Name: Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer hoe je anatomisch nauwkeurige intracraniale xenograften van humane hersentumoren in muizen creëert. Deze chirurgische methode maakt reproduceerbare tumorontwikkeling mogelijk voor het testen van nieuwe therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Keating wordt gefinancierd door DOD subsidie ​​CA100335 en is een St. Baldrick&#39;s Foundation Scholar.

Alle procedures werden beoordeeld en door onze institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie goedgekeurd. 1 Plan de Experiment <ol><li> Selecteer cellen te injecteren. Cellen uit verschillende bronnen zijn kandidaten voor injectie: hechtende celkweek lijnen genetisch gemodificeerde klonen neurosfeercellen primaire kweken, of gescheiden tumoren. Het type model gewenst zal de meest geschikte injectieplaats definiëren. <ol><li> Bepaal het aantal cellen voor injectie. Het aantal cellen dat nodig is om tumoren te vormen afhankelijk cellijn en moet empirisch worden bepaald; tumor groei sterk afhankelijk van celtype celaantal en weefselkweek passage nummer. Celaantallen variërend van 1 x 04-2 oktober x 10 5 of meer per injectie zijn tumoren van verschillende groei geproduceerd. </li><li> Beperk het volume voor injectie. De cellen moeten in het kleinste volume van serumvrij medium of fosfaat gebufferde s geschorstaline (PBS) die zorgt voor een soepele, gemakkelijke doorgang door een 26 G naald. Hoe kleiner het volume daadwerkelijk in de hersenen afgegeven, hoe preciezer omschreven en de resulterende tumor; optimale resultaten worden verkregen door het injecteren van volumes variërend van 3 tot 6 pl. Plan een totaal eindvolume van ten minste 50 ui gesuspendeerde cellen te bereiden, ongeacht het aantal injecties voorzien teneinde nauwkeurige meting mengen en bemonstering mogelijk. </li></ol></li><li> Kies de juiste muizen voor het model. Murine modellen van menselijke tumoren gebruiken meestal jonge immuun-gecompromitteerde muizen immuungemedieerde transplantaatafstoting te voorkomen. Het is niet nodig om het werk te laten plaatsvinden in een biologisch veiligheidskabinet indien de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen, met inbegrip van ontsmetting, desinfectie en sterilisatie van materialen en apparatuur. Het hier getoonde werk is gedaan in athymische naakt muizen, man en vrouw, tussen de 6 en 12 weken leeftijd. Muizen die minder dan 20 g wegen kan moeilijk te positioneren op alstereotaxic frame en kunnen meer vatbaar voor onderkoeling. </li></ol> 2 Monteer de apparatuur <ol><li> Verkrijgen en te ontsmetten een muis stereotaxisch frame, uitlijning console, en de muis gas anesthesie hoofd houder, injectiespuit pomp, warmte-pad, anesthesie machine, glasvezel werklamp, en variabele snelheid roterende boor. Reinigen en ontsmetten van alle apparatuur. </li><li> Programmeer de injectie parameters (inclusief injectievolume, stroomsnelheid, snelheid, type spuit) en andere variabelen die voor de werking van de injectiepomp. Optimaliseer instellingen voor elke specifieke model. OPMERKING: In deze injecties waren de instellingen 3.000 nl monsters met een snelheid van 400 nl / min (tarief eenheden &quot;M&quot;) met behulp van een 25 ul injectiespuit (Device Type &quot;E&quot;) in de niet-gegroepeerde (&quot;N&quot;) modus. </li><li> Reinig een precisie micro met 26 G naald met meerdere keren wordt gespoeld steriel gedemineraliseerd water (Dih 2 O) en 70% ethanol (EtOH), het doen van een laatste rinse met Dih 2 O. Sommige, maar niet alle modellen zijn ontworpen om te worden geautoclaveerd. Zorg ervoor dat de zuiger beweging is glad en vrij. </li><li> Verkrijgen anesthesie levering apparatuur. Isofluraan de voorkeur verdoving is gemakkelijk om de diepte en duur van de anesthesie regelen. Zorg ervoor dat de stereotactische apparaat is uitgerust met een muis anesthesie gas gehechtheid en dat de benodigde slangen en aansluitingen zijn getroffen om het gasmengsel te leveren uit de narcose machine naar de muis. </li><li> Autoclaaf chirurgische instrumenten, met inbegrip van fijne punt schaar, twee tangen / hemostats (met tanden) voor het hechten, middelgrote schaar, middellange en puntig pincet, en ten minste twee 1 mm tandheelkundige boren. Houd instrumenten schoon tijdens