Name: High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Leer hoe je humane pluripotente stamcellen efficiënt differentieert naar cardiomyocyten via Wnt-modulatie met kleine moleculen. Deze methode gebruikt flowcytometrie met TNNI3- en IRX4-markers voor karakterisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door NIH 4R00HL094708-03, MCW Onderzoek Zaken Comite Nieuwe Faculty Award, en de Kern foundation (startup fondsen) aan het Medical College of Wisconsin (RLG); Research Grants Council van Hong Kong Thema-based Research Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2a-05394, en AHA Established Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoraal Fellowship 12POST12050254 (PWB). Wij danken Hope Campbell bij de flowcytometrie Kern van het Bloed Instituut van Wisconsin voor hulp bij het verzamelen van gegevens en een zorgvuldige beoordeling van het manuscript.

1 Oplossing en Mediavoorbereiding <ol><li> hESC Gekwalificeerde Matrix Coating Stock Solution <ol><li> Langzaam ontdooien hESC gekwalificeerde matrix (5 ml) op ijs bij 4 ° C &#39;s nachts. Doseer porties in pre-gekoeld, 1,5 ml steriele microcentrifugebuizen en onmiddellijk op te slaan bij -20 ° C. OPMERKING: Het volume van de hoeveelheid zal variëren op basis van veel en meestal varieert 270-350 ul. Merk geeft details over volume hoeveelheid vereist om een ​​1x concentratie bij verdunning bekomen in 25 ml zoals beschreven in stap 2.1. </li></ol></li><li> HPSC Media Stock Solutions <ol><li> Gebruik ultrazuiver water als verdunningsmiddel, tenzij anders aangegeven. Steriliseren van alle onderdelen met behulp van een 0,22 pm filter. Bewaar de volgende als bulkoplossingen bij 4 * C: natriumbicarbonaat (75 mg / ml); citroenzuur (10 mM, pH = 3). </li><li> Steriliseren van alle onderdelen met behulp van 0,2 um spuit filter en leg elk als fracties bij -20 ° C: Rho kinase (ROCK) remmer Y-27632 (10mM in DPBS, 100 ui aliquot); L-ascorbinezuur 2-fosfaat (64 mg / ml, 500 ul aliquot); natriumseleniet (70 ug / ml, 100 ui aliquot); transferrine (50 mg / ml, 107 pl aliquot); fibroblastgroeifactor 2 (FGF2, 200 ng / ul in DPBS, 250 ul aliquot); transforming growth factor beta 1 (TGFB1, 100 ng / ul koud 10 mM citroenzuur, 10 pi aliquot). </li></ol></li><li> HPSC Media E8 Solution Samenstelling <ol><li> Bereid media met aliquots bereid in Stap 1.2: DMEM / F12 (met L-glutamine en HEPES, 500 ml), natriumbicarbonaat (3,62 ml; final: 543 ug / ml), L-ascorbinezuur 2-fosfaat (500 ui; final : 64 ug / ml), natriumseleniet (100 pl, final: 140 ng / ml), transferrine (107 pl, final: 10,7 ug / ml), insuline (1 ml; final: 20 ug / ml), FGF2 (250 gl; final: 100 ng / ml), TGFB1 (10 pl, final: 2 ng / ml). </li><li> Combineer alle componenten, filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. </li></ol></li><li> HPSC Media E8 met ROCK Inhibitor <ol><li> Voeg 15 ul ROCK inhibitor tot 12 ml E8 media bereid zoals hierboven en meng. Ervoor te zorgen dat de uiteindelijke concentratie is 10 uM na toevoeging van cellen / media in stap 3.7. </li></ol></li><li> Stock Solutions van Wnt Modulators <ol><li> Bewaar de volgende fracties bij -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM in DMSO, 15 pl aliquot). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-chinolinyl-benzamide; 10 mM in DMSO, 6 ui aliquot). </li></ol></li><li> Differentiatie Media <ol><li> Bereid differentiatie media # 1 met RPMI 1640 (met L-glutamine) met 2% B27 minus insuline aan te vullen. </li><li> Bereid differentiatie media # 2 met RPMI 1640 (met L-glutamine) met 2% B27 plus insuline te vullen en 2% FBS. </li></ol></li><li> Cel Wash Solution fof Cell Culture <ol><li> Gebruik Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium of magnesium. </li></ol></li><li> Cel Wash Solution voor flowcytometrie <ol><li> Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS zonder calcium of magnesium) met 1% FBS. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Cel Onderhoud Oplossing voor flowcytometrie <ol><li> Gebruik Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS, zonder calcium of magnesium) met 5% FBS. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Fixatie Oplossingen voor flowcytometrie <ol><li> Gebruik Cytofix buffer als fixatie-oplossing voor TNNI3 en IRX4 antilichamen. </li><li> Gebruik 4% paraformaldehyde in 1x PBS (maak vers) als fixatie-oplossing voor TNNT2 en MLC2a antilichamen. </li><li> Gebruik 70% methanol / 30% aceton fixatie oplossing MLC2v antilichaam. </li><li> Alle oplossingen bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Permeabilisatie Oplossingen voor flowcytometrie <ol><li> Gebruik Phosflow Perm Buffer III als permeabilisatie oplossing fof TNNI3 en IRX4 antilichamen. Bewaren bij kamertemperatuur (25 ° C). </li><li> Gebruik 0.2% Triton X-100 in 1x PBS zoals permeabilisatie oplossing TNNT2, MLC2v en MLC2a antilichamen. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Blocking Solution <ol><li> Gebruik 10% geit serum in 1x PBS. Maak verse en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol> 2 Plaat Coating <ol><li> Langzaam ontdooien 1 portie van hESC gekwalificeerde matrix bij 4 ° C gedurende 30 minuten, voeg 25 ml koud DMEM / F12 en meng goed in gesteriliseerd weefselkweek kap onmiddellijk voor het coaten van 6-well platen. </li><li> Voeg 1 ml per putje van een 6-well plaat onder gesteriliseerd weefselkweek kap (1 aliquot van de hESC gekwalificeerde matrix voldoende coaten vier 6-well platen). </li><li> Laat hESC gekwalificeerd matrix gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder de motorkap te stellen. Zuig het overtollige hESC gekwalificeerde matrix en voeg 2 ml E8 media met ROCK-remmer aan elk putje. Gebruik platen direct, of desired bewaren bij 4 ° C onmiddellijk na plating maximaal 1 week op kamertemperatuur gedurende 30 min vóór gebruik. </li></ol> 3 Passage en onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs in monolaagkweek <ol><li> Behouden hPSCs in monolaagcultuur in 6-well platen en voer alle stappen onder een steriele weefselkweek kap. </li><li> Gebruik HPSC lijnen die goed worden vastgesteld (&gt; p20) en vertonen een homogene morfologie zonder de aanwezigheid van cellen met een neurale, epithelial- of fibroblast-achtige morfologie. Zorg prolifereren robuust en gemiddeld passage drie dagen bij 75% confluentie bij gezaaid 0.75 x 10 6 per putje. </li><li> Passage hPSCs met dissociatie van de enkele cel niveau minstens 5x voor aanvang van de differentiatie naar maximale differentiatie efficiëntie te garanderen. Om passage hPSCs, aspireren E8 media en wassen cellen tweemaal met 4 ml van 1x DPBS (voorverwarmd tot kamertemperatuur). Voeg 1 ml van de cel detachment oplossing (voorverwarmd tot kamertemperatuur) aan elk putje en laat het goed rusten gedurende 3-7 minuten, tot celgrenzen beginnen round-up. </li><li> Gebruik een katoenen aangesloten glazen pipet met gloeilamp cellen los en overbrengen naar een 15 ml conische buis met 1 ml DMEM / F12 media (de cellen loslaten oplossing inactiveren). </li><li> Breng 10 pl aliquot van cellen en meng met 10 pi trypan blauw in een microcentrifugebuis. Telling cellen (bijvoorbeeld automatische of handmatige hemocytometer) terwijl overige cellen verzameld door centrifugatie bij 130 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Met behulp van dit protocol, verwachten dat 70-80% levensvatbaarheid behulp van een geautomatiseerd hemocytometer en gaan vooruit, basis van alle mobiele nummers op het totaal-cel-tellingen. </li><li> Zuig media en resuspendeer de celpellet in DMEM / F12 tot een eindconcentratie van 0,75 x 10 6 cellen per 500 ui. </li><li> Voeg 500 ul van de celsuspensie aan elk putje van een 6-well plaat waarbij elk putje contains 2 ml E8 media met ROCK-remmer, bereid in stap 2.3. Het verlaten van plaat op het werkblad, zachtjes bewegen in een front-to-back en side-to-side beweging gelijkmatig verspreiden cellen over het goed. Terug cellen incubator bij 5% CO2, 37 ° C. </li><li> Beginnen 24 uur na passage, vervang de media dagelijks met 2 ml / putje E8 zonder ROCK inhibitor. Optimaliseer entdichtheid tot 100% confluentie voor aanvang van differentiatie bereiken. Seed 0.75 x 10 6 cellen / putje vier dagen voor aanvang van differentiatie, maar optimaliseren voor elke cellijn als nodig. </li></ol> 4 Cardiomyocyte Inductie van hPSCs door Selectieve modulatie van de Wnt-route <ol><li> Vernieuwen media (2 ml / putje) dagelijks gedurende 0-7 dagen, en om de andere dag na dag 8. </li><li> Op dag 0, beginnen differentiatieproces door vervanging E8 media differentiatie media nr.1. Voeg 1.2 ul CHIR (6 uM definitief) aan elk putje. Herhalen op dag 1. </li><li> Op dagen 2-3, te vervangen door verse differentiatie media # 1. </li><li> Op dag 4 wordt verse differentiatie medium nr.1. Voeg 1 ul IWR-1 (5 uM final) aan elk putje. Herhalen op dag 5. </li><li> Op dagen 6-7, vervangen met verse differentiatie medium nr.1. </li><li> Op