Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers
October 28th, 2014
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.
Het algemene doel van het volgende experiment is om integratievrije geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren uit een kleine hoeveelheid perifeer bloed. Dit wordt bereikt door geïsoleerde perifere bloedmononucleaire cellen te kweken in gedefinieerde groeifactoren om een erytrocyt-voorloperpopopulatie op te leveren die zeer responsief is voor herprogrammering. Als tweede stap worden niet-integrerende episomale plasmiden die herprogrammeringsgenen bevatten, via nucleofectie in de erythroblasten geïntroduceerd om het herprogrammeringsproces te initiëren.
Vervolgens worden de nucleofectie beïnvloede cellen geplaatst op een laag geïrradieerd muis embryonale fibroblasten om voortzetting van de herprogrammering mogelijk te maken. Herprogrammeerde geïnduceerde pluripotente stamcelkolonies kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun morfologische kenmerken, alkalische fosfatase-activiteit, positieve immunochemie voor pluripotentiemarkers en expressie van endogene pluripotentiegenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals op virussen gebaseerde herprogrammering, is dat dit protocol consistente generatie van integratievrije IPSC garandeert. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Jesse, mijzelf en Gretchen Johnson.
Een technicus in het lab Begin door perifeer bloed te verdunnen in een een-op-een verhouding in DPBS. Breng vervolgens in een ronde bodempolystyreen buis van 15 milliliter zorgvuldig zeven milliliter van het verdunde bloed aan op drie milliliter fi call hi pack op kamertemperatuur. Na het scheiden van het monster gedurende 30 minuten bij 400 GS en kamertemperatuur, zullen de PBMC zich in de troebele witte interfacelaag tussen het plasma en de fial high pack hebben gesetteld.
Gebruik een steriele overdrachtpipet om de P BMC's over te brengen naar een 15 milliliter conische buis en breng het volume op 10 milliliter met vers DPBS. Tel de cellen, breng vervolgens twee keer 10 tot zes P BMC's over naar een nieuwe 15 milliliter conische buis en centrifugeer de resterende cellen. Vries de gepelletiseerde cellen in bij een concentratie van twee keer 10 tot zes PBMC per milliliter in 90% foetaal bovien serum met 10% dimethylsulfoxide. Na het centrifugeren van de PBMC die opzij zijn gezet, suspenderen we het pellet in twee milliliter vers bereid expansiemedium en brengen ze in één put van een 12-puts weefselkweekplaat. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met een atmosfeer van 5% zuurstof, 5% koolstofdioxide en 90% stikstof.
Vervolgens, op dag drie en zes, vervang het medium door de cellen uit de put te verzamelen. Was de put met twee milliliter QBSF 60 om eventuele resterende cellen te verzamelen, centrifugeer de cellen en suspendeer vervolgens het pellet in twee milliliter vers expansiemedium. Breng vervolgens de cellen terug naar dezelfde 12-putsplaat en zet de incubatie voort. Op dag negen pipet de herprogrammeringsplasmiden in een steriele 1,5 milliliter einor buis zoals beschreven in de tabel.
Meng vervolgens de nucleofectie oplossing met de door de fabrikant geleverde supplementen en breng de mix over naar een steriele 1,5 milliliter upend DPH buis. Spuit vervolgens twee milliliter expansiemedium in één put van een nieuwe 12-putsplaat en breng het medium in evenwicht in de bevochtigde 37 graden Celsius incubator totdat de cellen klaar zijn. Verzamel de cellen, was de celkweekput zoals zojuist gedemonstreerd en was de cellen in vijf milliliter DPBS.
Suspendeer vervolgens het celpellet in 100 microliter Nucleofectie oplossing plus supplement, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en breng de celsuspensie over naar de buis met het herprogrammeringsplasmide. Meng de cellen door eenmaal op en neer te pipetten en breng de hele oplossing over naar de bodem van een nucleofectie vet. Plaats vervolgens de vet in de Nucleofectie machine en voer programma T 0 1 9 uit.
Voeg nu 100 microliter van het EQUILIBREERDE expansiemedium toe aan de nucleofectie vet, en verzamel onmiddellijk het hele monster, vermijd eventuele witte drijvende dode cellendeeltjes en dep het in de put van het voorverwarmde medium. Plaats de cellen vervolgens op dag 10 of 11 terug in de bevochtigde incubator. Bekleed elke put van een zes-puts weefselkweekplaat met gelatine met één milliliter 0,1% gelatine in HBSS en plaats vervolgens de plaat in de bevochtigde incubator of minimaal vijf minuten tijdens de incubatie. Breng één fles opgedopte, twee keer 10 tot zes 3000 graden Celsius geïrradieerd muis embryonale fibroblasten of mes over in 10 milliliter voorverwarmd meth-medium en centrifugeer de cellen terwijl de cellen naar beneden worden gezogen.
Zuig de gelatine oplossing uit de zes-putsplaat en suspendeer vervolgens de mes in 12 milliliter vers meth-medium. Spuit onmiddellijk twee milliliter OFM's in elke put van de gelatine beklede.Six. Welplaat en plaats de plaat terug in de bevochtigde incubator tot dag 12.
Op dag 12 verzamel de nucleofectie beïnvloede cellen uit de put in één 15 milliliter conische buis, was de put zoals gedemonstreerd om eventuele resterende cellen te verzamelen. Na het centrifugeren van de cellen, suspenderen we het pellet in 12 milliliter vers bereid herprogrammeringsmedium en brengen we twee milliliter cellen in elke put van feedercellen. In de zes-putsplaat centrifugeer de plaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 75 GS en kamertemperatuur, en plaats vervolgens de plaat terug in de bevochtigde incubator, waarbij het medium om de andere dag gedurende één tot twee weken wordt ververst.
Zodra de inductible pluripotente celkolonies verschijnen, begin met het voeren van de cellen met vers bereid humaan embryonaal stamcelmedium dat histon deacetylase-remmers bevat drie dagen na nucleofectie en voordat de nucleofectie beïnvloede cellen op de inductible meth worden geplaatst. De efficiëntie van een succesvolle NU nucleaire affetie moet worden geschat door middel van fluorescentiemicroscopie. Voor EGFP, bijvoorbeeld, hier getoond is een typisch nucleaire affetie experiment met ongeveer vijf tot 10% van de totale celpopulatie die EGFP expresseert. Herprogrammeerde inductible pluripotente stamcelkoloni
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van integratie-vrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) uit perifeer bloed. De methode maakt gebruik van een episome-gebaseerde herprogrammeringsstrategie in combinatie met histone deacetylase-remmers om de herprogrammeringsefficiëntie te verbeteren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderzoek
- Celherprogrammering
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn waardevol voor onderzoek en therapeutische toepassingen.
- Traditionele methoden voor het genereren van iPSC's omvatten vaak het integreren van vectoren, wat risico's van insertionele mutagenese met zich mee kan brengen.
- Dit protocol heeft tot doel een veiligere alternatief te bieden door niet-integrerende episomale plasmiden te gebruiken.
- Perifeer bloed is een toegankelijke bron voor iPSC-generatie.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het genereren van iPSC's uit perifeer bloed.
- Om het risico van genomische integratie geassocieerd met virale methoden te elimineren.
- Om de efficiëntie van herprogrammering te verbeteren met behulp van gedefinieerde groeifactoren en remmers.
Gebruikte methoden
- Isolatie van mononucleaire cellen uit perifeer bloed.
- Kweek van cellen in gedefinieerde groeifactoren om erytrocytvoorlopers te verkrijgen.
- Introductie van niet-integrerende episomale plasmiden via nucleofectie.
- Plateren van nucleofecteerde cellen op bestraalde muizen embryonale fibroblasten voor herprogrammering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van iPSC-kolonies geïdentificeerd door morfologische kenmerken.
- Positieve alkalische fosfatase-activiteit in herprogrammeerde cellen.
- Expressie van pluripotentiemarkers bevestigd door immunochemie.
- Endogene pluripotentiegenen werden tot expressie gebracht in de herprogrammeerde cellen.
Conclusies
- Dit protocol biedt een consistente methode voor het genereren van integratie-vrije iPSC's.
- Het gebruik van perifeer bloed als uitgangsmateriaal is voordelig voor klinische toepassingen.
- De benadering minimaliseert risico's geassocieerd met virale herprogrammeringstechnieken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables integration-free iPSC generation from minimally invasive peripheral blood samples, addressing a key bottleneck in autologous cell therapy development. By combining episomal reprogramming with HDAC inhibitor-mediated epigenetic enhancement, the method improves reprogramming efficiency and reduces genomic safety concerns. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines by providing a scalable, non-viral source of pluripotent cells for disease modeling and screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using genetically unaltered human iPSCs derived from patient blood.
- Operational Value: Supports biological de-risking through integration-free reprogramming, minimizing confounding genetic alterations in target validation studies.
- Predictive Value: Enhances confidence in phenotypic screening outcomes by providing epigenetically reset cells with stable pluripotency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, transgene-free iPSC lines suitable for reproducible assay development and compound screening.
- Operational Value: Enables scalable expansion of patient-derived cells for high-throughput screening platforms after initial nucleofection and selection.
- Assay Readiness: Generates cells with defined morphology and pluripotency marker expression, facilitating consistent downstream differentiation and functional readouts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by providing patient-matched iPSCs that retain donor genetic background without vector integration.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of target engagement and pathway modulation in disease-relevant human cellular systems prior to in vivo studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through reliable modeling of drug effects in epigenetically normalized human cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling progression from patient sample acquisition to lead identification through the generation of integration-free iPSCs for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using patient-derived iPSCs that avoid insertional mutagenesis artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready cells with consistent pluripotency and differentiation capacity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of reprogramming efficiency via alkaline phosphatase activity, pluripotency marker expression, and colony morphology.
- Translational Research: Facilitates continuity to preclinical work by providing genetically stable human cells for target validation and safety profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, non-viral reprogramming workflow applicable across multiple donor samples and disease indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through integration-free, epigenetically enhanced iPSC generation reducing mechanistic ambiguity in disease modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined nucleofection parameters, feeder-independent expansion, and HDAC inhibitor timing.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk associated with genomic instability in virally reprogrammed cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates using validated, patient-derived cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection techniques, and episomal vector handling.
- Depends on access to nucleofection equipment, irradiated feeder cells, and GMP-compatible HDAC inhibitors for translational use.
- Necessitates standardization across teams for consistent reprogramming efficiency and quality control of iPSC lines.
- Involves adaptation considerations when extending to alternative blood-derived progenitors or disease-specific cell states.
- Practical limitations include variability in PBMC yield from donor samples and the extended timeline required for colony selection and expansion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Ficoll Separation of PBMCs and Expansion of Erythroblasts Days 0-6
3:17
Reprogramming Cells by Nulceofection Day 9
4:51
Plating Feeder Cells Day 10-11
5:47
Plating Cells on Feeder Cells and Changing Medium Day 12
6:41
Results: Representative Nucleofected and Inducible Pluripotent Stem (iPS) Cells
7:46
Conclusion