de procedure met 70% EtOH, ontsmettingsmiddel, of een kraal sterilisator. </li><li> Verkrijgen isofluraan, pijnstillende, oogzalf / smeermiddel, antibiotische zalf, zoutoplossing, 30% waterstofperoxide (H 2 O 2), antiseptisch en botwas (indien gewenst) eenveterinaire of medische voorziening. Bereid steriele Dih 2 O en 70% EtOH. Disposables zoals gaasjes, steriele dressings, hechtingen, ethanol wattenstaafjes, wattenstaafje wattenstaafjes, steriele chirurgische handschoenen, chirurgische mesjes en meer worden gespecificeerd in de lijst met materialen. Een fijne punt permanente marker voor het markeren van de schedel moet worden ontsmet en toegewijd voor chirurgisch gebruik. </li></ol> 3 Bereid Cellen voor Injectie <ol><li> In de hier getoonde experimenten, selecteer een onsterfelijk mens GBM cellijn. Bepaal het aantal cellen (2 x 10 5) en het volume suspensie te spuiten (3 ui) empirisch; informatie kan variëren met het type cel. Gebruik een volume van ten minste 50 pl nauwkeurige meting, mengen en injectie vergemakkelijken. </li><li> Trypsinize cellen en resuspendeer in media of PBS. Voer de volgende stappen vlak voor celinjectie: <ol><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen door aspiratie en spoelen met 10 ml PBS per 100 mm plaat; verwijderen PBS. </li><li> Advertentied 1 ml trypsine elke 100 mm plaat en incubeer bij kamertemperatuur net lang genoeg om een ​​enkele celsuspensie werd verkregen. </li><li> Stop trypsinewerking met 5 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) per 100 mm plaat. </li><li> Pellet cellen door centrifugatie bij 450 xg en resuspendeer in ~ 5 ml serumvrij DMEM (DMEM-SF) per 100 mm plaat. </li><li> Telling levensvatbare cellen met behulp van een hemacytometer of een geautomatiseerde celteller. </li><li> Stel de levende celdichtheid 2 x 10 5 cellen / 3 ui (of proefondervindelijk bepaald) door pelletiseren de cellen en hersuspenderen in SF-DMEM. </li></ol></li><li> Houd cellen gekoeld op ijs of een chill pack (niet mogelijk cellen te bevriezen). Meng voorzichtig met de vinger te vegen. </li></ol> 4 Verdoven en Bereid Muis voor Heelkunde <ol><li> Induceren anesthesie met behulp van ~ 5% isofluraan (zuurstoftoevoer ~ 2 L / min) of zoals voorgeschreven door de dierenarts. Inductie moet nemen 2 tot 3 minuten. Handhaaf de muis op een adequate dieptevan anesthesie met ~ 3% isofluraan. <ol><li> Controleer de diepte van de anesthesie door teen knijpen, stel isofluraan indien geïndiceerd en doorgaan met ademhalen en teen knijpen respons tijdens de gehele procedure te volgen. Bedek muis met gaasjes voor de warmte en de monitor muis regelmatig gedurende de procedure, die 45 min kan duren tot 1 uur, afhankelijk van de snelheid van de injectie. </li></ol></li><li> Plaats de muis in stereotaxisch frame door het gehemelte bar voorzichtig glijden over de tong en in de mond. Haak de voorste snijtanden in de tand gat. Gebruik oor bars om het hoofd te stabiliseren, met het oor-to-eye oppervlak zo dicht horizontaal mogelijk. Niet bars kracht in de gehoorgang. Het is cruciaal om goed te positioneren het hoofd: check side-to-side en op-en-neer gaande beweging voorzichtig met de vingertoppen. Gebruik de instelbare bedieningselementen van de stereotaxisch eenheid optimaliseren fit. </li><li> Smeer de ogen met oogzalf. Het reinigen van de huid tussen de oren en ogen tweemaal met afwisselende toepassingen van een povidon-jodiume antiseptische en 70% EtOH. </li><li> Injecteren gekozen pijnstillende subcutaan (SQ) in de flank (of zoals voorgeschreven). </li></ol> 5 Voer Injectie <ol><li> Bepaal de injectieplaats. De injectieplaats kan variëren met de grootte en de stam van de muis en het type cel. Cellen geïnjecteerd te dicht bij de ventrikels kunnen leiden tot cranio-spinale verspreiding van ziekten. Cellen geïnjecteerd te ondiep kan groeien door de naald spoor. Opmerking: In de hier getoonde experimenten werd het doelwit gedefinieerd als het frontale gebied van de cerebrale cortex een plaats 2,5 mm lateraal (rechts), 1.5 mm anterior en 3,5 mm ventraal ten opzichte van de fontanel werd gekozen (figuur 1), produceert een middenhersenen tumor in muizen van 20 tot 30 g. </li><li> Voeg een kleine incisie (~ 8 mm lang) met behulp van steriele techniek door de huid van het hoofd