Name: Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het genereren van integratievrije iPSC's uit perifeer bloed met behulp van episomale plasmiden en HDAC-remmers. Deze techniek minimaliseert het risico op insertiemutagenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de volgende subsidies van de NIH erkennen voor de ondersteuning van dit onderzoek: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), en K12HL0806406 (SKS); en de JP McCarthy Foundation (AR).

Informed consent, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Fred Hutchinson Cancer Research Center en het Children &quot;s Hospital van Philadelphia, werd verkregen van patiënten voor het verzamelen van perifere bloedmonsters. Alle institutionele richtlijnen werden waargenomen. Alle dierlijke experimenten, inclusief MEF generatie en teratoma vorming werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Ficoll Scheiding van PBMC&#39;s en uitbreiding van erytroblasten - Dag 0 <ol><li> Verdun perifeer bloed 1: 1 met Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). In een 15 ml ronde bodem polystyreen buis, zorgvuldig laag 7 ml verdunde bloed op 3 ml kamertemperatuur Ficoll- Hypaque-. </li><li> Centrifugeer het monster bij 400 xg gedurende 30 min. </li><li> De PBMCs zal geregeld tot de interface tussen het plasma en de Ficoll-Hypaque, beschouwd als een troebele witte laag. Met behulp van een steriele transferpipet, het verzamelen van de PBMCs in een 15 ml conische buis. Breng het volume op 10 ml met behulp van DPBS. </li><li> Met behulp van een hemacytometer, tel de PBMCs. </li><li> Pipetteer 2 x 10 6 PBMC in een afzonderlijke 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Spin de resterende cellen en bevriezen bij een concentratie van 2 x 10 6 PBMC / ml in 90% foetaal runderserum (FBS) / 10% dimethylsulfoxide (DMSO). </li><li> Bereid Uitbreiding Medium: QBSF-60 serumvrij medium (beschermd tegen licht) + penicilline / streptomycine (1%) + ascorbinezuur (50 ng / ml) + stamcelfactor (SCF, 50 ng / ml) + interleukine 3 (IL 3, 10 ng / ml) + erytropoëtine (EPO, 2 U / ml) + insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexamethasone (1 uM; bescherming tegen licht, ontdooien eenzelfde hoeveelheid elke media veranderen). </li><li> Resuspendeer 2 x 10 6 PBMCs in 2 ml vers medium Expansie en plaats in een putje van een 12 well weefselkweek plaat en incuberen in een 37 ° C bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% O2, 5% CO2 en 90% N2. </li><li> Op dag 3 en dag 6, vervang media. <ol><li> Verzamel de cellen en was het goed met 2 ml QBSF-60 om eventuele resterende cellen te verzamelen. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen in 2 ml van nieuwe Expansion Medium en hen terug te keren naar dezelfde 12 wells plaat. </li></ol></li></ol> 2. herprogrammeren cellen door Nucleofection - Dag 9 <ol><li> Pipetteer de herprogrammering plasmiden in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis (Tabel 1). </li><li> Meng de nucleofectie oplossing met Supplement (door de fabrikant meegeleverd) en pipet in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Pipetteer 2 ml Uitbreiding Medium in een putje van een 12 putjesplaat en in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) evenwichtstoestand voorafgaand aan het toevoegen cellen. </li><li> Verzamel degekweekte cellen en was het goed met 2 ml QBSF-60 resterende cellen te verzamelen. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant. </li><li> Was de cellen door resuspenderen in 5 ml DPBS en centrifugeren bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 100 ul nucleofectie oplossing + Supplement, en zorg ervoor dat het genereren van luchtbellen te vermijden. </li><li> Pipetteer de celsuspensie in de buis met het herprogrammeren plasmiden, pipet op en neer eenmaal, pipet en het monster in de bodem van de nucleofection cuvette. </li><li> Plaats de cuvette in de nucleofectie machine en run Programma T-019. </li><li> Breng 100 pi van het voorverwarmde Expansion Medium (equilibreren van de plaat in stap 2.3) in de nucleofection cuvette. </li><li> Onmiddellijk verzamel de volledige steekproef en storting in de put van de voorverwarmde