dag 8, te vervangen door verse differentiatie media # 2. </li><li> Blijf vervangen differentiatie media nr.2 elke dag gewenste cultuur. </li><li> Indien gewenst, passage hartspiercellen met behulp van de cel detachement oplossing volgende stappen in 3,3-3,6, maar het vervangen van de media met differentiatie media # 2. Tijdens de passage, distantiëren hartspiercellen in kleine clusters van ~ 3-10 cellen. Zaad op ~ 6 x 10 5 cellen per putje met hESC gekwalificeerde matrix beklede putjes en differentiatie media 2 #. </li></ol> 5 Het verzamelen van cellen voor flowcytometrie <ol><li> Voer alle overige aspecten van de stappen 5-9 op het lab bank (dat wil zeggen, niet steriel). </li><li> Zuig groeimedia en wassen cellen tweemaal met 1x PBS.Voeg 1 ml van de cellen loslaten oplossing (voorverwarmd tot kamertemperatuur) aan elk putje en laat men het gedurende 3-7 minuten, tot celgrenzen beginnen round-up. Gebruik een katoenen aangesloten borosilicaatglas wegwerp 9 &quot;pipet met lamp aan cellen los en breng in een 15 ml conische buis op ijs. </li><li> Gedurende verdere protocol handhaven cellen op ijs en centrifugeren uitgevoerd bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 * C. </li><li> Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Resuspendeer cellen in 10 ml cel wasoplossing met een 10 ml serologische pipet met herhaalde trituratie naar cel klonten waarborgen worden gedispergeerd in afzonderlijke cellen. Tellen cellen zoals in stap 3.5, terwijl overige cellen verzameld door centrifugatie. </li><li> Resuspendeer cellen in cel wasoplossing zorg volledig disaggregeren cel pellet en hoeveelheid 1 x 10 6 cellen per buisje met ronde bodem. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. </li></ol> 6 Fixatie enPermeabilisatie van Cellen voor intracellulaire Antigen kleuring <ol><li> Voeg 100 ul fixatie oplossing celpellet. Toevoegen oplossing druppelsgewijs onder voortdurend zachtjes vortexen en vervolgens op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. </li><li> Voeg 100 ul permeabilisatie oplossing cel pellet. Toevoegen oplossing druppelsgewijs onder voortdurend zachtjes vortexen vervolgens op ijs gedurende 30 minuten. Gebruik fixatie en permeabilisatie voorwaarden als beschreven voor elk antilichaam in tabel 1. </li><li> Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten na permeabilisatie. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Primary Antibody (Clone) </td><td rowspan="2"> Immunogeen / Epitoop Erkend </td><td rowspan="2"> Istotype Controle </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Bedrag van primair antilichaam per 1 x 10 6 cellen in 100 ul </td><td rowspan="2"> Fixatie Solution </td><td rowspan="2"> Permeabilisatie Solution </td><td rowspan="2"> Secundair antilichaam </td><td rowspan="2"> Hoeveelheid secundaire antilichaam / 1 x 10 6 cellen in 100 ul </td></tr><tr><td> Voor percentage positieve metingen </td><td> Voor Antigen Kwantificering </td></tr><tr><td> TNNI3 (284 (19C7) </td><td> ISASRKLQL (menselijke) </td><td> Muis IgG2b </td><td> 1,0 ug </td><td> 3,0 g </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow perm III </td><td> Geit anti-muis IgG2b-Alexa488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> TNNT2 (1C11) </td><td> Volledige lengte gezuiverd natief menselijk troponine T eiwit. </td><td> Muis IgG1 </td><td> 1,0 ug </td><td> 2,0 g </td><td> 4% PFAin 1% PBS </td><td> 0.2% Triton X-100 in 1% PBS </td><td> Geit anti-muis IgG 1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2v (330G5) </td><td> FDPEGKG </td><td> Mouse IgG2a </td><td> 2,0 g </td><td> 3,0 g </td><td> 70% methanol / 30% aceton </td><td> 0.2% Triton X-100 in 1% PBS </td><td> Geit anti-muizen IgG2a - Alexa 647 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2a (4E7) </td><td> volledige lengte humaan recombinant eiwit van humane MYL7 geproduceerd in E. coli </td><td> Muis IgG1 </td><td> 0.5 ug </td><td> 3,0 g </td><td> 4% PFA in 1% PBS </td><td> 0.2% Triton X-100 in 1% PBS </td><td> Geit anti-muis IgG 1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> IRX4 </td><td> LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST </td><td> Konijn IgG </td><td> 0.5 ug </td><td> 0.5 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow perm III </td><td> Geit anti-raBBIT IgG-PE </td><td> 600 ng </td></tr></tbody></table> Tabel 1 antilichaamconcentraties. Vind je het primaire antilichaam, kloon (indien monoklonale), geoptimaliseerde concentraties en fixatie en permeabilisatie voorwaarden voor elke primaire en secundaire antilichaam gebruikt voor flowcytometrie analyses. Zoals antilichaam stock concentraties variëren tussen verkopers van dezelfde kloon, eindconcentraties van elk antilichaam per 1 x 10 6 cellen in een vaste testvolume, dan verdunningen, worden voorzien. Het immunogeen gebruikt om het antilichaam te genereren, of epitoop herkend door antilichamen, zoals voorzien door de fabrikant, is genoteerd, maar werd hier niet experimenteel geverifieerd. 