Patchclamp-elektrofysiologie

Patchclamp-registratie is een uiterst nuttige techniek voor het onderzoeken van de biofysische eigenschappen van de ionkanalen die de neuronale activatie regelen.

De procedure houdt in dat een glazen micropipet tegen een cel wordt gedrukt om een klein "patch"-stukje membraan te isoleren dat één of meer ionkanalen bevat.

De experimentele opstelling stelt wetenschappers bovendien in staat om de elektrische omgeving van het gepatchte gebied te "clampen" door het voltage over het celmembraan nauwkeurig te beheersen, wat, afhankelijk van de aanwezige ionkanalen, de ionenstroom door het membraan beïnvloedt en een gedetailleerde studie van deze kanalen mogelijk maakt.

Deze video geeft een overzicht van de principes achter de patch clamp-techniek, een beschrijving van de stappen die nodig zijn om een experiment uit te voeren en tot slot enkele toepassingen van deze methode.

Laten we eerst de principes achter patch clamp-registratie doornemen.

Het aantal positief en negatief geladen ionen binnen een neuron verschilt van het aantal dat zich aan de buitenkant bevindt.

Deze onbalans veroorzaakt een spanningsverschil, of membraanpotentiaal, van ongeveer -70 mV, wat betekent dat de binnenkant negatiever is dan de buitenkant.

Ionkanalen helpen de gradiënt te handhaven door de beweging van ionen door het celmembraan te reguleren, wat in feite elektrische stromen zijn.

Met behulp van de patch clamp-techniek kunnen wetenschappers vragen beantwoorden over de aard van deze potentiaal en stroom.

De patch clamp-opstelling bevat een glazen micropipet, die zowel een ionische oplossing als een gezilverde chloride-elektrode bevat voor het meten van spanningen en stromen.

De tip van de micropipet heeft een gepolijste opening van één micron die een klein gebied van het membraan omsluit.

Om achtergrondruis van ionen in de badoplossing te elimineren, wordt een hoogohmse afsluiting gevormd tussen de pipet en het membraanfragment. Omdat de weerstand van deze afsluiting in de gigaohm-range ligt, staat dit bekend als een gigaohm-seal.

De elektrode in de pipet is verbonden met een versterker die stroom- en spanningsschommelingen kan versterken die het resultaat zijn van de beweging van ionen door kanalen in het plasmamembraan.

Met de versterker kunnen wetenschappers de membraanpotentiaal vastzetten of kunstmatig instellen op specifieke spanningen.

De versterker reguleert hoeveel stroom er via de zilverelektrode moet worden toegevoegd om de spanning constant te houden.

Aangezien verschillende spanningsafhankelijke ionkanalen openen bij specifieke spanningen, worden openingsgebeurtenissen weergegeven door variaties in de profielen van de gemeten¬ stromen.

Alternatief kunnen wetenschappers een specifieke stroom door de elektrode forceren en de resulterende veranderingen in de potentiaal registreren. In deze "current clamp"-configuratie kunnen actiepotentialen worden geregistreerd.

Laten we nu kijken naar de vijf belangrijkste typen patchclamp-configuraties.

Ten eerste is er de cell-attached configuratie, waarbij de micropipet simpelweg wordt afgesloten tegen het membraan van een intacte cel.

Ten tweede is er de whole-cell configuratie, waarbij het membraan binnen de micropipet wordt doorbroken om toegang te krijgen tot het binnenste van de cel.

Ten derde is er de perforated patch configuratie. Hierbij worden chemicaliën, zoals antibiotica, aan de micropipet toegevoegd om kleine gaatjes in het membraan te maken, waardoor er toegang tot het cytosol ontstaat.

De vierde configuratie is de inside-out patch. Om dit te bereiken, vormt de micropipet eerst een afsluiting met de cel en wordt deze vervolgens snel teruggetrokken, waardoor een stukje van het membraan wordt losgerukt en de binnenzijde wordt blootgesteld aan de badoplossing.

Hierdoor kan de cytoplasmatische zijde van de kanalen worden blootgesteld aan verschillende chemicaliën die aan het bad worden toegevoegd.

Ten slotte begint de outside-out patch, vergelijkbaar met de inside-out, als een whole-cell configuratie. De micropipet wordt langzaam teruggetrokken totdat een stukje membraan een convexe afsluiting over de punt vormt.

In deze opstelling kan de extracellulaire zijde van het kanaal worden blootgesteld aan experimentele behandelingen.