Expansion Medium. Vermijd het verzamelen van de witte, drijvende dode cel puin. </li&gt; <li> Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) voor groei. </li></ol> 3. Plating Feeder Cellen - Dag 10 of 11 <ol><li> Op dag 10, plaat feeder cellen. <ol><li> Coat een 6 well weefselkweek plaat met gelatine. <ol><li> Pipetteer 1 m van 0,1% gelatine in Hank&#39;s gebufferde zoutoplossing (HBSS) in elk putje van de plaat. </li><li> Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator gedurende ten minste 5 min. </li><li> Vlak voor het gebruik, zuig het gelatine-oplossing van de plaat. </li></ol></li><li> Ontdooien één flacon 2 x 10 6 muis embryonale fibroblasten bestraald 3000 cGy in 10 ml voorverwarmde MEF Media (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicilline / streptomycine (1%)). </li><li> Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen in 12 ml van MEF Media en pipet 2 ml into elk putje van de gelatine beklede plaat met 6 putjes. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) tot dag 12. </li></ol></li></ol> 4. Plating Cellen op Voeder Cellen en wijzigen Medium - Dag 12 <ol><li> Verzamel de nucleofected cellen in een 15 ml conische buis en laat de resterende cellen door het behandelde goed met 2 ml QBSF-60. Centrifugeer het monster bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Bereid herprogrammeren Medium: Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s medium (IMDM) + FBS (10%) + niet-dierlijke L-glutamine (1 mM) + niet-essentiële aminozuren (NEAA, 1%) + penicilline / streptomycine (1%) + β mercaptoethanol (0,1 mM) + basische fibroblast groeifactor (bFGF toegevoegd aan verse voeding, 10 ng / ml) + ascorbinezuur (vers toegevoegd invoersysteem, 50 ug / ml). </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 12 ml Medium herprogrammeren. Pipetteer 2 ml per putje van de celsuspensie inde 6 wells plaat van feeder-cellen (zoals bereid in hoofdstuk 3). Centrifugeer de plaat bij 50 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) voor groei. Verander het herprogrammeren Medium om de andere dag, totdat iPSC kolonies beginnen te zien zijn (1-2 weken). </li><li> Bereid hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum vervangen (20%) + penicilline / streptomycine (1%) + NEAA (1%) + niet-dierlijke L-glutamine (1 mM) + natriumpyruvaat (1%) + natriumbicarbonaat (0,12%) + β-mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (vers toegevoegd invoersysteem, 10 ng / ml) </li><li> Bereid HDAC-remmers: natriumbutyraat (verse toegevoegd bij het voeden, 100 uM), suberanilohydroxamic zuur (SAHA, toegevoegd fris bij het voeden, 200 nm). Zodra iPSC kolonies verschijnen beginnen voeden van de cellen met hESC Medium + HDAC remmers veranderen medium elke dag. OPMERKING: Natrium butyraat is een klein molecuul dat is geadsorbeerd aan kunststof buizen, therefore opslaan in een borosilicaat glazen buis bij 4 ° C. </li></ol> 5. Isoleren iPSC Clones <ol><li> Zodra iPSC kolonies groot genoeg te isoleren (20-25 cellen), pak ze met een P20 pipet. </li><li> Bereid HDAC-remmers: natriumbutyraat (verse bij voeding toegevoegd, 100 uM), SAHA (toegevoegd fris bij het voeden, 200 nm) </li><li> Plaats de geïsoleerde kolonies op iMEFs in individuele 35 mm schalen met hESC Medium + HDAC-remmers + Klonen &amp; Recovery Supplement. </li><li> De dag na het plukken van de kolonies, verander de middellange tot hESC Medium + HDAC-remmers. </li><li> Verander het medium elke dag tot iPSC kolonies zijn klaar voor passage. </li><li> Verwijder HDAC-remmers uit het medium eenmaal kolonies stabiliseren op passage 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Voor succesvolle iPSC genereren bij gebruik van dit protocol, zijn er verschillende belangrijke uitgangspunten dat moet worden overwogen. Tijdens de erythroblast uitbreidingsfase, moeten de media verandering schema strikt worden gevolgd, als afwijkingen kunnen leiden tot inefficiënte stimulatie van de doelgroep voorlopercellen cel populatie en een lagere efficiëntie van iPSC generatie. Het is belangrijk om nieuwe uitbreiding medium met verse dexamethason met elke media verandering te maken; en de QBSF-60 base medium en ...

