Patch clamp-registratie is een uiterst nuttige techniek voor het onderzoeken van de biofysische eigenschappen van de ionkanalen die neuronale activering regelen.
De procedure omvat het aandrukken van een glazen micropipet tegen een cel om een kleine “patch” van het membraan te isoleren dat een of meer ionkanalen bevat.
De experimentele opstelling stelt wetenschappers verder in staat om de elektrische omgeving van het gepatchte gebied te “klemmen” door nauwkeurig de spanning over het celmembraan te regelen, wat, afhankelijk van de aanwezige ionkanalen, van invloed is op de stroom van ionen door het membraan en een gedetailleerd onderzoek van deze kanalen mogelijk maakt.
Deze video presenteert een overzicht van de principes achter de patch clamp-techniek, een beschrijving van de stappen die nodig zijn om een experiment uit te voeren en ten slotte enkele toepassingen van deze methode.
Laten we eerst de principes achter patch clamp-registratie bekijken.
Het aantal positief en negatief geladen ionen in een neuron verschilt van het aantal dat aan de buitenkant wordt aangetroffen.
Deze onbalans produceert een spanningsverschil, of membraanpotentiaal, van ongeveer -70 mV, wat betekent dat de binnenkant negatiever is dan de buitenkant.
Ionkanalen helpen de gradiënt te handhaven door de beweging van ionen over het celmembraan te regelen, wat in wezen elektrische stromen zijn.
Met behulp van de patch clamp-techniek stellen wetenschappers vragen over de aard van het potentieel en de stroom.
De patch clamp-opstelling omvat een glazen micropipet, die zowel een ionische oplossing als een gechloreerd zilverelektrode bevat voor het meten van spanningen en stromen.
De punt van de micropipet heeft een gepolijste opening van één micron die een klein membraangebied omsluit.
Om achtergrondruis van ionen in de badoplossing te elimineren, wordt een hoge-weerstandsafdichting gevormd tussen de pipet en het membraanpatch. Omdat de weerstand van de afdichting in de gigaohm-bereik is, staat deze bekend als een gigaohm-afdichting.
De elektrode in de pipet is verbonden met een versterker die stroomen en spanningen kan versterken die het resultaat zijn van de beweging van ionen door kanalen in het plasmamembraan.
Met de versterker kunnen wetenschappers de membraanpotentiaal kunstmatig op specifieke spanningen instellen.
De versterker reguleert hoeveel stroom er door de zilverelektrode moet worden toegevoegd om de spanning constant te houden.
Aangezien verschillende spanningsafhankelijke ionkanalen bij specifieke spanningen opengaan, worden openingsgebeurtenissen weergegeven door de variaties in de profielen van de gemeten¬ stromen.
Alternatief kunnen wetenschappers een specifieke stroom door de elektrode forceren en de resulterende veranderingen in potentiaal registreren. In deze “stroomklem” configuratie kunnen actiepotentialen worden geregistreerd.
Laten we nu de vijf belangrijkste soorten patch clamp-configuraties bekijken.
Eerst is de cell-attached configuratie waarbij de micropipet eenvoudigweg wordt afgesloten op het membraan van een intacte cel.
Ten tweede is de whole-cell configuratie waarbij het membraan binnen de micropipet wordt doorboord om toegang te bieden tot het binnenste van de cel.
Ten derde is de perforated patch-configuratie. Hier worden chemicaliën zoals antibiotica aan de micropipet toegevoegd om kleine gaatjes in het membraan te maken die toegang bieden tot het cytosol.
De vierde configuratie is de inside-out patch. Hierbij vormt de micropipet eerst een afdichting met de cel, wordt vervolgens snel teruggetrokken, waardoor een stukje van het membraan wordt afgescheurd en de binnenkant wordt blootgesteld aan de badoplossing.
Dit maakt het mogelijk om de cytoplasmatische kant van de kanalen bloot te stellen aan verschillende chemicaliën die in het bad worden aangebracht.
Ten slotte begint de outside-out patch, vergelijkbaar met de inside-out, als een whole-cell configuratie. De micropipet wordt langzaam teruggetrokken totdat een stukje membraan een convexe afdichting over de punt vormt.
In deze opstelling kan de extracellulaire kant van het kanaal worden blootgesteld aan experimentele behandelingen.
