Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak
2 november 2015
Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.
Het algemene doel van deze procedure is om een hoge efficiëntie te bereiken, plasmide, transfectie van retinale cellen om functionele genetische studies in primaire retinale culturen mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst kippenembryo's te verzamelen in stadium 27 van het hamburger en Hamilton systeem. Passend stadiëren is cruciaal voor het bereiken van optimale efficiëntie.
De tweede stap is om de embryonale ogen te dissecteren en het retinale gepigmenteerde epitheel te verwijderen om de neurale retina bloot te leggen. Vervolgens wordt de retinale cup in een kamer geplaatst gevuld met plasmide-oplossing. Het wordt vervolgens onderworpen aan elektroporatie onder geoptimaliseerde omstandigheden met behulp van eenvoudig geconstrueerde, op maat gemaakte elektroden.
De laatste stappen zijn om het glasvocht en de lens te verwijderen en de neurale retina te dissociëren tot enkele cellen voor primaire cultuur met lage dichtheid. Uiteindelijk kunnen getransfecteerde cellen worden gevisualiseerd door de expressie van reportergenen of immunohistochemie, en kan de effectieve genetische manipulatie worden beoordeeld door de expressie van downstreamgenen en/of fenotypische celveranderingen te evalueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals lipofectine of chemische transfectie, is dat het de transfectiesnelheid van retinale cellen vervijfvoudigt en efficiënties van 22 tot 25% van de totale celpopulatie oplevert.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van fotoreceptorbiologie, omdat het de manipulatie van genexpressie in primaire retinale culturen mogelijk maakt op een niveau van efficiëntie dat biologisch zinvolle inzichten kan opleveren. De implicaties van deze techniek gaan verder dan fundamenteel onderzoek, aangezien ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan high-throughput technologieën voor medicijnontwikkeling. Begin met het incuberen van bevruchte witte leghorn kippen eieren gedurende vijf dagen op 37,5 graden Celsius en 60% relatieve luchtvochtigheid in een eier incubator.
Vóór het experiment verkrijgt u een box filament dat normaal wordt gebruikt bij micro pipet pullen. Gebruik een pincet om het vierkante doosje los te maken en de draad recht te trekken tot een lange strip. Vervolgens buigt u de draad met behulp van een liniaal als gids tot een vierkante u-vorm, drie millimeter lang aan de basis en twee millimeter hoog aan één kant met de andere kant, de resterende lengte van de draad. Gebruik een pincet om de elektrode in 96%ethanol te dopen en de elektrode kort te flammen om deze te steriliseren.
Bevestig vervolgens een elektrische kabel met een kleine alligatorclip aan de lange arm van de elektrode. Veeg vervolgens de dikke goudbeklede elektrode schoon met 70%ethanol. Bereid vervolgens de elektroporatiekamer voor door het deksel van een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis te snijden met gesteriliseerde schaar en deze plat met de plaatkant naar beneden op een 100 millimeter petrischaal te bevestigen met tape.
Steriliseer vervolgens de microdissectiehulpmiddelen door de instrumentpunten in 96%ethanol te dopen en ze kort te flammen. Veeg ook de dissectiescoop schoon met 70%ethanol. Verwarm een fles steriele calcium- en magnesiumvrije Hanks evenwichtszout oplossing in een waterbad van 37 graden Celsius.
Zodra het warm is, gebruikt u het om een 100 millimeter steriele petrischaal voor driekwart te vullen. Plaats vervolgens de elektroporatiekamer onder een schone dissectiemicroscoop. Verbind vervolgens de elektroden met het elektroporatieapparaat, zorg ervoor dat de op maat gemaakte elektrode is aangesloten op de negatieve pool en de goudbeklede elektrode is aangesloten op de positieve pool van de machine.
Reinig de eieren door de buitenkant van de schelpen af te vegen met 70%ethanol. Wees voorzichtig en handhaaf de steriliteit gedurende de rest van het protocol. Om contaminatie in de culturen te voorkomen, gebruikt u grote gebogen Maloney pincetten en opent u voorzichtig een gat in de eierschaal door voorzichtig op de afgeronde punt van een ei te tikken direct boven de luchtkamer.
Trek alle schelpstukken eruit met een ander paar pincetten. Verwijder de membranen en verzamel het embryo door het voorzichtig uit het ei te scheppen. Plaats het embryo in een petrischaal met de voorverwarmde calcium- en magnesiumvrije Hanks Balance zout oplossing.
Wanneer een geschikt aantal embryo's is verzameld, zorg ervoor dat ze allemaal in het juiste stadium zijn. Volgens het hamburger en Hamilton stadiëring systeem voor optimale efficiëntie, moeten embryo's zich in stadium 27 bevinden. Euthaniseer de embryo's door onthoofding met behulp van maloney pincetten, en gebruik vervolgens dumont pincetten om de ogen voorzichtig te nucleeren.
Breng de ogen over naar een nieuwe petrischaal met calcium- en magnesiumvrij HBSS. Begin bij het achterste deel van elk oog dicht bij de kop van de optische zenuw en introduceer vervolgens een punt van elk paar dumont pincetten tussen de neurale retina en het retinale gepigmenteerde epitheel. Werkend vanaf het achterste deel van het oog naar de voorkant, gebruik de pincetten om voorzichtig het retinale gepigmenteerde epitheel te dissecteren.
Wees voorzichtig om de neurale retina niet te beschadigen. Stel de elektro perter in om vijf vierkante pulsen van 15 volt af te geven met een duur van 50 milliseconden en een interval van 950 milliseconden. Vul vervolgens de elektroporatiekamer met 120 microliters plasmide-oplossing met een concentratie van 1,5 microgram per microliter in PBS.
Plaats vervolgens de U-vormige negatieve elektrode binnen de elektroporatiekamer van het microcentrifugedeksel. Gebruik een paar gebogen dumont pincetten. Breng een retinale cup over naar de elektroporatiekamer en plaats deze binnen de U-vormige elektrode.
Positioneer de retina zodat het achterste deel naar de onderkant van de elektrode is gericht en de lens naar boven wijst. Plaats vervolgens de anode zodat deze het voorste deel van het oog raakt naast de lens. Gebruik vervolgens de voetpedaal van de elektro raider om vijf elektrische pulsen af te geven.
Wanneer u klaar bent, brengt u de geëlektropereerde retinale cup over naar een nieuwe petrischaal gevuld met calcium- en magnesiumvrij HBSS. Herhaal de elektroporatie procedure met elke extra retinale
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe techniek voor hoog-efficiënte genoverdracht in embryonale netvliescelculturen van kuikens, waardoor de studie van de fotoreceptorbiologie wordt verbeterd. De methode omvat ex ovo plasmid-electroporatie, wat de transfectiepercentages aanzienlijk verbetert in vergelijking met bestaande protocollen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Embryonale kweek van netvliescellen van kuikens zijn belangrijk voor onderzoek naar fotoreceptoren.
- Genoverdrachtstechnieken zijn essentieel voor functionele studies in deze cellen.
- Huidige methoden hebben beperkingen wat betreft de transfectie-efficiëntie.
- Het optimaliseren van de stadiumbepaling en de electroporatiecondities kan de resultaten verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare genoverdrachtsmethode voor retinale cellen te ontwikkelen.
- Om functionele genetische studies in primaire retinale culturen mogelijk te maken.
- Om de transfectie-efficiëntie te verbeteren ten opzichte van bestaande protocollen.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van kiजembryo's in stadium 27 van het Hamburger- en Hamilton-systeem.
- Dissectie van de embryonale ogen en verwijdering van het retinaal gepigmenteerd epitheel.
- Plaatsen van de retinale cup in een kamer met plasmidenoplossing.
- Toepassen van elektroporatie met op maat gemaakte elektroden onder geoptimaliseerde condities.
Belangrijkste resultaten
- Hoge transfectie-efficiëntie bereikt via de nieuwe methode.
- Succesvolle genetische manipulatie van retinaalcellen aangetoond.
- Geoptimaliseerde condities voor elektroporatie zijn vastgesteld.