7 antilichaamkleuring <ol><li> Voor elk experiment, inclusief een onbesmet controle per fixatie / permeabilisatie conditie en de juiste isotypecontrole voor elke primaire antilichaam gebruikt. Omvatten niet-cardiomyocyte celtypes als negatieve controles (bijvoorbeeld pluripotente stamcellen of fibroblasten). Gebruik isotype controles in dezelfde concentratie als overeenkomstige primaire antilichaam (zie tabel 1). </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul blokkeren oplossing met behulp van een P200 pipet om cellen van elkaar te scheiden. Set monsters op ijs gedurende 25 min met zachte wiegen. </li><li> Zonder het verwijderen blokkeeroplossing toevoegen primair antilichaam of isotype controle per richtlijnen in tabel 1. Incubeer 45 min op ijs met zachte wiegen. </li><li> Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten na het primaire antilichaam labeling. </li><li> Als een fluorofoor-geconjugeerde primaire antilichaam wordt gebruikt, gaat u verder met 8.1. Wanneer een geconjugeerde primaire antilichaam wordt gebruikt (bijvoorbeeld voor alle markers beschreven), voert labeling met secundaire antilichaam dat als volgt geconjugeerd aan een fluorofoor. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul blokkeren oplossing met behulp van een P200 pipet om DISAggregate cellen. </li><li> Voeg secundair antilichaam per richtlijnen in tabel 1. Incubeer 30 min op ijs met zachte wiegen. </li><li> Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten na het secundair antilichaam labeling. </li></ol> 8 Voorbereiding van de cellen voor flowcytometrie <ol><li> Resuspendeer cellen in 400 ul celonderhoud oplossing met behulp van een P1000 pipet om cellen van elkaar te scheiden. </li><li> Bereid een cel zeef dop op een ronde bodem buis door voorbevochtiging met 50 ul celonderhoud oplossing. Stel buis op ijs. Gebruik de cel zeef muts om te voorkomen celaggregaten van verstopping van de flowcytometer. </li><li> Transfer cel oplossing voor zeefdop cel en laat celsuspensie uitlekken door de zwaartekracht. Tik onderkant van de buis zachtjes op de bank top als nodig, zodat cellen worden verzameld in de buis en zo snel terug zetten op ijs mogelijk. Spoel zeef met 250 ul celonderhoud zolution om maximale herstel van cellen te verzekeren. </li><li> Aanvullen cellen op ijs en bescherm tegen licht tot door stroomcytometrie geanalyseerd. </li></ol> 9 Flowcytometrieanalyse Gedetailleerde overname instellingen zal variëren naargelang de instrumenten. Fundamentele parameters te overwegen voor optimale gegevensverzameling worden hieronder beschreven. <ol><li> Voor optimale stabiliteit stroom voor dat de spuitmond overschrijdt 5-6x de diameter van de cel wordt geanalyseerd. OPMERKING: Dit kan variëren tussen instrumenten, maar is een belangrijke overweging, zowel voor de analyseapparatuur en het selecteren van de juiste nozzle grootte voor cel sorteren. De gemiddelde diameter van dag 10 cardiomyocyten 11 urn (tussen 8-14 micrometer); dus een standaard 150 urn monsterinjectie buis analysator werkt goed. </li><li> Vlak voor gegevensanalyse, vortex elke buis kort cel aggregaten te dispergeren. </li><li> Optimaliseer voorwaartse en zijwaartse verstrooiing voltage instellingen voor elk celtype gebaseerd opongekleurde control elk fixatie / permeabilisatie conditie gebruikt in het experiment zodanig dat de populaties van belang op schaal en gecentreerd (figuur 2A). <ol><li> Handhaaf deze instellingen gedurende een enkel experiment en zijn consistent van experiment om te experimenteren op hetzelfde instrument, als belangrijke verschuivingen potentiële problemen met de flowcytometer of monstervoorbereiding kunnen wijzen. </li></ol></li><li> Voor elke fluorofoor, analyseren de isotypecontrole en stel de juiste laser spanning aan de minimaal vereiste lichtsterkte van een fluorescentie histogram dat zowel de linker en rechterkant van de piek geeft verkrijgen bepalen. Handhaving van de laser-instellingen voor elke isotypecontrole bij de verwerving van gegevens op overeenkomstige-antilichaam gekleurd monsters. OPMERKING: Signal drift vaak optreedt na verloop van tijd op hetzelfde instrument. Het is cruciaal om laser hier op het begin van elk experiment op basis van de juiste isotype regelaar. </li><li> Verzamel minimaal10.000 evenementen. 