Nu we de principes hebben besproken, laten we de stappen doornemen die nodig zijn om een patch clamp-registratie uit te voeren.
Begin door een borosilicaatglasbuis in micropipetten te trekken met behulp van een pipettrekker.
Slijp vervolgens de punt om de juiste diameter en weerstand te verkrijgen.
Na het polijsten vult u de micropipet met een ionische oplossing en klapt u zachtjes om eventuele luchtbellen te verwijderen.
Schuif vervolgens de micropipet over de elektrode die aan een houder is bevestigd.
Eenmaal bevestigd, gebruikt u een spuit om positieve druk op de pipet toe te passen, wat voorkomt dat andere oplossingen de punt binnendringen.
Plaats nu uw cellen of weefsel van belang op de microscooptafel en beweeg de micropipet naar een cel toe.
Met de versterker die testspanningspulsen genereert, registreert u de weerstand, die zal toenemen zodra de punt de cel raakt.
Om de gigaohm-afdichting te vormen, schakelt u voorzichtig over van positieve naar negatieve druk met behulp van de spuit. De vorming van de afdichting zal resulteren in een snelle toename van de weerstand tot meer dan 1 gigaohm.
Nu er een cell-attached configuratie is vastgesteld, laten we overschakelen naar een whole-cell configuratie en een experiment doen!
Bedenk dat een whole-cell
Neuroncellenmembranen zijn bevolkt met ionkanalen die de beweging van lading in en uit de cel regelen en daardoor het vuren van neuronen reguleren. Ee…
Patch clamp-registratie is een uiterst nuttige techniek voor het onderzoeken van de biofysische eigenschappen van de ionkanalen die neuronale activering regelen.
De procedure omvat het aandrukken van een glazen micropipet tegen een cel om een kleine “patch” van het membraan te isoleren dat een of meer ionkanalen bevat.
De experimentele opstelling stelt wetenschappers verder in staat om de elektrische omgeving van het gepatchte gebied te “klemmen” door nauwkeurig de spanning over het celmembraan te regelen, wat, afhankelijk van de aanwezige ionkanalen, van invloed is op de stroom van ionen door het membraan en een gedetailleerd onderzoek van deze kanalen mogelijk maakt.
Deze video presenteert een overzicht van de principes achter de patch clamp-techniek, een beschrijving van de stappen die nodig zijn om een experiment uit te voeren en ten slotte enkele toepassingen van deze methode.
Laten we eerst de principes achter patch clamp-registratie bekijken.
Het aantal positief en negatief geladen ionen in een neuron verschilt van het aantal dat aan de buitenkant wordt aangetroffen.
Deze onbalans produceert een spanningsverschil, of membraanpotentiaal, van ongeveer -70 mV, wat betekent dat de binnenkant negatiever is dan de buitenkant.
Ionkanalen helpen de gradiënt te handhaven door de beweging van ionen over het celmembraan te regelen, wat in wezen elektrische stromen zijn.
Met behulp van de patch clamp-techniek stellen wetenschappers vragen over de aard van het potentieel en de stroom.
De patch clamp-opstelling omvat een glazen micropipet, die zowel een ionische oplossing als een gechloreerd zilverelektrode bevat voor het meten van spanningen en stromen.
De punt van de micropipet heeft een gepolijste opening van één micron die een klein membraangebied omsluit.
Om achtergrondruis van ionen in de badoplossing te elimineren, wordt een hoge-weerstandsafdichting gevormd tussen de pipet en het membraanpatch. Omdat de weerstand van de afdichting in de gigaohm-bereik is, staat deze bekend als een gigaohm-afdichting.
De elektrode in de pipet is verbonden met een versterker die stroomen en spanningen kan versterken die het resultaat zijn van de beweging van ionen door kanalen in het plasmamembraan.
Met de versterker kunnen wetenschappers de membraanpotentiaal kunstmatig op specifieke spanningen instellen.
De versterker reguleert hoeveel stroom er door de zilverelektrode moet worden toegevoegd om de spanning constant te houden.
Aangezien verschillende spanningsafhankelijke ionkanalen bij specifieke spanningen opengaan, worden openingsgebeurtenissen weergegeven door de variaties in de profielen van de gemeten¬ stromen.
Alternatief kunnen wetenschappers een specifieke stroom door de elektrode forceren en de resulterende veranderingen in potentiaal registreren. In deze “stroomklem” configuratie kunnen actiepotentialen worden geregistreerd.
