High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige culturen van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen te genereren en het eindproduct adequaat te karakteriseren met behulp van flowcytometrie. Om dit te bereiken worden hoogwaardige monolaagculturen van ongedifferentieerde pluripotente stamcellen gegenereerd. Cardiomyogenese wordt vervolgens geïnduceerd door de wind-route te moduleren met behulp van kleine moleculen.

Vervolgens worden de cardiomyocyten gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd onder omstandigheden die specifiek geoptimaliseerd zijn voor elk antilichaam. Ten slotte worden de cellen geanalyseerd door flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die culturen tonen die zeer positief zijn voor cardiale markers, TNNI drie en IRX vier en die ventriculair-achtige actiepotentialen demonstreren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die in werknemers en lichaamsdeeltjes, is dat het relatief eenvoudig te implementeren is en kosteneffectief. Bovendien genereert de techniek culturen van cellen die zeer positief zijn per cardiale troponine I. Zonder de innerlijke onderliggende variatie en efficiëntie die door andere protocollen wordt waargenomen, is visuele demonstratie van de methode cruciaal, aangezien de kwaliteit van de pre-differentiatiecellen de differentiatie-efficiëntie aanzienlijk zal beïnvloeden. Ook onjuiste fixatie en permeabiliteit vóór antilichaamkleuring zal leiden tot suboptimale flowcytometrieresultaten, wat aantoont dat de procedure schadelijk zal zijn. Bachar, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.

Het meest uitdagende aspect van de volgende procedure is het behouden van hoogwaardige ongedifferentieerde pluripotente stamcellen vóór differentiatie. Het gebruik van cellen met suboptimale groeikerkenmerken zal de efficiëntie van differentiatie aanzienlijk beïnvloeden. Begin deze procedure met goed gevestigde HPC's gekweekt in zes putjes met HESC-gekwalificeerde matrix gecoate schotels.

Controleer de cellen onder de microscoop om ervoor te zorgen dat ze een homogene morfologie vertonen. Als de cellen een neurale epitheliale of fibroblast-achtige morfologie vertonen zoals hier getoond, mogen ze niet worden gebruikt. Zorg ervoor dat de cellen robuust prolifereren wanneer ze gezaaid worden op 0,75 miljoen per putje. Passageer ze ongeveer om de drie dagen bij 75% confluentie. Passageer de cellen met dissociatie tot op single cell-niveau ten minste vijf keer vóór het begin van differentiatie om te passageren.

De cellen aspireren eerst het E acht-groeimedium en wassen de cellen twee keer met vier milliliter PBS voorverwarmd tot kamertemperatuur. Voeg vervolgens een milliliter kamertemperatuurceldetacheringsoplossing toe aan elke put en laat de put ongestoord tot de celgrenzen beginnen af te ronden. Dit duurt meestal drie tot zeven minuten en kan macroscopisch worden waargenomen en bevestigd met behulp van een microscoop.

Vervolgens, met behulp van een met katoen gevulde glazen pipette met een bulb, worden de cellen losgemaakt en overgebracht naar een 15 milliliter conische buis met één milliliter DM EMF 12-medium. Dit zal de celdetacheringsoplossing inactiveren. Verwijder een 10 microliter aliquot van de celoplossing en meng het met 10 microliters trian blauw in een microcentrifugebuisje.

Tel de cellen en centrifugeer vervolgens de 15 milliliter conische buis bij 130 GS gedurende vijf minuten om ze te verzamelen. Tel de cellen op kamertemperatuur tijdens de centrifugatie met behulp van een geautomatiseerd hemo cytometer. Verwacht 70 tot 80% levensvatbaarheid vooruit.

Baseer alle celgetallen op totaal celtelling in plaats van op levensvatbare celtelling. Na het draaien aspireert u het medium en suspendeert u het celpellet in D-M-E-M-F 12 tot een uiteindelijke concentratie van 0,75 keer 10 tot de zes cellen per 500 microliter, voeg 0,5 milliliter van de celsuspensie toe aan elke put van een zes-putten plaat waarbij elke put twee milliliter E acht-medium bevat. Met rock-inhibitor, roer voorzichtig de plaat van voor naar achteren en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig over de put te verdelen.

Breng de cellen terug naar de incubator bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. 24 uur na het verpakken. Begin de medium dagelijks te vervangen met twee milliliter per put van E acht met of zonder rock-inhibitor.

Optimaliseer de zaaddichtheid om 100% confluentie te bereiken vóór het begin van differentiatie. Op dag nul zijn de cellen 100% confluent met compacte morfologie en minimale celresten. Begin het differentiatieproces door het E acht-medium te vervangen door twee milliliter differentiatiemedium.

Nummer een, voeg 1,2 microliter CHIR toe aan elke put op dagen een en twee. Het is gebruikelijk om significante 40 tot 50% celdood waar te nemen. De aangehechte cellen zullen echter compacte morfologie behouden.

Gedurende deze tijd wordt het medium oranje en troebel. Als roze medium, wat aangeeft dat overmatige celdood wordt waargenomen, bevestig de celviabiliteit met triam blauw en stop als de celdood 70% overschrijdt. Anders, op dag een, herhaal het proces van het vervangen van de media met twee milliliter vers differentiatiemedium. Nummer een, voeg 1,2 microliter CHIR toe aan elke put en vervang op dagen twee tot drie met vers differentiatiemedium.

Nummer een, gedurende dagen drie tot vier zullen de cellen herstellen en zal de dichtheid op dag vier toenemen. Vervang het medium in elke put met vers differentiatiemedium. Nummer een en één microliter IWR een.

Gedurende dagen vijf tot zes treedt minimale celdood op en dichte patches kunnen op dag vijf beginnen te verschijnen, vervang het medium met vers differentiatiemedium. Nummer een en voeg op dag zes tot zeven één microliter IWR een toe aan elke put. Vervang op dag zes tot zeven het medium met vers differentiatiemedium. Nummer een.

Tegen dag zeven tot acht is een confluente monolaag bereikt met compacte morfologie doortrokken met dichte patches. Tegen dag acht zullen de cellen spontaan beginnen samen te trekken en de eerste samentrekkingen zijn vaak zichtbaar in de dichte patches. Op dag acht vervang het medium met vers differentiatiemedium.

Nummer twee, blijf vervangen met differentiatiemedium nummer twee