iPSCs zijn afgeleid van somatische weefsels via ectopische expressie van een minimale set van pluripotency genen. Deze techniek werd aanvankelijk aangetoond door retrovirale transductie van humane fibroblasten met OCT4, SOX2, KLF4 en cMYC die hoog tot expressie in de pluripotente toestand 1. Deze tijdelijk tot expressie &quot;herprogrammering factoren&quot; veranderen de doel cel epigenetische landschap en genexpressie profiel analoog aan menselijke embryonale stamcellen 2. Eens gemaakt, kan iPSCs potentieel worden onderscheiden in elk type weefsel voor verder onderzoek. Zo is zij in het bezit belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde, ziekte modelleren, en gentherapie toepassingen. Echter, verstoren het genoom met integrerende virussen heeft de potentie om endogene genexpressie beïnvloeden cellulaire fenotype te veranderen, en uiteindelijk vertekenen wetenschappelijke resultaten. Bovendien kunnen willekeurige virale integraties leiden tot schadelijke cellulaire effects, met inbegrip van de mogelijkheid van een maligne transformatie 3 of re-expressie van de oncogene transgenen 4. Toekomstige klinische toepassingen zullen niet-integrerende iPSC generatie vereisen. Episomen, die extra chromosomaal circulaire DNA moleculen zijn, bieden een strategie om kosteneffectieve, integratie gratis iPSCs 5 genereren. De combinatie van episomale vectoren in tabel 1 geven de herprogrammering factoren OCT4, SOX2, KLF4, MYCL en LIN28A. De pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F plasmide bevat ook een p53 shRNA tijdelijke onderdrukking van TP53 cellulaire herprogrammering 6 verbeteren. De replicatie deficiënte pCXWB-EBNA1 vector bevordert amplificatie van herprogrammering factoren en verhoogde efficiëntie herprogrammering door een tijdelijke toename EBNA1 expressie 7. De pCXLE_EGFP plasmide kan de nucleofectie mengsel worden toegevoegd met het doel van determining de transfectie-efficiëntie of voor celsortering toepassingen. Met uitzondering van p-CXWB EBNA1, het episomale plasmiden die in dit protocol bevat het Epstein-Barr virus oorsprong van virale replicatie en EBNA1 gen dat replicatie en verdeling van de episoom bemiddelen bij deling van de gastheercel 8. De episomen spontaan verloren opeenvolgende iPSC expansie 7. Subklonering en karakterisatie van iPSCs met episomale vector verlies, dat kan worden afgeleid uit het verlies van eGFP expressie kan leiden tot integratie volledig vrij iPSCs voor toekomstige klinische toepassingen. Inherent aan het proces van iPSC generatie onderdrukking van lijnspecifieke genen en reactivering van pluripotentie-geassocieerde genen. Regulatie van genexpressie plaatsvindt op verschillende niveaus binnen de kern, waaronder wijzigingen van DNA en chromatine transcriptiefactoren mogelijk, regulerende DNA-elementen, en RNA polymerase toegang targetengenen. Herinrichting van de epigenetische landschap via wereldwijde chromatine modificaties is een belangrijk onderdeel om opnieuw uitdrukking van de pluripotency genetisch programma. Een specifieke chromatine modificatie dat belangrijk is bij de regulatie van genexpressie acetylering van histonen op bepaalde lysineresten, dat toegang tot genen richten door verminderde spanning van de histon-DNA coil. HDAC remmers zijn kleine moleculen die zijn aangetoond iPSC herprogrammering en hESC zelfvernieuwing 9,10 verbeteren, waarschijnlijk door het ondersteunen van de geacetyleerde toestand 11. De hieronder beschreven protocol, aangepast van een voorafgaande publicatie met integratie lentivirussen 12, wordt stap voor stap methode voor optimale iPSC generatie uit perifeer volbloed met behulp episomen en HDAC inhibitoren. De HDAC inhibitor concentraties die hier gebruikt zijn de helft van die beschreven door Ware et al. 9 en routinematig tot een 2-voudige toename in volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies op standaardepisomale herprogrammering protocollen zonder HDAC inhibitoren. Dit niveau van herprogrammering is op gelijke voet met de efficiëntie die we waarnemen met lentivirale methoden. Met dit protocol, hebben we snel gemaakt iPSC van individuen zo oud als 87 jaar.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Bewaar bij 4 °C. Verwarm tot kamertemperatuur voor gebruik.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Bewaar bij -20 °C tot het nodig is. Ontdooi, verdeel in aliquoten, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>QBSF-60 serum-vrij medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>2% gelatine-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Bewaar bij 4 °C, smelt in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C.</td></tr><tr><td>niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Bewaar bij 4 °C, uit de buurt van licht.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C.</td></tr><tr><td>natriumpyruvaat, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>natriumbicarbonaat, 7,5%</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>basische fibroblasten groeifactor (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Maak 10 mg/ml stock in DPBS, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>natriumbutyraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Maak 2000x stock (400 mM) in DPBS, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>hES Cell Cloning & Recovery Supplement</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Bewaar bij -20 °C tot het nodig is. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>ESC-gekwalificeerde BD matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Ontdooi een nacht op ijs bij 4 °C, verdeel in aliquoten in voorgekoelde buisjes met behulp van voorgekoelde pipetten. Bewaar bij -20 °C tot het nodig is. Ontdooi bij 4 °C, gebruik onmiddellijk.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C.</td></tr><tr><td>ascorbinezuur, poeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Maak 5 mg/ml stock in DPBS, sterieel filter, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>recombinant humaan stamcelfactor (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Maak 100 µg/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>recombinant humaan interleukine 3 (IL-3)</td><td>R & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Maak 100 µg/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>erytropoëtine (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Maak 1000 U/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>recombinant humaan insuline-achtig groeifactor 1 (IGF-1)</td><td>R & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Maak 100 µg/ml stock in SFEM, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>β-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Maak 1000x stock (100 mM) in DPBS.</td></tr><tr><td>dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Maak 50x stock (50 µM) in DPBS, sterieel filter, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Maak 2000x stock (400 mM) in DPBS, verdeel in aliquoten, bevries bij -20 °C. Eenmaal ontdooid, bewaar bij 4 °C.</td></tr><tr><td>12 wels tissuecultuurplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buis</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorfbuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 wels tissuecultuurplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm tissucultuurplaten</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml wegwerp serologische pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml wegwerp serologische pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml wegwerp serologische pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 µl pipettentips, b

efficiënte ips cell generation van blood behulp episomen en hdac-remmers

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Dit handschrift illustreert een protocol voor het efficiënt maken van-integratie vrij humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit perifeer bloed met behulp van episomale plasmiden en histondeacetylase (HDAC) -remmers. De voordelen van deze benadering zijn: (1) het gebruik van een minimale hoeveelheid perifeer bloed als grondstof; (2) nonintegrating herprogrammering vectoren; (3) een kosteneffectieve werkwijze voor het genereren vector gratis iPSCs; (4) een enkele transfectie; en (5) het gebruik van kleine moleculen epigenetische herprogrammering vergemakkelijken. Kort, perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) geïsoleerd uit routine flebotomie monsters en vervolgens gekweekt in gedefinieerde groeifactoren een zeer proliferatieve erythrocyten progenitor celpopulatie die opmerkelijk vatbaar herprogrammering leveren. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmiden die OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, en een p53 short hairpin (sh) RNA zijn Inleidiced in de afgeleide erytroblasten via één nucleofection. Cotransfectie van een episoom dat tot expressie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) zorgt voor gemakkelijke identificatie van getransfecteerde cellen. Een aparte replicatie-deficiënte plasmide dat Epstein-Barr nucleair antigeen 1 (EBNA1) wordt ook toegevoegd aan het reactiemengsel verhoogde expressie van episomale eiwitten. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op een laag van bestraalde muis embryonale fibroblasten (iMEFs) voor verdere herprogrammering. Zodra iPSC-achtige kolonies verschijnen ongeveer twaalf dagen na nucleofection zijn HDAC inhibitoren toegevoegd aan het medium epigenetische remodeling vergemakkelijken. We hebben gevonden dat de opname van HDAC inhibitoren routinematig verhoogt de productie van volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies van 2 maal. Zodra iPSC kolonies vertonen typisch menselijke embryonale stamcellen (hESC) morfologie, worden ze voorzichtig overgebracht naar individuele Imef-gecoate weefselkweek platen voor verdere groei en expansie.