naar de bregma en de injectieplaats bloot. Een diagonaal gesneden, vanaf een punt tussen de middellijn as en het rechteroog naar het rechteroor ( <strong&gt; Figuur 2) biedt toegang tot zowel de bregma en de injectieplaats. </li><li> Trek de huid en gebruik een steriel wattenstaafje om het oppervlak van de schedel drogen. Dep het bot met een bevochtigd met H 2 O 2 tot bregma visualiseren. De H 2 O 2 zal zuurstofbellen produceren, waardoor er dunne witte lijnen van schuim langs de coronale en sagittale hechtingen, die elkaar onder bregma. </li><li> Kleur een lege injectiespuit met naald op de micropomp en manoeuvreren de punt van de naald direct boven de bregma; set coördineert op de uitlijning console tot 0,0 mm lateraal, 0.0 mm voor / achter, en 0.0 mm ventrale / dorsale. </li><li> Breng de naald tot 2,5 mm lateraal (rechts) en 1,5 mm anterieur ten opzichte van bregma (of gewenste locatie) met de bedieningsknoppen op het stereotaxische apparaat. Til de injectiespuit in een licht en markeer de exacte locatie op de schedel met een speciale viltstift. Indien het buitenoppervlak van de schedel niet horizontaal te bregma met (i.e., de dorsale / ventrale coördineren niet langer nul staat), reset de ventrale / dorsale lezen op 0,0 om ervoor te zorgen dat de diepte van de injectie niet wordt verschoven. </li><li> Boor een gaatje in de schedel met een handbediende boormachine uitgerust met een steriele tandheelkundige tip op de juiste plaats voorzien van de pen in stap 5.5. Houd de boor in een hoek aan de schedel en heel zachtjes aanraken van de tip tot op het bot. Herhalen als nodig is. Boren bijna maar niet geheel door het bot, waardoor de naald daadwerkelijk dringen deze laag van de schedel, bepaalt het schoonste injectie. </li><li> Verwijder het bot stof met een wattenstaafje dat in PBS of zoutoplossing. Zet de spuit op de pomp en laat de naald recht naar beneden naar de braam gat naar de locatie te bevestigen. Als het boorgat niet in het midden met de naald, gebruik maken van de boor voor een vergroting van de opening. </li><li> Meng de celsuspensie en trekken de cellen in de spuit met behulp van de pomp controller. Vermijd bubbels en bosjes en veeg de naald with een alcoholdoekje om contaminerende cellen op het buitenoppervlak te verwijderen. Als de spuit / naald verstopt is of bevroren, te verwijderen en snel schoon met steriel water en 70% EtOH. </li><li> Zet de naald omlaag tot het niveau van de schedel oppervlak (0,0 mm ventraal / dorsaal). Dan langzaam (in ongeveer 1 min) lager de naald prikken door de volledige dikte van de schedel en de hersenen doordringen tot een diepte van 4 mm ventrall. Trek de naald langzaam tot 3,5 mm ventraal. Als de muis kop stevig vastgehouden in de stereotaxische apparaat, zou er bijna geen beweging van de schedel zijn. </li><li> Controleer of de juiste parameters in de pomp controller worden ingevoerd (paragraaf 2.2) en druk op &quot;RUN / STOP&quot; (of zoals voorgeschreven door de handleiding van het product) om cellen autoinject. Bewaken van de muis en stel isofluraan indien geïndiceerd. Let op de spuit en ervoor zorgen dat de zuiger beweegt zich in het vat. Bevroren of verstopte beweging kan resulteren in een gebogen / gebroken zuiger. </li><li> Wacht 1 tot 2 minuten met de naald in de bregen, dan heel langzaam (gedurende 3 tot 4 min) terugtrekken naald uit weefsel. Totale tijd om de naald te verwijderen na de injectie is voltooid is 5 minuten. Gebruik een wattenstaafje om het gebied rond het boorgat vlek; Laat de randen van de huid open om het bot drogen. </li><li> Haal de spuit uit de pomp en snel spoelen 3x met steriele H 2 O, 3x met 70% EtOH, en 3x met steriele H 2 O (of zoals voorgeschreven door maker). Veeg naald met EtOH en zet apart. </li><li> Toepassen steriele botwas (overeenkomend met 1 of 2 ui) aan het boorgat en gebruik het houten uiteinde van een steriel wattenstaafje om de was stampen op en in het bot. Als het oppervlak voldoende gedroogd moet blijven. </li><li> Verspreid steriel laken over de muis en het omliggende werkgebied en hechtdraad de incisie; drie steken moet voldoende zijn. Alternatief kan chirurgische kleefmiddel worden gebruikt. Breng een actueel antibioticum. </li><li> Verminder isofluraan tot 0% en verwijder de muis uit de stereotaxisch eenheid, zijnde careful om tanden te beschermen. Controleer de oren, mond en tong. </li><li> Bewaken van de muis volgt de injectie. Plaats muis op een warmte-pad 5 tot 10 min; vervolgens over te dragen aan de kooi (op warmte-pad) en observeren totdat de muis wakker en is ambulant. Laat de muis onbeheerd achter, totdat het genoeg weer bij bewustzijn is om borstbeen recumbence behouden. Laat de muis niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot ze volledig hersteld. Overweeg het gebruik van extra pijnstillende als tekenen van pijn zijn opgevallen. </li></ol> 6 Finish en Monitor Recovery &amp; Tumor Development <ol><li> Reinig alle instrumenten en apparatuur met 70% EtOH, een kraal sterilisator of ontsmettingsmiddel tussen muizen. </li><li> Controleer de geïnjecteerde muizen gedurende twee dagen na de procedure op tekenen van pijn, infectie of andere complicaties. Injecteren pijnstillende 24 en 48 uur (of zoals aangegeven) na de procedure. Verwijder hechtingen 7 tot 10 dagen, indien nodig. </li><li> Evalueer de muizen voor de klinische symptomen van de ziekte, paralysis, verminderde activiteit, gewichtsverlies, toevallen of algemene ziekte. </li><li> Controleer de tumorontwikkeling door de geschikte methode [magnetic resonance imaging (MRI), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc.]. </li></ol>

<ol><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+accurately+inject+tumor+cells+into+the+caudate%2Fputamen+nuclei+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tokai+journal+of+experimental+and+clinical+medicine%22%5BJournal%5D)">A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain.</a> The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).</li>
<li>Brooks, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+and+efficient+murine+CNS+gene+delivery+using+a+microprocessor-controlled+injector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector.</a> Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).</li>
<li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).</li>
<li>Giannini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+tumor+EGFR+and+PDGFRA+gene+amplifications+retained+in+an+invasive+intracranial+xenograft+model+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme.</a> Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+gene+overexpression+retained+in+an+invasive+xenograft+model+by+solid+orthotopic+transplantation+of+human+glioblastoma+multiforme+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+investigation%22%5BJournal%5D)">EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice.</a> Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).</li>
<li>Carty, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+AAV+expressing+NEP+but+not+IDE+reduces+amyloid+pathology+in+APP%2BPS1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+ONE%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice.</a> PLos ONE. 8, e59626(2013).</li>
<li>Thaci, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+study+of+neural+stem+cell-based+cell+carrier+for+oncolytic+virotherapy%3A+targeted+delivery+of+the+therapeutic+payload+in+an+orthotopic+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model.</a> Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+orthotopic+glioma+xenografts+recapitulate+infiltrative+growth+and+isocitrate+dehydrogenase+I+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation.</a> J. Vis. Exp. (83), (2014).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>Iwami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+intracranial+injection+via+the+postglenoid+foramen+for+brain+tumor+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models.</a> Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Orthotopische muismodellen van menselijke hersenen kanker kan een uitstekend hulpmiddel voor het beoordelen van de effectiviteit van klinische therapieën te zijn, maar zorg moeten worden genomen om de plaatsing van de cellen in het hersenweefsel te optimaliseren. Studies hebben aangetoond dat overmatige hoeveelheid volumes suboptimale injectietechniek en haastige injectiesnelheden kan leiden tot lekkages en de verschijning van tumorcellen in ongewenste plaatsen (ventrikels, ruggenmerg, extradurale gebieden, etc.)</e...