50.000 events voorkeur. </li><li> Voor statistische analyses, de poort van de levende cellen bevolking om vuil (Figuur 2A) uit te sluiten. Bepaal percentage positieve cellen in de populatie op basis gated marker plaatsing die ≤2% bijdrage maakt van isotype controle, zoals getoond in figuur 2B, C. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cruciaal voor het succes van de differentiatie protocol is het gebruik van hoge kwaliteit culturen van hPSCs die zijn gepasseerd op enkele cel niveau minstens vijf passages voor het begin van differentiatie. Soortgelijke differentiatie efficiënties routinematig waargenomen bij verschillende HPSC lijnen als ze 100% confluent bij aanvang van differentiatie, onafhankelijk van cellijn. Suboptimale efficiëntie wordt waargenomen wanneer de cellen samenvloeiing van begin differentiatie ≤95% of&gt; 100%. Daarom moet zaaidichthe...

De generatie van hartspiercellen uit hPSCs, inclusief hESC en hiPSC, kan functioneren als een in vitro model van de zeer vroege menselijke cardiale ontwikkelingsprocessen, die inzicht geven in etappes anders niet toegankelijk zijn voor mechanistische studies. Dit model biedt unieke mogelijkheden om de moleculaire pathways die cardiale lineage inzet en lot van de cel specificatie controle te bestuderen. De laatste jaren heeft de mogelijkheid om efficiënt genereren cardiomyogene cellen van hPSCs sterk verbeterd 1-15. Echter, onder protocollen er cellijn variatie met betrekking tot de efficiëntie van het genereren cardiomyogene cellen en timing waarmee de cellen tot expressie kamer merkers (bijvoorbeeld ventrikel en atria). Idealiter voor toekomstige toepassingen van dit modelsysteem homogenere populatie van functioneel gedefinieerde cellen gewenst. In tegenstelling tot eerdere methoden hartspierdifferentiatie protocol beschreven here ofwel ce vereisenll aggregatie of de toevoeging van Activin A of Bone morfogenetische eiwit 4 (BMP4) en robuust genereert culturen zeer positief voor TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v en MLC2a bij dag 10 cellen in alle hESC en hiPSC lijnen getest tot nu toe. De strategie is technisch eenvoudig te implementeren, vooral in vergelijking met driedimensionale kweken, massacultuur of embryoid body strategieën 4-9, en is recentelijk gedefinieerd in een studie die een klein molecuul met selectieve toxiciteit voor hPSCs beschreven (Boheler et al. ) 65. Kenmerken van dit protocol zijn onder andere differentiatie van hPSCs in monolaagkweek behulp van een enkele laag van een hESC gekwalificeerde matrix (Matrigel), volledig gedefinieerde media met behulp van kleine moleculen aan Wnt-signalering (vergelijkbaar, maar toch onderscheiden van 1,2,7,13) moduleren, en geoptimaliseerde flowcytometrie kleuring methoden voor het evalueren van differentiatie efficiency en celidentiteit. Kortom, de voordelen van dit protocol vergeleken met de vorige verslagen zijn onder meer de kosten-effectiveness, reproduceerbaarheid, en zijn hoge efficiency voor het genereren van hartspiercellen tussen meerdere HPSC lijnen, met inbegrip van hESC en hiPSC lijnen. Flow cytometrie is een krachtige analytische tool voor het beoordelen van de kwaliteit van de cellen in de cultuur en het bepalen subpopulatie homogeniteit, en met de juiste experimentele opzet, kan kwantitatieve metingen geven. Zoals met alle antilichamen gebaseerde strategieën, nauwkeurige interpretatie van experimentele resultaten vereist dat elementen van de test ontwerp met inbegrip van de concentratie en fixatie antilichaam en permeabilisatie voorwaarden (wanneer de doelgroep intracellulaire antigenen) worden zorgvuldig getest voor elk antilichaam als sub-optimale omstandigheden aanzienlijk efficiëntie van antilichaam invloed bindend, en dus, de interpretatie van de resultaten. Belangrijk, indien kwantificatie nodig, monoklonale antilichamen zijn essentieel als polyklonale antilichamen meerdere epitopen herkennen en zijn gevoelig voor batch-to-batch variatie. Momenteel, verschillende antilichamen (polyclonal en monoklonaal) en kleuring protocollen zijn beschreven voor de beoordeling van de in vitro differentiatie, waardoor het moeilijk is om de efficiëntie van cardiomyogenesis onder protocollen 1,2,9,11 vergelijken. Daarom zijn monoklonale antilichamen die beschikbaarheid voor flowcytometrie geanalyseerd. In de toekomst wordt verwacht dat normalisatie van deze kleuringsprotocollen, vooral met betrekking tot kwantificatie, moet vergelijking tussen differentiatiestrategieën beter mogelijk. De keuze van merkers, en hun overeenkomstige antilichamen worden gebruikt om de zuiverheid van in vitro cardiomyogenesis beoordelen varieert tussen rapporten. TNNT2 is beschouwd als een indicator van de cellen zich in voor de cardiomyogene lot en wordt routinematig gebruikt om de efficiëntie van de cardiale differentiatie protocollen te beoordelen. Echter, wordt TNNT2 ook tot uitdrukking in de skeletspier tijdens de vroege chick en rat ontwikkeling 16,17 en het aanwezig is in de menselijke gladde spier 18 is </sup&gt;. Aldus TNNT2 niet noodzakelijk een specifieke marker van humane cardiomyogenesis in vitro. MLC2v en MLC2a worden routinematig gebruikt als surrogaat markers van ventriculaire en atriale subtypes, respectievelijk. Echter, de uitdagingen met vertrouwen op MLC2v en MLC2a om cardiomyocyte subtype te bepalen in het kader van de in vitro differentiatie voort uit het feit dat deze genproducten niet kan worden beperkt tot een specifieke kamer hele ontwikkeling van het hart, van het hart buis door volwassenen. In een lus het knaagdier hart, MLC2a mRNA is overheersend in het atrium / instroom darmkanaal gebied en MLC2v mRNA is overheersend in de ventriculaire / uitstroombaan regio. In de lus hart, co-expressie van MLC2a en MLC2v mRNA waargenomen in de instroom darmkanaal, atrioventriculaire kanaal, en de uitstroom 19,20. Bij 3 dagen na de geboorte, is MLC2v mRNA beperkt tot de ventrikel en 10 dagen na de geboorte, is MLC2a beperkt tot de atria in de neonatale rat hart 19. Daarom interpretatievan gegevens betreffende cardiomyogenesis efficiency en subtype identiteit niet alleen naar de aanwezige hoeveelheid referentiemarkering niveaus, maar moet overwegen het ontwikkelingsstadium (s) waarop de tijdstippen van differentiatie die geanalyseerd overeenkomen. Dit is bijzonder belangrijk aangezien de rijpingsfase van cardiomyogene cellen gegenereerd door in vitro differentiatie van hPSCs lijkt meest die van embryonale / foetale ontwikkeling 21-25. Dus, met een beroep op een marker ruimtelijke expressie in de postnatale hart misschien niet geschikt voor de beoordeling van HPSC-afgeleide cellen, althans in sommige gevallen. In een poging om de ontwikkeling van meer specifieke criteria voor het bepalen van identiteit cardiomyocyten in vitro te vergemakkelijken, wordt TNNI3 beschouwd als een waardevolle marker voor het evalueren cardiomyogenesis in vitro kunnen alleen de hartspier gedurende embryogenese in kuiken en zebravis 15,20 zijnen afwezig is in menselijke foetale skeletspier 26. Terwijl TNNI1 aanwezig in humane foetale hart is, TNNI3 is de enige TNNI isovorm aanwezig is in de normale volwassen hart 27,28. Wat betreft cardiomyocyte subtype identiteit, IRX4 29-31 is een informatieve marker van cellen met een ventriculaire lot. Op het eiwitniveau, is IRX4 onlangs aangetoond worden beperkt tot de ventrikel van lineaire hartbuis door neonatale stadia van de muis 32. Bijgevolg geoptimaliseerd kleuringsprotocollen voor de analyse van TNNI3 en IRX4 door flowcytometrie beschreven. Bij ons weten is dit de eerste beschrijving van een werkwijze voor efficiënte antilichamen gebaseerde kleuring en analyse van IRX4 niveaus in cardiomyocyten door flowcytometrie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Celcultuur</td></tr><tr><td>BD Matrigel, hESC-gekwalificeerde matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Accutase cell detachment solution</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), zonder calcium, zonder magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO, Hybri-Max, steriel gefilterd)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53817</td><td></td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride selectieve p160ROCK-remmer</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinezuur-2-fosfaat sesquimagnesiumzouthydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine (Optiferrin &ndash; Gedefinieerd, Dierlijk-vrij, Recombinant Humaan)</td><td>Invitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4144-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor beta 1 (TGF&beta;1)</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 met L-Glutamine en 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 HCl</td><td>Sellekchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 met L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement Minus Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (met Insulin)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow Cytometry Reagents</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline (10x)</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>119-069-151</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution zonder Ca2+ en Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Phosflow perm buffer III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179957-4L</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Mallenckrodt Chemicals&nbsp;</td><td>2440-16</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>M236-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materialen</td></tr><tr><td>5 ml Ronde bodempolystyreenbuis (zonder dop)</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Voor de bereiding van cellen voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>5 ml Ronde bodempolystyreenbuis (met 35 &micro;M celstrainer snap cap)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Voor de bereiding van cellen voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>2 ml rubberen bulben</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>9" borosilicaat unplugged glas Pasteur pipets</td><td>BioExpress</td><td>P-2904-2</td><td></td></tr><tr><td>0,65 ml Microcentrifugebuizen, gegradueerd, groen</td><td>GeneMate</td><td>C-3259-G</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Microcentrifugebuizen, gegradueerd, rood</td><td>GeneMate</td><td>C-3260-R</td><td></td></tr><tr><td>TC20 geautomatiseerde celteller</td><td>BioRad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Telling slides voor TC20</td><td>BioRad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>6-well Platte bodem weefselcultuur behandelde plaat</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spuiten</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td>Voor filter sterilisatie van aliquots</td></tr><tr><td>Steriele spuitfilters, 0,2 &micro;m polyethersulfone</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Voor filter sterilisatie van aliquots</td></tr><tr><td>250 ml Filter systeem, 0,22 &micro;m polyethersulfone, sterilisaties, laag bindend</td><td>Corning</td><td>431096</td><td>Voor filter sterilisatie van bulk media&nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml filter systeem, 0,22 &micro;m polyethersulfone, sterilisaties, laag bindend</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Voor filter sterilisatie van bulk media</td></tr><tr><td colspan="4">Antilichamen en Isotype Controles</td></tr><tr><td>Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td><td>Abcam</td><td>ab19615</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-16687</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td><td>Synaptic Systems</td><td>310111</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td><td>Abcam</td><td>AB131661</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-IRX4&nbsp;&nbsp;</td><td>Bioss</td><td>BS-9464R</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>A21241</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td><td>Life Technologies</td><td>A21141</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td><td>R&amp;D Systems</td><td>F0110</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>557273</td><td>Isotype Control</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>eBiosciences</td><td>16-4

high efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Er is een dringende noodzaak om de aanpak voor het repareren van het beschadigde hart, het ontdekken van nieuwe therapeutische geneesmiddelen die geen toxische effecten op het hart hebben, en het verbeteren van de strategieën om nauwkeurig te modelleren hart-en vaatziekten te ontwikkelen. Het potentieel van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) technologie benutten om de hartspier te genereren &quot;in een schotel&quot; voor deze toepassingen blijft hoog enthousiasme te genereren. De laatste jaren heeft de mogelijkheid om efficiënt genereren cardiomyogene cellen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) sterk verbeterd, biedt ons nieuwe