Drie dagen na nucleofection en voor electroplating de nucleofected cellen op iMEFs, de efficiency van de succesvolle nucleofection worden geschat door fluorescentie microscopie eGFP. Figuur 1 toont een typische nucleofection experiment met ongeveer 5-10% van de totale celpopulatie EGFP. Geherprogrammeerd iPSC kolonies zal beginnen om ongeveer twee weken verschijnen nadat nucleofectie. De kolonies zijn meestal rond met goed gedefinieerde grenzen en kunnen worden geïdentificee...

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om integratievrije geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren uit een kleine hoeveelheid perifeer bloed. Dit wordt bereikt door geïsoleerde perifere bloedmononucleaire cellen te kweken in gedefinieerde groeifactoren om een erytrocyt-voorloperpopopulatie op te leveren die zeer responsief is voor herprogrammering. Als tweede stap worden niet-integrerende episomale plasmiden die herprogrammeringsgenen bevatten, via nucleofectie in de erythroblasten geïntroduceerd om het herprogrammeringsproces te initiëren.Vervolgens worden de nucleofectie beïnvloede cellen geplaatst op een laag geïrradieerd muis embryonale fibroblasten om voortzetting van de herprogrammering mogelijk te maken. Herprogrammeerde geïnduceerde pluripotente stamcelkolonies kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun morfologische kenmerken, alkalische fosfatase-activiteit, positieve immunochemie voor pluripotentiemarkers en expressie van endogene pluripotentiegenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals op virussen gebaseerde herprogrammering, is dat dit protocol consistente generatie van integratievrije IPSC garandeert. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Jesse, mijzelf en Gretchen Johnson.Een technicus in het lab Begin door perifeer bloed te verdunnen in een een-op-een verhouding in DPBS. Breng vervolgens in een ronde bodempolystyreen buis van 15 milliliter zorgvuldig zeven milliliter van het verdunde bloed aan op drie milliliter fi call hi pack op kamertemperatuur. Na het scheiden van het monster gedurende 30 minuten bij 400 GS en kamertemperatuur, zullen de PBMC zich in de troebele witte interfacelaag tussen het plasma en de fial high pack hebben gesetteld.Gebruik een steriele overdrachtpipet om de P BMC's over te brengen naar een 15 milliliter conische buis en breng het volume op 10 milliliter met vers DPBS. Tel de cellen, breng vervolgens twee keer 10 tot zes P BMC's over naar een nieuwe 15 milliliter conische buis en centrifugeer de resterende cellen. Vries de gepelletiseerde cellen in bij een concentratie van twee keer 10 tot zes PBMC per milliliter in 90% foetaal bovien serum met 10% dimethylsulfoxide. Na het centrifugeren van de PBMC die opzij zijn gezet, suspenderen we het pellet in twee milliliter vers bereid expansiemedium en brengen ze in één put van een 12-puts weefselkweekplaat. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met een atmosfeer van 5% zuurstof, 5% koolstofdioxide en 90% stikstof.Vervolgens, op dag drie en zes, vervang het medium door de cellen uit de put te verzamelen. Was de put met twee milliliter QBSF 60 om eventuele resterende cellen te verzamelen, centrifugeer de cellen en suspendeer vervolgens het pellet in twee milliliter vers expansiemedium. Breng vervolgens de cellen terug naar dezelfde 12-putsplaat en zet de incubatie voort. Op dag negen pipet de herprogrammeringsplasmiden in een steriele 1,5 milliliter einor buis zoals beschreven in de tabel.Meng vervolgens de nucleofectie oplossing met de door de fabrikant geleverde supplementen en breng de mix over naar een steriele 1,5 milliliter upend DPH buis. Spuit vervolgens twee milliliter expansiemedium in één put van een nieuwe 12-putsplaat en breng het medium in