze technologie gemakkelijk toegankelijk zijn voor onderzoekers in het veld te maken, waardoor de studie van gen-functie in de primaire retinale culturen. We hebben ook uitgebreide uitleg van de kritische stappen van deze procedure voor een succesvol resultaat en reproduceerbaarheid.

Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het plasmide transfectie in ontkernde chick netvlies bekers voor latere gedissocieerde celkweek. Transfectie wordt bereikt door elektroporatie met behulp van eenvoudig om aangepaste elektroden (figuren 1-2) te maken. De in dit protocol beschreven parameters zijn geoptimaliseerd om de transfectie efficiëntie die variëren tussen 20 en 27% (met een gemiddelde van 22%) (Figuur 3D) te verkrijgen. Merk op dat, om de bovengenoemde redenen, deze r...

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Het algemene doel van deze procedure is om een hoge efficiëntie te bereiken, plasmide, transfectie van retinale cellen om functionele genetische studies in primaire retinale culturen mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst kippenembryo's te verzamelen in stadium 27 van het hamburger en Hamilton systeem. Passend stadiëren is cruciaal voor het bereiken van optimale efficiëntie.De tweede stap is om de embryonale ogen te dissecteren en het retinale gepigmenteerde epitheel te verwijderen om de neurale retina bloot te leggen. Vervolgens wordt de retinale cup in een kamer geplaatst gevuld met plasmide-oplossing. Het wordt vervolgens onderworpen aan elektroporatie onder geoptimaliseerde omstandigheden met behulp van eenvoudig geconstrueerde, op maat gemaakte elektroden.De laatste stappen zijn om het glasvocht en de lens te verwijderen en de neurale retina te dissociëren tot enkele cellen voor primaire cultuur met lage dichtheid. Uiteindelijk kunnen getransfecteerde cellen worden gevisualiseerd door de expressie van reportergenen of immunohistochemie, en kan de effectieve genetische manipulatie worden beoordeeld door de expressie van downstreamgenen en/of fenotypische celverandering

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC)...

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.

Single Cell Transfectie in kippenembryo&#39;s

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Werkwijze voor genoverdracht in kippenembryo's bij later stadium incubatie (ouder dan Hamburger Hamilton fase (HH) 22) beschreven. Deze methode overwint...

Gentransfer in Oudere kippenembryo&#39;s door<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporatie

Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

We beschrijven de methoden voor het labelen van fluorescerende tangentieel migreren cellen door electroporation, en voor time-lapse beeldvorming van de beweging van de gelabelde cel in een flat-mount cultuur om te visualiseren migreren cel gedrag in de ontwikkelingslanden chick optic tectum .

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Leer efficiënte gentransfer in embryonale kippenretina's via ex ovo elektroporatie. Deze methode verhoogt transflectie-efficiëntie vijfvoudig voor functionele studies in fotoreceptorbiologie.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

Meer video's verkennen