Name: Isoleren en het gebruik van de afdelingen van Bovine mesenterica en Vein als Bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer het isoleren van rundermesenteriale arteriën en venen voor vasoactiviteitstests met een multimyograaf. Deze methode onderzoekt bloedstroom en voedingsopname in de dunne darm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen Ryan Chaplin en Dr Gregg Rentfrow van de Universiteit van Kentucky Meats Lab en Department of Animal and Food Sciences voor het bieden van mogelijkheden om experimentele weefsels hierin gebruikt te verzamelen.

Procedures die in deze studie niet de goedkeuring van de Universiteit van Kentucky Animal Care en gebruik Comite nodig, omdat er geen levende dieren werden gebruikt. Voor het verzamelen van een monster hier gebruikt, werden alle dieren verdoofd met een captive bolt en exsanguinated. Dit werd uitgevoerd bij een federaal geïnspecteerde slachthuis faciliteit van de Universiteit van Kentucky. Een officiële vertegenwoordiger van de USDA Food Safety and Inspection Dienst voldaan heeft aan alle activiteiten die ging over de levende dieren en de verwerking van het karkas. 1 Bereiding van Instrumentation <ol><li> Om de hoeveelheid tijd tussen de collecties van weefselmonsters voor de start van een experiment, opgezet apparatuur te minimaliseren en voor buffers te bereiden op het verzamelen van experimentele weefsel (of als extra personeel beschikbaar zijn, kunnen deze taken gelijktijdig plaatsvinden). Opmerking: Dit verschaft niet alleen de grootste hoeveelheid tijd dat het weefsel nog levensvatbaar experimenten, maar sommigeexperimenten kunnen worden uitgevoerd voor langere tijd (of er een wens om meerdere experimenten in een dag te voltooien), daarom is het meestal wenselijk om te beginnen zo vroeg mogelijk. </li><li> Zet de bijbehorende computer, gegevens overnames apparatuur, waterbad (voor buffer (s)) en myograaf unit (s). Plaats de kalibratie-apparatuur op het myograaf unit (s) en zet myograaf warmte (ingesteld op 37,5 ° C) en laat eenheden en kalibratie-apparatuur op te warmen tot temperaturen ingesteld. <ol><li> Open een eerder gemaakte grafiek software-instellingen bestand op de computer en start een run (maar niet het verwerven van data). </li></ol></li><li> Warmen de apparatuur gedurende 10 minuten. <ol><li> Start het verwerven van gegevens. </li><li> Nul alle kanalen. </li><li> Controleer en voeren calibratie (indien nodig) voor elk kanaal (4 kanalen per multimyograph) het uit de respectievelijke krachtopnemer die bij dat kanaal naar een door een gecertificeerde gew geleverd 2-gravitatiekracht toegevoerd elektrisch signaal standaardiseren. </li><li> Na kalibratie en een eenheden conversie voltooid zijn, slaan alle volgende data in gram. Dienovereenkomstig aan te passen op basis van wensen van elke afzonderlijke laboratorium; de apparatuur en software staan ​​het gebruik van andere eenheden, zoals milliNewtons en volt. </li></ol></li><li> Zorg ervoor dat de gasleidingen vrij zijn van blokkades en zet gastoevoer (95% O 2/5% CO 2) te (s) eenheden myograaf. Continu vergassen alle buffers (in de myograaf kamers) tijdens de gehele procedure. </li><li> Vul alle myograaf kamers met 70% ethanol en genieten voor de 10 minuten, verwijder de ethanol, en herhaal voor een tweede 10 minuten inwerken. <ol><li> Na het verwijderen van de ethanol, spoel drie keer met gedemineraliseerd water, gevolgd door drie spoelingen met voorbereide buffer (zie hoofdstuk 2 voor buffer voorbereiding), het verlaten van de derde toevoeging van buffer in de kamers. NB: Op dit punt kan de apparatuur inactief in deze toestand blijven tot buffer en weefsel worden voorbereid en personeel staat klaar om verder te gaan met de Experiment. </li></ol></li></ol> 2 Voorbereiding van Buffers <ol><li> Bereid een 1 L Krebs-Henseleit bufferoplossing voor gebruik bij transport en verwerking van weefselmonsters tot eindconcentraties van 11,1 mM D-glucose bereiken; 1.2 mM MgSO4; 1,2 mM KH 2PO 4; 4,7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3,4 mM CaCl2; 24.9 mM NaHCO3. <ol><li> Meng 9,6 g Krebs zouten in ongeveer 900 ml gedeïoniseerd water op een roerplaat. </li><li> Meng in 0,373 g calciumchloride dehydraat gevolgd door 2,1 g natriumbicarbonaat per L buffer gewenst. </li><li> Gas bufferoplossing gedurende 20 min met 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Na gassing, passen pH op 7,05 (filtratie van buffer verhoogt de