Laten we nu de vijf belangrijkste soorten patch clamp-configuraties bekijken.
Eerst is de cell-attached configuratie waarbij de micropipet eenvoudigweg wordt afgesloten op het membraan van een intacte cel.
Ten tweede is de whole-cell configuratie waarbij het membraan binnen de micropipet wordt doorboord om toegang te bieden tot het binnenste van de cel.
Ten derde is de perforated patch-configuratie. Hier worden chemicaliën zoals antibiotica aan de micropipet toegevoegd om kleine gaatjes in het membraan te maken die toegang bieden tot het cytosol.
De vierde configuratie is de inside-out patch. Hierbij vormt de micropipet eerst een afdichting met de cel, wordt vervolgens snel teruggetrokken, waardoor een stukje van het membraan wordt afgescheurd en de binnenkant wordt blootgesteld aan de badoplossing.
Dit maakt het mogelijk om de cytoplasmatische kant van de kanalen bloot te stellen aan verschillende chemicaliën die in het bad worden aangebracht.
Ten slotte begint de outside-out patch, vergelijkbaar met de inside-out, als een whole-cell configuratie. De micropipet wordt langzaam teruggetrokken totdat een stukje membraan een convexe afdichting over de punt vormt.
In deze opstelling kan de extracellulaire kant van het kanaal worden blootgesteld aan experimentele behandelingen.
Nu we de principes hebben besproken, laten we de stappen doornemen die nodig zijn om een patch clamp-registratie uit te voeren.
Begin door een borosilicaatglasbuis in micropipetten te trekken met behulp van een pipettrekker.
Slijp vervolgens de punt om de juiste diameter en weerstand te verkrijgen.
Na het polijsten vult u de micropipet met een ionische oplossing en klapt u zachtjes om eventuele luchtbellen te verwijderen.
Schuif vervolgens de micropipet over de elektrode die aan een houder is bevestigd.
Eenmaal bevestigd, gebruikt u een spuit om positieve druk op de pipet toe te passen, wat voorkomt dat andere oplossingen de punt binnendringen.
Plaats nu uw cellen of weefsel van belang op de microscooptafel en beweeg de micropipet naar een cel toe.
Met de versterker die testspanningspulsen genereert, registreert u de weerstand, die zal toenemen zodra de punt de cel raakt.
Om de gigaohm-afdichting te vormen, schakelt u voorzichtig over van positieve naar negatieve druk met behulp van de spuit. De vorming van de afdichting zal resulteren in een snelle toename van de weerstand tot meer dan 1 gigaohm.
Nu er een cell-attached configuratie is vastgesteld, laten we overschakelen naar een whole-cell configuratie en een experiment doen!
Bedenk dat een whole-cell
Patch clamp-registratie is een uiterst nuttige techniek voor het onderzoeken van de biofysische eigenschappen van de ionkanalen die neuronale activering regelen.
De procedure omvat het aandrukken van een glazen micropipet tegen een cel om een kleine “patch” van het membraan te isoleren dat een of meer ionkanalen bevat.
De experimentele opstelling stelt wetenschappers verder in staat om de elektrische omgeving van het gepatchte gebied te “klemmen” door nauwkeurig de spanning over het celmembraan te regelen, wat, afhankelijk van de aanwezige ionkanalen, van invloed is op de stroom van ionen door het membraan en een gedetailleerd onderzoek van deze kanalen mogelijk maakt.
Deze video presenteert een overzicht van de principes achter de patch clamp-techniek, een beschrijving van de stappen die nodig zijn om een experiment uit te voeren en ten slotte enkele toepassingen van deze methode.
Laten we eerst de principes achter patch clamp-registratie bekijken.
Het aantal positief en negatief geladen ionen in een neuron verschilt van het aantal dat aan de buitenkant wordt aangetroffen.
Deze onbalans produceert een spanningsverschil, of membraanpotentiaal, van ongeveer -70 mV, wat betekent dat de binnenkant negatiever is dan de buitenkant.
Ionkanalen helpen de gradiënt te handhaven door de beweging van ionen over het celmembraan te regelen, wat in wezen elektrische stromen zijn.
Met behulp van de patch clamp-techniek stellen wetenschappers vragen over de aard van het potentieel en de stroom.