- De techniek is toepasbaar voor diverse functionele studies in de retinale biologie.
Conclusies
- De ontwikkelde gentransfertechniek verbetert de onderzoeksmogelijkheden binnen de biologie van retina-cellen aanzienlijk.
- Deze methode kan geavanceerde studies naar de functie van fotoreceptoren faciliteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van genetische factoren bij retina-aandoeningen omvatten.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor directie
Efficiënte gentransfer in primaire retinale culturen neemt een kritieke bottleneck in de validatie van fotoreceptor-doelen weg, waardoor functionele analyse van ziekterelevante genen mogelijk wordt. De ex ovo elektroporatiemethode behaalt een transfectie-efficiëntie van 22-25%, wat schaalbare assayontwikkeling ondersteunt voor high-throughput screening van retinale therapeutica. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door biologisch relevante inzichten te verschaffen in de genfunctie binnen een ziekterellevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via plasmide-gestuurde overexpressie of RNAi-gemedieerde knockdown in primaire fotoreceptorculturen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor functionele targetvalidatie met kwantificeerbare transgene expressie in maximaal 25% van de fotoreceptorpopulatie.
- Strategische waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets door genetische manipulatie te koppelen aan fenotypische celveranderingen of downstream genexpressie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert transfectie-efficiënties die geschikt zijn voor kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen in screeningscampagnes van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde elektroporatiecondities en op maat gemaakte elektroden om de reproduceerbaarheid van de assay over meerdere retina-cups te waarborgen.
- Strategische waarde: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor high-throughput aanpassing, aangezien getransfecteerde retinaculturen kunnen worden geïntegreerd in organotypische workflows of workflows voor primaire culturen met een lage dichtheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door genetische manipulatie mogelijk te maken in een ziekterellevant systeem dat de menselijke retinale biologie modelleert.
- Operationele waarde: Behoudt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door gebruik te maken van consistente kweek- en dissociatieprocedures.
- Strategische waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door de beoordeling van genfuncties voorafgaand aan in vivo-studies mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekkingen, van targetvalidatie tot leadidentificatie, en ondersteunt het testen van hypothesen en het verduidelijken van signaalpaden in de biologie van fotoreceptoren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door overexpressie of knockdown van doelgenen in primaire retinale culturen mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door een gestandaardiseerde plasmidoplossingsconcentratie (1.5 µg/µL) en geoptimaliseerde elektroporatieparameters (5 pulsen, 15V, 50ms).
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs via reportergenexpressie (bijv. GFP) of immunohistochemie om de transfectie-efficiëntie tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door toepasbaarheid in organotypische retinale culturen afgeleid van geëlektroporeerde retina's.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit, aangezien tot zes retinale cups kunnen worden geëlektroporeerd met dezelfde plasmidoplossing zonder significant verlies aan efficiëntie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door transfectiepercentages te bereiken die vijf keer hoger zijn dan bij lipofectie of chemische methoden.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie door gedetailleerde protocollen voor de constructie en sterilisatie van elektroden middels vlammen met 96% ethanol.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door biologische ruis in functionele studies te verminderen, waardoor betere go/no-go-beslissingen kunnen worden genomen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering door functionele gegevens te leveren over de rol van genen bij de overleving of differentiatie van fotoreceptoren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het stadiëren van kiemcellen van het kikelembryo (Hamburger and Hamilton stadium 27) en microsurgische dissectietechnieken.
- Maakt instrumentatie noodzakelijk voor de toediening van vijf vierkante electroporatie-pulsen en de bereiding van op maat gemaakte U-vormige elektroden van een gloeidraad.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van de plasmidoplossing (op basis van PBS, 1,5 µg/µL) en de inrichting van de kamer met gemodificeerde microcentrifugebuisjes.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij variërende plasmidconcentraties of RNAi-constructen bij opschaling naar downregulatiestudies.
- Omvat praktische beperkingen, zoals het tijdvenster van drie uur tussen de verzameling van embryo's en het uitplaten van cellen om de cultuurkwaliteit te behouden.