pH; einddoel pH moet 7,4) en het volume aan te passen tot 1 L. </li><li> Filter steriliseren buffer in een schone autoclaaf 1 L fles media en opslag buffer bij 4 ° C tot aan gebruik. </li></ol></li><li> Maak afzonderlijke Krebs-Henseleit bufferoplossing voor gebruik in myograaf experimenten zoals beschreven in stap 2.1 voor het vervoer Krebs-Henseleit buffer met additionele verbindingen die betrekking hebben op de contractiliteitsstudies. OPMERKING: Typisch 2 L zal volstaan ​​voor experimenten beschreven in dit artikel, maar dit volume moet mogelijk worden verhoogd of verlaagd op basis van de duur van het experiment, het aantal myograaf kamers, en het aantal buffer vervangingen (ten opzichte van de behandeling toevoegingen). <ol><li> Voorafgaand aan de vergassing (stap 2.1.3), voeg 9,1 mg (per L buffer voorbereiding) van desipramine HCl-buffer. </li><li> Bereid een 1,0 pM oplossing van propranolol HCl en voeg 1 ml (per L buffer voorbereiding) van deze oplossing aan de Krebs-Henseleit bufferoplossing. Maak deze buffer op de dag van gebruik en laten myograaf bedrijfstemperaturen (een temperatuur die een 37,5 ° C temperatuur levert in de myograaf). OPMERKING: De desipramine wordt toegevoegd aan de biogene amine heropname mechanismen remmenen laat clearing experimentele toevoegingen uit de buffer de bloedvaten baden sneller optreden. De toevoeging van propranolol voorkomt niet-specifieke binding van behandelingsverbindingen aan receptoren β-adrenerge. </li></ol></li></ol> 3 verzamelen en bereiden van Vasculature <ol><li> Zo spoedig mogelijk, verwijder het maagdarmkanaal van het karkas. Zodra het dier niet meer vertoont elke onvrijwillige reflex, verwijder het hoofd en verbergen en vervolgens verhogen het karkas verticaal. Verwijdering van het maag-ingewanden (slokdarm naar anus) van het karkas moet worden ingevuld door erkende slachthuis personeel (&lt;20 min van de tijd van het verdoven). OPMERKING: Hoe snel, wordt over het algemeen beperkt door de locatie / inrichting waar het darmkanaal wordt verzameld uit en standaard operationele procedures of federaal mandaat procedures gevolgd door het personeel van de faciliteit. <ol><li> In de meeste faciliteiten, voeren manipulaties van het maagdarmkanaalnog apart door verwerking van het karkas die is bestemd voor de voedselvoorziening voeren. Gebruik het dichtstbijzijnde geschikte plaats waar het maagdarmkanaal kan worden genomen en verspreid voor onderzoek. </li></ol></li><li> Zodra het maagdarmkanaal wordt verspreid, identificeren van de dunne darm, de ileocoecaal vouw verbindt de dunne darm blindedarm en de dunne flens proximaal uitstrekt naar de Bauhin vouw (Figuur 1A). <ol><li> Met behulp van een scalpel of mes, zeer licht een insnijding in de mesenteriale membraan in het midden van de dunne flens. Met behulp van twee wijsvingers, botweg ontleden het vet en bindweefsel blootstellen van de mesenteriale vaatstelsel (Figuur 1B) weg. </li></ol></li><li> Uit deze flens of uitstulping in de intestinale mesenterium, ontleden meerdere vestigingen (~ 2 cm lang) van het blootgestelde mesenteriale slagader en ader bundels dat dit gedeelte van het ileum (figuur 1C) ondersteunen. <ol><li> If uzingen een tang om het weefsel te begrijpen, zorg om niet direct te begrijpen of te trekken op de bloedvaten heeft, wanneer ze te verwijderen als een soort van rekken kan schaden en een negatieve weefsel prestaties 14 bewerkstelligen. Verwijdering bloedvat best gedaan door doorsnijden elk uiteinde van het gedeelte te verwijderen en vervolgens snijden langs of evenwijdig aan de nu geïsoleerde sectie. Gemakshalve verwijderen wat omringende weefsel samen met vaartuigen sommige weefsel grijpen met een pincet verschaffen. </li><li> Met een pincet, onderdompelen weefselmonster in een buis met ijskoud Krebs-Henseleit buffer en opgeslagen op ijs tot verwerking kan in het laboratorium. </li></ol></li><li> Plaats weefselmonster op een snijvlak of in een petrischaal en gedeeltelijk onderdompelen in ijskoud Krebs-Henseleit. <ol><li> Met behulp van # 5 juweliers tang, Noyes iris schaar en vergrootglas lamp of ontleden scope (2,5 tot 5.0X vergroting is voldoende), zorgvuldig ontleden weg de omliggende vet en verbve weefsels en scheiden de slagader en ader. Het identificeren van het vaartuig opening aan een uiteinde van de sectie en voorzichtig grijpen de fascia rond het vat met de tang. </li><li> Wordt knippen met een schaar evenwijdig aan het vaartuig