De patch clamp-opstelling omvat een glazen micropipet, die zowel een ionische oplossing als een gechloreerd zilverelektrode bevat voor het meten van spanningen en stromen.
De punt van de micropipet heeft een gepolijste opening van één micron die een klein membraangebied omsluit.
Om achtergrondruis van ionen in de badoplossing te elimineren, wordt een hoge-weerstandsafdichting gevormd tussen de pipet en het membraanpatch. Omdat de weerstand van de afdichting in de gigaohm-bereik is, staat deze bekend als een gigaohm-afdichting.
De elektrode in de pipet is verbonden met een versterker die stroomen en spanningen kan versterken die het resultaat zijn van de beweging van ionen door kanalen in het plasmamembraan.
Met de versterker kunnen wetenschappers de membraanpotentiaal kunstmatig op specifieke spanningen instellen.
De versterker reguleert hoeveel stroom er door de zilverelektrode moet worden toegevoegd om de spanning constant te houden.
Aangezien verschillende spanningsafhankelijke ionkanalen bij specifieke spanningen opengaan, worden openingsgebeurtenissen weergegeven door de variaties in de profielen van de gemeten¬ stromen.
Alternatief kunnen wetenschappers een specifieke stroom door de elektrode forceren en de resulterende veranderingen in potentiaal registreren. In deze “stroomklem” configuratie kunnen actiepotentialen worden geregistreerd.
Laten we nu de vijf belangrijkste soorten patch clamp-configuraties bekijken.
Eerst is de cell-attached configuratie waarbij de micropipet eenvoudigweg wordt afgesloten op het membraan van een intacte cel.
Ten tweede is de whole-cell configuratie waarbij het membraan binnen de micropipet wordt doorboord om toegang te bieden tot het binnenste van de cel.
Ten derde is de perforated patch-configuratie. Hier worden chemicaliën zoals antibiotica aan de micropipet toegevoegd om kleine gaatjes in het membraan te maken die toegang bieden tot het cytosol.
De vierde configuratie is de inside-out patch. Hierbij vormt de micropipet eerst een afdichting met de cel, wordt vervolgens snel teruggetrokken, waardoor een stukje van het membraan wordt afgescheurd en de binnenkant wordt blootgesteld aan de badoplossing.
Dit maakt het mogelijk om de cytoplasmatische kant van de kanalen bloot te stellen aan verschillende chemicaliën die in het bad worden aangebracht.
Ten slotte begint de outside-out patch, vergelijkbaar met de inside-out, als een whole-cell configuratie. De micropipet wordt langzaam teruggetrokken totdat een stukje membraan een convexe afdichting over de punt vormt.
In deze opstelling kan de extracellulaire kant van het kanaal worden blootgesteld aan experimentele behandelingen.
Nu we de principes hebben besproken, laten we de stappen doornemen die nodig zijn om een patch clamp-registratie uit te voeren.
Begin door een borosilicaatglasbuis in micropipetten te trekken met behulp van een pipettrekker.
Slijp vervolgens de punt om de juiste diameter en weerstand te verkrijgen.
Na het polijsten vult u de micropipet met een ionische oplossing en klapt u zachtjes om eventuele luchtbellen te verwijderen.
Schuif vervolgens de micropipet over de elektrode die aan een houder is bevestigd.
Eenmaal bevestigd, gebruikt u een spuit om positieve druk op de pipet toe te passen, wat voorkomt dat andere oplossingen de punt binnendringen.
Plaats nu uw cellen of weefsel van belang op de microscooptafel en beweeg de micropipet naar een cel toe.
Met de versterker die testspanningspulsen genereert, registreert u de weerstand, die zal toenemen zodra de punt de cel raakt.
Om de gigaohm-afdichting te vormen, schakelt u voorzichtig over van positieve naar negatieve druk met behulp van de spuit. De vorming van de afdichting zal resulteren in een snelle toename van de weerstand tot meer dan 1 gigaohm.
Nu er een cell-attached configuratie is vastgesteld, laten we overschakelen naar een whole-cell configuratie en een experiment doen!
Bedenk dat een whole-cell
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:04
Principles Behind Patch Clamping
3:20
Patch Clamp Configurations
4:43
Preparing Micropipettes and Forming a Seal
6:05
Whole-cell Patch Clamp Procedure
7:15
Applications
9:11
Summary
Videos from this collection: