Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in vasculaire permeabiliteit te meten, om gelokaliseerde allergische reacties te kwantificeren. Dit wordt bereikt door de dieren eerst te sensibiliseren voor een allergeen, zoals O-albumine. De tweede stap is om de oren uit te dagen met een intradermale injectie van het allergeen.

Vervolgens wordt Evans blauwe kleurstof in de staartader geïnjecteerd. De laatste stap is om de kleurstof uit de uitgedaagde oren te extraheren door ze een nacht te incuberen. In vorm, amide a wordt uiteindelijk spectrofotometrie gebruikt om de hoeveelheid kleurstof die het oor binnenkwam te kwantificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat kleurstofextravasatie wordt gemeten door spectrometrie. Dit betekent dat de test niet gemakkelijk onderhevig is aan observer bias. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat intradermale en staartvene injecties technisch uitdagend zijn en veel oefening vereisen om vakbekwaamheid te bereiken.

Begin met een aliquot van het eivoorrad op kamertemperatuur te brengen voor gebruik. Wanneer op kamertemperatuur, verdun het eivoorrad tot een concentratie van één milligram per milliliter in één XPBS. Gebruik een vijf milliliter polystyreen ronde bodembuis.

Vortex de buis op gemiddelde snelheid en voeg voorzichtig een gelijk volume van grondig gehomogeniseerd toe. Injecteer alum in de eivoplossing druppelsgewijs. Parallel hieraan bereidt u een negatieve controleoplossing van alum gemengd in PBS in een een-op-een verhouding met dezelfde techniek.

Vervolgens de buizen afsluiten en ze aan de vortex bevestigen. Laat de vortex een halve uur op de laagste stand draaien met de buizen eraan. Wanneer de oplossingen klaar zijn, gaat u onmiddellijk verder met het sensibiliseren van de BAB-muizen.

Laad het eivolum mix in een een milliliter spuit. Injecteer vervolgens met een 27 gauge naald 100 microliters in de buikholte van elke muis. Herhaal dit voor de negatieve controle muizen met de alum oplossing zonder eieren gedurende de volgende drie weken.

Herhaal dit proces voor een totaal van drie injecties per muis na de laatste injectie, wacht ten minste twee weken voordat u de lokale anafylaxie test uitvoert van bevroren eivoorrad. Begin met het maken van een werkoplossing van vijf milligram per milliliter in PBS. Vortex het kort, gebruik 5% ISO fluorine.

Anesthetiseer een gesensibiliseerde muis en wanneer deze onbeweeglijk wordt, verlaagt u de iso fluorine tot 3%Laad nu een drie 10 insulinespuit met 10 microliters van de eivoorbereiding en sluit deze af met een 31 gauge naald en laad een tweede spuit met 10 microliters van één XPBS. Wikkel vervolgens een 15 milliliter conische buis met transparant plakband plakzijde uit onder een dissectief microscoop, bevestig de dorsale kant van de linkeroor van een geanesthetiseerde muis aan de buis. Plaats de naald van de PBS-spuit met de bevelzijde omhoog tussen de twee bladjes van het oor en injecteer langzaam de volledige 10 microliters.

Vermijd het raken van bloedvaten. Een succesvolle injectie zal resulteren in een duidelijke intradermale blip. Het is van cruciaal belang om het hele volume in het oor te injecteren.

Als er vloeistof uit de injectieplaats lekt, kan het dier niet worden gebruikt in de analyse. Ook als de naald het oor volledig doorboort of de oppervlakte van het oor krast, is de test ongeldig omdat deze trauma de resultaten verwarren In het rechter oor. Gebruik dezelfde methode om het ei tijdens de drie minuten durende periode te injecteren.

Breng de muis over in een begrenzer en plaats hem onder een verwarmingslamp. Injecteer vervolgens langzaam 200 microliters van 0,5%Evans blauwe kleurstof in de staartader. Bij gebruik van een 27 gauge naald kan snelle injectie schadelijk zijn als het vat wordt vernietigd voordat alle kleurstof is geïnjecteerd.

Ga door met injecteren aan de andere kant van de staart. Wacht nu 10 minuten en euthaniseer vervolgens de muis met koolstofdioxide, gevolgd door cervicale dislocatie. Zodra het dier is geëuthaniseerd, gebruik pincetten en schaar om de oren te verwijderen.

Pak de oorrand met de pincetten zonder druk uit te oefenen op de injectieplaats. Snijd vervolgens dicht bij, maar niet door de kraakbeenrichel aan de basis van de oren. Verzamel zoveel mogelijk weefsel.

Neem nu goede voorzorgsmaatregelen en verdeel 700 microliters vormamide voor elk oor in een microcentrifugebuis. Breng een oor in elke buis over en incubeer ze een nacht bij 63 graden Celsius in een droge hitteblok, de volgende dag zal het meeste van de kleurstof worden geëxtraheerd, maar de oren kunnen er lichtblauw uitzien. Voeg 300 microliters van elk monster in duplicaat toe aan een 96-wellsplaat.

Vermijd het overbrengen van enig pels en vorm geen bubbels voor blanco's. Laad twee putjes met 300 microliters vormamide. Meet vervolgens de absorptie bij 620 nanometer.

Trek de waarden van de achtergrond af en analyseer de resultaten. PBS gesensibiliseerde dieren reageerden niet op de eivoorbereiding of PBS-uitdaging. Zoals verwacht, bleven beide oren wit.

Het jaar dat de PBS-uitdaging ontving bij OVA's gesensibiliseerde dieren was ofwel volledig wit of lichtblauw, gelokaliseerd op de plaats van injectie waar zijn oren die de eivoorbereiding ontvingen progressief donkerder werden gedurende 10 minuten na toediening van de kleurstof, de IDE-behandelde oorweefsel van de PBS gesensibiliseerde dieren had verwaarloosbare absorptiewaardingen na zowel de PBS- als OVA-uitdaging. Terwijl voor eivoorrad gesensibiliseerde dieren, PBS-injectie resulteerde over het algemeen in een gemiddelde absorptiewaarding van 0,13. Omgekeerd resulteerde een 50 microgram eivoorbereidingsuitdaging in een gemiddelde absorptiewaarding van 0,58.

De hoeveelheid eivoorrad die voor de uitdaging wordt gebruikt, kan binnen de grenzen worden