evenwicht in de bevochtigde 37 graden Celsius incubator totdat de cellen klaar zijn. Verzamel de cellen, was de celkweekput zoals zojuist gedemonstreerd en was de cellen in vijf milliliter DPBS.Suspendeer vervolgens het celpellet in 100 microliter Nucleofectie oplossing plus supplement, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en breng de celsuspensie over naar de buis met het herprogrammeringsplasmide. Meng de cellen door eenmaal op en neer te pipetten en breng de hele oplossing over naar de bodem van een nucleofectie vet. Plaats vervolgens de vet in de Nucleofectie machine en voer programma T 0 1 9 uit.Voeg nu 100 microliter van het EQUILIBREERDE expansiemedium toe aan de nucleofectie vet, en verzamel onmiddellijk het hele monster, vermijd eventuele witte drijvende dode cellendeeltjes en dep het in de put van het voorverwarmde medium. Plaats de cellen vervolgens op dag 10 of 11 terug in de bevochtigde incubator. Bekleed elke put van een zes-puts weefselkweekplaat met gelatine met één milliliter 0,1% gelatine in HBSS en plaats vervolgens de plaat in de bevochtigde incubator of minimaal vijf minuten tijdens de incubatie. Breng één fles opgedopte, twee keer 10 tot zes 3000 graden Celsius geïrradieerd muis embryonale fibroblasten of mes over in 10 milliliter voorverwarmd meth-medium en centrifugeer de cellen terwijl de cellen naar beneden worden gezogen.Zuig de gelatine oplossing uit de zes-putsplaat en suspendeer vervolgens de mes in 12 milliliter vers meth-medium. Spuit onmiddellijk twee milliliter OFM's in elke put van de gelatine beklede.Six. Welplaat en plaats de plaat terug in de bevochtigde incubator tot dag 12.Op dag 12 verzamel de nucleofectie beïnvloede cellen uit de put in één 15 milliliter conische buis, was de put zoals gedemonstreerd om eventuele resterende cellen te verzamelen. Na het centrifugeren van de cellen, suspenderen we het pellet in 12 milliliter vers bereid herprogrammeringsmedium en brengen we twee milliliter cellen in elke put van feedercellen. In de zes-putsplaat centrifugeer de plaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 75 GS en kamertemperatuur, en plaats vervolgens de plaat terug in de bevochtigde incubator, waarbij het medium om de andere dag gedurende één tot twee weken wordt ververst.Zodra de inductible pluripotente celkolonies verschijnen, begin met het voeren van de cellen met vers bereid humaan embryonaal stamcelmedium dat histon deacetylase-remmers bevat drie dagen na nucleofectie en voordat de nucleofectie beïnvloede cellen op de inductible meth worden geplaatst. De efficiëntie van een succesvolle NU nucleaire affetie moet worden geschat door middel van fluorescentiemicroscopie. Voor EGFP, bijvoorbeeld, hier getoond is een typisch nucleaire affetie experiment met ongeveer vijf tot 10% van de totale celpopulatie die EGFP expresseert. Herprogrammeerde inductible pluripotente stamcelkoloni

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Het huidige protocol beschrijft stappen voor het oplossen van problemen met geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) uit de perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van patiëntenmonsters die moeilijk te herprogrammeren waren volgens de instructies van de fabrikant. Dit protocol is specifiek voor bevroren buffy coat-monsters, maar kan ook worden toegepast op de herprogrammering van gezuiverde PBMC's.

Herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellijnen uit bevroren Buffy Coat-monsters

Leer een efficiënte methode voor het genereren van integratievrije iPSC's uit perifeer bloed met behulp van episomale plasmiden en HDAC-remmers. Deze techniek minimaliseert het risico op insertiemutagenese.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Meer video's verkennen