Nu we de principes hebben besproken, gaan we door naar de stappen die nodig zijn om een patchclamp-meting uit te voeren.

Begin met het uittrekken van een borosilicaatglazen buis tot micropipetten met behulp van een pipetuittrekker.

Polijst vervolgens de punt met een vlam om de juiste diameter en weerstand te verkrijgen.

Vul na het polijsten de micropipet met een ionische oplossing en tik voorzichtig tegen de pipet om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Schuif de micropipet vervolgens over de elektrode die aan een houder is bevestigd.

Gebruik na bevestiging een spuit om positieve druk op de pipet uit te oefenen, wat voorkomt dat andere oplossingen in de punt terechtkomen.

Plaats nu de cellen of het weefsel van belang op de microscooptafel en beweeg de micropipet richting een cel.

Terwijl de versterker testspanningspulsen genereert, registreert u de weerstand, die zal toenemen zodra de punt de cel raakt.

Om de gigaohm-seal te vormen, schakelt u voorzichtig van positieve naar negatieve druk met behulp van de spuit. De vorming van de seal zal resulteren in een snelle toename van de weerstand tot meer dan 1 gigaohm.

Nu er een cell-attached configuratie is vastgesteld, gaan we overstappen naar een whole-cell configuratie en een experiment uitvoeren!

Herinner u dat een whole-cell configuratie wordt bereikt wanneer het membraan wordt geruptureerd.

Rupturering wordt bewerkstelligd door negatieve druk aan de micropipet toe te voegen.

Zodra het membraan breekt, zal de vorm van de testpuls grote stroomtransiënten vertonen, aangezien het celmembraan nu fungeert als een condensator die door de testpuls wordt opgeladen.

De eigenschappen van een enkel type ionkanaal in een willekeurig neuron kunnen worden onderzocht door de activiteit van andere kanaaltypen farmacologisch te blokkeren.

Een voltage-step protocol wordt gebruikt om ionkanaalstromen te onderzoeken die worden opgewekt door de spanning te wijzigen naar een reeks verschillende holdpotentialen.

De stroom-spanningscurve, of IV-curve, toont de spanningsafhankelijkheid van de stroom die door een ionkanaal vloeit en geeft inzicht in bij welke spanningen het kanaal open of gesloten is.

Laten we nu naar een paar toepassingen kijken om te onderzoeken wat neurowetenschappers met deze techniek kunnen doen.

Soms kunnen ionkanalen in neuronen worden bestudeerd in een niet-cellulaire omgeving.

Hier hebben wetenschappers ionkanaaleiwitten toegevoegd aan een kunstmatig lipidenmembraan om deze kanalen in isolatie te bestuderen.

Deze kanalen kunnen vervolgens worden blootgesteld aan experimentele moleculen, zoals capsaïcine afgeleid van hete pepers, om hun impact op de kanaalactiviteit te bestuderen.

Omdat ze zijn blootgesteld aan de extracellulaire omgeving en een aanzienlijke impact hebben op de cellulaire functie, zijn ionkanalen uitstekende drugtargets. Wanneer testverbindingen worden toegevoegd aan de micropipet of de badoplossingen, kunnen patchclamp-metingen worden gebruikt om direct het effect van geneesmiddelen, zoals nicotine, op de neurale activiteit te testen. Het principe van het aanleggen van negatieve druk om een verzegeling met een hoge weerstand te vormen, is zelfs toegepast om high-throughput-apparaten te construeren, waarmee gelijktijdig van talrijke cellen kan worden gemeten voor toepassingen in drugscreening.

Whole-cell patch clamp is een waardevol instrument om de respons van enkele cellen op stimuli te meten.

Bovendien kunnen gekoppelde metingen worden gebruikt om de impact van neuronale vuring op exciteerbare doelcellen, zoals spieren, te onderzoeken. In dit voorbeeld wordt whole-cell patch clamp gebruikt om de vuring van een motorisch neuron te stimuleren, terwijl gelijktijdig metingen worden verricht bij de spiervezel die het aanstuurt. Er worden duidelijke relaties tussen neuronale excitatie en spieractiviteit waargenomen.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over patch-clampmetingen bekeken, waarin de principes achter de techniek en de stappen voor het uitvoeren van een experiment zijn besproken.

Met zijn uitzonderlijke temporele gevoeligheid voor veranderingen in spanning en stroom zal patch-clampmeting essentieel blijven voor het begrijpen van de biofysica van kanalen en neuronen.

Bedankt voor het kijken!