In vitro studies van hersentumor cellen onschatbare waarde voor het ontleden van de moleculaire mechanismen die groei, overleving, migratie en invasie van kankercellen; gekweekte cel experimenten kunnen definiëren signaalwegen, wijzen op een mogelijke therapeutische doelwitten en karakteriseren cellulaire respons op de behandeling met geneesmiddelen. Maar in vitro systemen zijn veel te simplistisch om organismal reactie op geneesmiddelen te voorspellen; ze missen de fysiologische reacties, immuunreacties, cel micro-omgeving, en de algehele heterogeniteit van levende dier-systemen. Genetisch gemanipuleerde modellen kunnen van onschatbare waarde, wanneer deze beschikbaar zijn, maar moleculaire verschillen tussen soorten en muizen cellen kunnen gebeurtenissen in de menselijke processen niet recapituleren, wat resulteert in aanzienlijke verschillen bij het ​​vergelijken van diermodellen om de klinische waarnemingen 1. Muis xenograft modellen met subcutane (SQ) injectie van menselijke hersenen tumorcellijnen onder de huid van de flank zijn eenvoudig uit te voerenen meten; ze kunnen worden gebruikt om de effecten van genetische modificatie en toediening / aflevering, metabolisme en toxiciteit pakken. Belangrijke nadelen beperken echter de bruikbaarheid van SQ modellen. De micro niet recapituleren die van een natuurlijk voorkomende hersentumor: de interacties van verschillende celtypes en weefsels; de plaatselijke vaatstelsel, en vele andere factoren uniek aan de hersenen kan niet worden gerepliceerd. Om nauwkeuriger reproduceren unieke milieu van een natuurlijk voorkomend hersentumor en test de effecten van farmaceutische interventie, zou een muis orthotopic model worden gebruikt. Verder kan orthotope technieken worden gebruikt als onderdeel van een genetisch gemanipuleerde benadering waarin humane primaire niet-kankercellen (gedifferentieerde of progenitor) genetisch gemodificeerd en geïnjecteerd in de desbetreffende plaats van een muis, met of zonder menselijke stroma cellen, resulterend in tumorigenese vergelijkbaar met dat bij de mens 1. Dit artikel beschrijfteen methodologie om hersentumoren nauwkeurig en reproduceerbaar te creëren in muizen. Met deze techniek kan de gebruiker nauwkeurig injecteren van een kleine hoeveelheid van gesuspendeerde cellen in een opgegeven locatie van de fronto-parieto-temporale gebied van de muis hersenschors. Mouse mortaliteit is zeer laag; in onze handen, zijn er geen muizen stierven van chirurgische complicaties na 185 procedures. Kenmerken van het resulterende tumor te vergelijken met die van typische klinische tumoren; bijvoorbeeld: snelheid van groei, graad van necrose, invasiediepte, heterogeniteit van celtype aanwezigheid van mitotische cellen merkers van proliferatie en apoptose, etc. Cellijnen of gescheiden menselijk weefsel of tumor samples dan geëvalueerd worden op basis van hun vermogen simuleren feitelijke klinische presentatie. Pharmaceuticals, geselecteerd op basis van hun prestaties in celkweek, kunnen worden getest in de context van een functionerende stofwisseling, bloedsomloop en bloed-hersenbarrière zoals die per dier belast witha tumor, alle in een relevante architecturale context. Bovendien kan de gekozen injectie cellen genetisch gemodificeerd worden om het effect van specifieke knockdowns, deleties onderzoeken knock-ins, mutaties, etc. tumorgroei en overleving. Een aantal publicaties documenteren tumoren studies met verschillende intracraniale technieken. Yamada et al. Heeft een gedetailleerde studie van de injectie van kleurstof en U87 cellen en vond dat volume en injectiesnelheid minimaliseren produceerde de beste tumor 2. . Brooks et al gevonden superieure reproduceerbaarheid en efficiëntie met behulp van een microprocessor gestuurde injector in plaats van een handmatige methode om virale vectoren te leveren; hun conclusies ten aanzien van optimale injectie parameters zijn van toepassing op mobiele aflevering 3. Shankavaram et al. Aangetoond dat glioblastoma multiforme (GBM) cellijnen geïnjecteerd orthotopically (met een handmatige methode) in de hersenen recapituleerde het genexpressieprofiel van het clinical tumoren beter dan ofwel in vitro of SQ xenotransplantaten, die het gebruik van intracraniale modellen voor preklinische studies 4. Giannini et al. Geïnjecteerde cellen uit humane biopten die in de flanken van naakt muizen hadden geleden door seriële passages in de hersenen van aanvullende muizen en aangetoond dat deze benadering bewaarde patiënt tumor gen veranderingen in het model 5. Vergelijkbare resultaten werden gerapporteerd door Yi c.s. 6. Met behulp van een stereotaxisch setup en nauwkeurig gedefinieerde injectieplaats, en een langzame en gestage injectie snelheid, verkregen zij reproduceerbaar hersentumoren met consistente groei en een hoog (100%) aanslaan tarief. De geldigheid van deze techniek is dan ook goed ingeburgerd; een literatuuronderzoek blijkt dat de toepassingen van deze techniek zijn uitgebreid. Carty et al. Gebruikt intracraniële injecties om virale vectoren die therapeutische genen met succes te leveren in de frontale cortex van transgenic model van de ziekte van Alzheimer 7. Thaci et al. De toepassing beschreven van intracraniale injecties therapeutische oncolytische adenovirus leveren een neurale stamcel gebaseerde drager in naakt muizen reeds uitvoert orthotopically ingespoten GBM tumoren 8. Duidelijk, intracraniële injecties zijn een veelzijdige en effectieve tool voor preklinisch onderzoek. Eerdere publicaties in The Journal of Gevisualiseerd Experimenten beschrijven fundamentele benaderingen 9-11, maar we nemen het concept van intracraniële tumor injectie en orthotopic modelleren naar een hoger niveau van precisie met behulp van eenvoudig te master-technologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ear Bars</td><td>Kopf</td><td>Medel 922</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Illuminator</td><td>Fisher</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 microprocessor</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Variable speed hand-held rotary drill</td><td>Dremel</td><td>Model 300</td><td></td></tr><tr><td>Dental drill bit, 1.0 mm</td><td>Spoelting</td><td>514554</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td></td><td></td><td>voor muizen</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer system</td><td></td><td></td><td>voor muizen</td></tr><tr><td>Medical tubing and connectors</td><td></td><td></td><td>om isoflurane vaporizer met stereotaxische frame te verbinden</td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>Precision 25 &mu;l microsyringe</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7636-01</td><td>Model 702, zonder naald</td></tr><tr><td>Microsyringe needles, 26s G</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7804-04</td><td>RN, 25 mm puntstijl 2</td></tr><tr><td>Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium-sized standard scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard serrated forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serrated hemostats (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine-tipped forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Supplies</td></tr><tr><td>Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blades #10, stainless (Feather)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)&nbsp;</td><td>VetOne&nbsp;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>Item #502017. Vloeibaar inhalatieanestheticum. federale wet beperkt dit medicijn tot gebruik door of op bevel van een erkende dierenarts.</td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>verdunnen in zoutoplossing</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment (artificial tears)</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)</td><td>Betadine</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, 30%</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>H325-100</td><td>voor het visualiseren van schedellandmerken</td></tr><tr><td>Sterile saline</td><td>VetOne&nbsp;&nbsp;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>voor het verdunnen van oplossingen, weefsel schoonmaken</td></tr><tr><td>Bone wax</td><td>WPI</td><td>Item #501771</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical gloves</td><td>McKesson</td><td>(om te passen)</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22028556</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol prep pads (medium)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cotton-tipped applicators</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>voor cellen</td></tr><tr><td>Individually wrapped sterile dispo pipettes</td><td>Fisher</td><td>BD 357575</td><td>voor naaldreningsoplossingen</td></tr><tr><td>BD insulin syringes with needles&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>voor pijnstiller</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>voor schoonmaken</td></tr><tr><td>Sterile diH2O</td><td></td><td></td><td>voor schoonmaken</td></tr><tr><td>Microfuge tubes for cleaning solutions</td><td></td><td></td><td>voor naaldreningsoplossingen</td></tr><tr><td>Felt tip pen (dedicated)</td><td></td><td></td><td>voor het markeren van de schedel</td></tr></tbody></table>

creëren anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare intracranial xenograften van human hersentumoren

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopische tumor modellen zijn op dit moment de beste manier om de studie van de eigenschappen van een type tumor, met en zonder interventie, in de context van een levend dier - vooral op locaties met unieke fysiologische en architectonische kwaliteiten, zoals de hersenen In vitro en buitenbaarmoederlijke modellen niet kunnen. goed voor functies zoals het vaatstelsel, bloed-hersenbarrière, het metabolisme, drug delivery en toxiciteit, en een tal van andere relevante factoren. Orthotopische modellen hebben hun beperkingen ook, maar met de juiste techniek tumorcellen plaats nauwkeurig worden geënt in weefsel dat het meest bootst omstandigheden in het menselijk brein. Door het gebruik van methoden die precies afgemeten hoeveelheden te leveren aan nauwkeurig gedefinieerde locaties in een gelijkmatige en druk, muismodellen van menselijke hersentumoren met voorspelbare groei kan reproduceerbaar worden gemaakt en zijn geschikt voor een betrouwbare analyse van de verschillende interventies. De hier beschreven protocol is gericht op de technische de details van het ontwerpen van en de voorbereiding op een intracraniële injectie, het uitvoeren van de operatie, en het waarborgen van een succesvolle en reproduceerbare tumorgroei en biedt aanknopingspunten voor een verscheidenheid van aandoeningen die kunnen worden aangepast voor een waaier van verschillende hersentumor modellen.

Betrouwbare intracraniële xenotransplantaten kunnen worden gemaakt met deze techniek beschreven. Het identificeren van de kritische structuren van de schedel muis (Figuur 1) zal voor de erkenning van de bregma en begeleiden de onderzoeker om een nauwkeurige en reproduceerbare injectie locatie. In deze studies de ouderlijn U251, U251-cellen getransfecteerd met luciferase (U251-Luc) of U87 geïmmortaliseerde humane GBM weefselkweek cellen werden 4 tot 6 pl-SF DMEM gesuspendeerd en geïnjecteerd 2,5 mm later...

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Het algemene doel van deze procedure is om een consistent en reproduceerbaar menselijk hersentumormodel te creëren dat kan worden gebruikt voor het nauwkeurig testen en vergelijken van nieuwe therapeutische strategieën. Dit wordt bereikt door het dier voor te bereiden op de operatie en de juiste plaats voor injectie te lokaliseren. Eenmaal gelokaliseerd, wordt er een gat in de schedel geboord en wordt een spuit op de juiste diepte neergelaten.Om tumorgroei te verkrijgen, worden cellen vervolgens op een langzame, gecontroleerde manier geïnjecteerd, gevolgd door een vertraagde en geleidelijke terugtrekking van de naald. Uiteindelijk kan een consistent muismodel met tumorgroei worden ontwikkeld die histopathologisch vergelijkbaar is met de menselijke toestand en groeisnelheden kunnen worden gemeten door Lucci gebaseerd in vivo beeldvorming. De precisie van deze techniek is essentieel voor het begrijpen van nieuwe therapeutische strategieën voor menselijke hersentumoren.Variabele lokalisatie van tumorinjectie kan leiden tot veranderingen in tumorgroei die te wijten zijn aan micro-omgeving, medicijnafgifte of andere dingen die sterk variëren tussen verschillende delen van de hersenen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat de stappen die betrekking hebben op de positie van de muis en de lokalisatie van de injectieplaats driedimensionale manipulaties vereisen, die niet gemakkelijk in schriftelijke of grafische vorm kunnen worden beschreven. Om te beginnen een muis stereotaxisch frame en alle andere benodigde apparatuur voor de operatie schoonmaken en ontsmetten.Gebruik instellingen geoptimaliseerd voor het gekozen programmamodel, de injectieparameters en andere variabelen voor de werking van de spuitpomp. Schik vervolgens autoclave chirurgische gereedschappen in het werkgebied inclusief ten minste twee 1,0 millimeter tandartsboorbeetjes voor seriële procedures. Desinfect chirurgische instrumenten met 70% ethanol, gevolgd door 30 seconden in een parelsterilisator tussen elk dier of zoals aangeraden door uw IACUC-protocollen.Verzamel tenslotte alle medische benodigdheden en wegwerpmaterialen die nodig zijn. Een fijne punt, permanente marker voor het markeren van de schedel moet worden ontsmet en bestemd voor chirurgisch gebruik. Na trypsine resus, suspendeer de cellen in PBS en pellet door centrifugatie Resus. Suspendeer de cellen in ongeveer vijf milliliter serumvrije dmem per 100 millimeter plaat.Tel vervolgens de levensvatbare cellen door gebruik te maken van een hemo, cytometer of een geautomatiseerde celteller. Pas na het tellen, pas de levensvatbare celdichtheid aan door de cellen te pelleten en resus te suspenderen in een SF dmm. Houd de cellen gekoeld op ijs of een koelpak, maar laat de cellen niet bevriezen.Meng voorzichtig door middel van vingerflikkeren induceer dier narcose en bevestig dat het dier voldoende is gesedateerd door te controleren op schrijfreflex of gebrek aan activiteit. Eenmaal verdoofd, bedek de muis met gaasjes voor warmte en bewaak het dier regelmatig gedurende de procedure. Plaats vervolgens de muis in een stereotaxisch frame.Gebruik de palletbar en oorbars, probeer de oor-tot-oogoppervlak zo horizontaal mogelijk te houden. Smeer ten slotte de ogen in met oogzalf en reinig de huid tussen de oren en ogen twee keer met afwisselende toepassingen van een povidonjod antisepticum en 70% ethanol. Na injectie van een pijnstiller onderhuids, bevestig dat het dier volledig verdoofd is door de teenprikreflex te controleren.Onmiddellijk voorafgaand aan de huidsnede, maak een kleine snede om de BMA en de plaats van een injectie bloot te leggen. Een diagonale snede van een punt tussen de middenlijnas en het rechteroog richting het rechteroor stelt de as in van zowel de bgma als de injectieplaats. Trek de huid terug en gebruik een steriele wattenstaaf om het oppervlak van de schedel te drogen.De botten afdekken met een andere staaf, bevochtigd met waterstofperoxide. Om de bgma te visualiseren, vergrendel een lege spuit met naald in de micropomp en manoeuvreer de punt direct boven de bgma. Nullen de coördinaten op de uitlijningsconsole.Verplaats de naald naar 2,5 millimeter lateraal en 1,5 millimeter anterieur met betrekking.Torema. Gebruik de bedieningsknoppen op de stereotaxische eenheid om de spuit iets omhoog te brengen en markeer de exacte locatie op de schedel met een gewijde viltstift.Pen. Als het buitenoppervlak van de schedel niet langer vlak is met bgma in het dorsale vlak, reset de dorsale ventrale lezing naar nul om ervoor te zorgen dat de diepte van de injectie correct is.Boor een klein gaatje in de schedel met een handmatige roterende boor voorzien van een steriele tandartstip. Houd de boor onder een hoek tegen de schedel en raak heel voorzichtig met de punt het bot aan. Stop voordat u volledig door het bot boor.De schoonste injectie met de minste schade wordt verkregen. Wanneer de schedel wordt doorboord met de spuitnaald tijdens celinjectie, verwijder botgruis met een wattenstaafje bevochtigd in PBS of zoutoplossing. Breng de spuit terug naar de pomp en laat de naald recht naar beneden zakken naar het gaatje.Om de locatie te bevestigen, meng voorzichtig de celsuspensie en trek de cellen in de spuit. Gebruik de pompcontroller, vermijd bellen en klonten en veeg de naald af met een alcoholdoekje. Om besmettende cellen op het buitenoppervlak te verwijderen, laat de naald zakken tot het niveau van het schedeloppervlak.Laat de naald dan langzaam zakken. Boor de volledige dikte van de schedel en penetreer de hersenen tot een diepte van vier millimeter ventraal gedurende één minuut, voordat u de naald langzaam terugtrekt tot 3,5 millimeter ventraal, bevestig dat de juiste parameters zijn ingevoerd in de pompcontroller en druk op run.Stop. Om de cellen automatisch te injecteren, bekijk de spuit en zorg ervoor dat de zuiger in de vat beweegt.Laat de naald één tot twee minuten op zijn plaats voordat u de naald heel langzaam uit het weefsel trekt. De naald moet gedurende vijf minuten worden verwijderd. Gebruik een wattenstaafje om het gebied rond het gaatje te deppen en laat de randen van de huid open om het bot te laten drogen.</p

creating-anatomically-accurate-reproducible-intracranial-xenografts

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Met het oog op nieuwe therapeutische paradigma's voor de behandeling van gliomen te evalueren, fysiologisch relevante modellen zijn essentieel. We maken gebruik van een implanteerbare gids schroef procedure voor de oprichting van intracraniale xenotransplantaatmodellen dat is sneller en veiliger dan stereotactische benaderingen.

A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.

Intranasale Levering van Therapeutische Stamcellen aan Glioblastoma in een Muis Model

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer hoe je anatomisch nauwkeurige intracraniale xenograften van humane hersentumoren in muizen creëert. Deze chirurgische methode maakt reproduceerbare tumorontwikkeling mogelijk voor het testen van nieuwe therapeutische strategieën.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

Meer video's verkennen