mogelijkheden model zeer vroege stadia van menselijke hartontwikkeling zonder dergelijke. In tegenstelling tot vele eerdere werkwijzen hartspierdifferentiatie protocol beschreven here ofwel geen celaggregatie of toevoeging van activine A of BMP4 vereisen en robuust genereert celkweken die sterk positief zijn voor cardiaal troponine I en T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klasse homeodomein eiwitIRX-4 (IRX4), myosine regulerende lichte keten 2, ventriculaire / hartspier isovorm (MLC2v) en myosine regulerende lichte keten 2, atriale isovorm (MLC2a) op dag 10 in alle menselijke embryonale stamcellen (hESC) en hiPSC lijnen getest datum. Cellen kunnen worden gepasseerd en onderhouden voor meer dan 90 dagen in de cultuur. De strategie is technisch eenvoudig te implementeren en kosteneffectief. Karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van pluripotente cellen omvat vaak de analyse van referentiemarkeringen, zowel op mRNA en eiwitniveau. Voor eiwitanalyse flowcytometrie een krachtig analytisch hulpmiddel voor de beoordeling van cellen in kweek en het bepalen subpopulatie homogeniteit. Echter, technische variatie in monstervoorbereiding significante invloed kwaliteit van flowcytometrie data. Daarom moet standaardisatie van kleuringsprotocollen vergelijkingen tussen verschillende differentiatie strategieën vergemakkelijken. Bijgevolg geoptimaliseerd kleuringsprotocollen voor de analyse van IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 en TNNT2 door flowcytometrie beschreven.

Op dag 0, cellen 100% confluent met compact morfologie en minimale celresten. Op dagen 1-2 is het gebruikelijk aanzienlijke celdood (40-50%) zien, maar verbonden cellen compact morfologie (figuur 1A) behouden. Gedurende deze tijd, media oranje en troebel. Roze media geeft overmatige celdood, en in dit geval, bevestig met trypaanblauw en staken indien celdood hoger is dan 70%. Cellen zal herstellen tijdens dagen 3-4 en de dichtheid toeneemt. Tijdens de dagen 5-6, minimal celdood optreedt en dichte patche...

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige culturen van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen te genereren en het eindproduct adequaat te karakteriseren met behulp van flowcytometrie. Om dit te bereiken worden hoogwaardige monolaagculturen van ongedifferentieerde pluripotente stamcellen gegenereerd. Cardiomyogenese wordt vervolgens geïnduceerd door de wind-route te moduleren met behulp van kleine moleculen.Vervolgens worden de cardiomyocyten gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd onder omstandigheden die specifiek geoptimaliseerd zijn voor elk antilichaam. Ten slotte worden de cellen geanalyseerd door flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die culturen tonen die zeer positief zijn voor cardiale markers, TNNI drie en IRX vier en die ventriculair-achtige actiepotentialen demonstreren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die in werknemers en lichaamsdeeltjes, is dat het relatief eenvoudig te implementeren is en kosteneffectief. Bovendien genereert de techniek culturen van cellen die zeer positief zijn per cardiale troponine I. Zonder de innerlijke onderliggende variatie en efficiëntie die d

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Hier presenteren we een robuust, snel en schaalbaar protocol voor cardiomyocytedifferentiatie voor humane pluripotente stamcellen (hPSC's). Cardiomyocyten die met deze grootschalige methode worden verkregen, kunnen voldoende celgetallen leveren voor hun effectieve gebruik in modellering van menselijke hart- en vaatziekten, high-throughput geneesmiddelenonderzoek en mogelijk klinische toepassingen.

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Hier beschrijven en valideren we een methode voor het consequent genereren van robuuste menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardio myocytes en karakteriseren hun functie. Deze technieken kunnen helpen bij het ontwikkelen van mechanistisch inzicht in signalering trajecten, bieden een platform voor grootschalige drug screening, en betrouwbaar model cardiale ziekten.

Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer hoe je humane pluripotente stamcellen efficiënt differentieert naar cardiomyocyten via Wnt-modulatie met kleine moleculen. Deze methode gebruikt flowcytometrie met TNNI3- en IRX4-markers voor karakterisatie.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Meer video's verkennen