door er met de punt van de schaar onder de verhoogde fascia. Na de eerste incisie kan de vet en bindweefsel verder worden losgemaakt van het vat door het kappen beide zijden met een schaar. Zorg ervoor dat de schepen zijn zo schoon mogelijk, terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid tijd die de schepen door te brengen op de bank. </li><li> Terug bloedvaten buizen vers Krebs-Henseleit buffer en bewaar bij 4 ° C (monsters blijven bewaard tot 24 uur na het verzamelen en nog steeds geldige contractiliteit data). </li><li> Met behulp van een scheermesje, slice vaartuig worden gebruikt myograaf in gewenste aantal 2-mm secties (helpt het om een ​​tissue slicer gebruiken vaste doorsneden verkrijgen). </li><li> Onderzoeken elke sectie onder een dissectie scope (12,5X vergroting) om ervoor te zorgen dat elke sectie heeft geen afwijkingen, takken, kleppen, of oppervlakkige schade per ongeluk gedaan tijdens dissectie en reiniging. Vervang de paragraaf vat als er iets abnormaals, tak, klep, of oppervlakkige schade. </li></ol></li><li> WINKEL aanvaardbare gesneden verblijf gedeelten (ondergedompeld in Krebs-Henseleit buffer) op ijs of bij 4 ° C tot klaar voor montage in myograaf kamers (gewoonlijk &lt;30 min). </li><li> Voorzichtig monteren het vaartuig op de myograaf door het invoegen van de steunen door het lumen en het verhogen van de spanning (met behulp van de micropositioner op de myograaf) voorzichtig om niet de schepen boven een 2 tot 3 g lezen rekken. </li><li> Zodra alle kamers zijn bedekt, stofzuigen de buffer van alle kamers en opnieuw vullen met 5,0 ml buffer en start een 15 min timer om de equilibratieperiode en het experiment te beginnen. </li></ol> 4 Experiment <ol><li> Equilibreer alle secties vaartuig gedurende 1,5 uur tot een stabiele res te bereikenting spanning van 1,0 g. <ol><li> Vervang de Krebs-Henseleit incubatiebuffer elke 15 minuten. </li><li> Tijdens de equilibratie constant pas de spanning op de gedeelten bloedvat tot 2 g en laat vervolgens af te ontspannen tot ongeveer 0,80 g. Probeer niet om de vaartuigen te veel ontspannen (ze kunnen afglijden de bergen). Probeer een vlakke basislijn spanning, waar het schip houdt 1 g spanning zonder dat aanpassing te realiseren. </li></ol></li><li> Tijdens de equilibratie bereidt een waterige 1,32 M oplossing van KCl worden gebruikt als referentie. </li><li> Na voltooiing van een voldoende equilibratie voeg 500 ul van de 1,32 M KCl-oplossing resulteren in een 0,12 M oplossing in 5,5 ml oplossing baden het vat. <ol><li> Na de toevoeging van 1,32 M KCl, kan de spanning niet handmatig als de maximale respons van deze toevoeging wordt gebruikt om levensvatbaarheid van het weefsel te evalueren en kan worden gebruikt voor de behandeling van gegevens normaliseren (bijvoorbeeld concentratie antwoorden op een agonist). </li><li> Vervang de buffer in 15-minuten intervallen, totdat de spanning is teruggekeerd naar de basiswaarde van 1,0 g. </li></ol></li><li> Zodra basislijn is bereikt, verandert de buffer en tegelijkertijd begint een 1 min timer. Doe dit voor alle camera&#39;s tegelijk om te voorkomen dat een spreiding van starttijden. <ol><li> Vortex de standaard moet worden toegevoegd en bereiden een reactie voor kamer 1 in de 1 min aftellen. </li><li> Voeg de normen in 25 pi aliquots elke kamer als experiment dicteert (dit houdt de behandeling onder 0,5% van het totale volume). </li><li> Wanneer de laatste standaard is toegevoegd, start een 9 min timer. </li><li> Aan het einde van de 9 min standaard incubatie, verwijder de behandeling bevattende buffer van de kamers en voeg 5,0 ml verse buffer en start de timer 2.5 min. </li><li> Herhaal stap 4.4.4. </li><li> Aan het einde van de tweede 2,5 min spoelen, vacuüm de kamers en voeg verse buffer en 1 min start een timer de aanvang van de secon aftellend standaard additie. </li></ol></li><li> Herhaal deze cyclus voor alle van de dag de standaard toevoegingen. </li><li> Tijdens de laatste standaard toevoeging en de daaropvolgende 9 min incubatie bereiden de 1,32 M KCl referentie-verbinding voor een einde van de referentie-run dosis toevoeging van 500 ul. </li><li> Na de 1 min interval na de laatste behandeling Daarnaast voegen de KCl en start een 9 min timer. OPMERKING: De KCl toevoeging is om de levensvatbaarheid van het weefsel te bevestigen aan het einde van het experiment en het is handig als het toedienen van een behandeling die resulteert in een verwaarloosbare reactie. </li><li> Aan het einde van de laatste 9 min referentieverbinding incubatie, stofzuigen of verwijder buffer van alle van de kamers. Voeg geen verse buffer. Concluderen het experiment. </li><li> Spaar Grafiek bestand, verwijder bloedvat secties en afvoeren, en volg het opruimen protocol (verstrekt door de fabrikant en kan lab specifiek zijn) voor myograaf apparatuur. </li></ol>

<ol><li>Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intestinal+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intestinal blood flow.</a> The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).</li>
<li>Dobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+and+absorption+from+the+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+journal+of+experimental+physiology%22%5BJournal%5D)">Blood flow and absorption from the rumen.</a> Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).</li>
<li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260, 617-619 (1976).</li>
<li>Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-gauge+myograph+for+isometric+measurements+of+tension+in+isolated+small+blood+vessels+and+other+muscle+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmacological%22%5BJournal%5D)">A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations.</a> Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).</li>
<li>Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+small+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Structure and function of small arteries.</a> Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).</li>
<li>Klotz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+vasoconstrictive+potential+of+D-lysergic+acid+using+an+isolated+bovine+lateral+saphenous+vein+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay.</a> Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).</li>
<li>Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vascular+contractility+bioassay+using+bovine+right+ruminal+artery+and+vein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein.</a> Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).</li>
<li>Westendorf, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+ruminal+and+physiological+responses+to+endophyte-infected+tall+fescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dairy+science%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).</li>
<li>Strickland, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Board-invited+review%3A+St.+Anthony%26%2334%3Bs+Fire+in+livestock%3A+causes%2C+mechanisms%2C+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Board-invited review: St. Anthony&#34;s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions.</a> Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).</li>
<li>Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEckert%2C+H+%22Ergot+Alkaloids+and+Related+Compounds%22">Ergot Alkaloids and Related Compounds</a>. B, B. erde, HO, S. child , Springer-Verlag. (1978).</li>
<li>Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+blood+flow+to+peripheral+and+core+body+tissues+in+sheep+and+cattle+induced+by+endophyte-infected+tall+fescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).</li>
<li>Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ergot+alkaloids+on+contractility+of+bovine+right+ruminal+artery+and+vein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein.</a> Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).</li>
<li>Foote, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ergot+alkaloids+from+endophyte-infected+tall+fescue+decrease+reticuloruminal+epithelial+blood+flow+and+volatile+fatty+acid+absorption+from+the+washed+reticulorumen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen.</a> Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).</li>
<li>Hocking, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+mechanical+stretch+on+smooth+muscle+function+in+saphenous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+vascular+surgery%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins.</a> Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).</li>
<li>Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+intestinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+veterinary+practice%22%5BJournal%5D)">Bovine intestinal surgery.</a> Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).</li>
<li>Budras, K. D., Habel, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudras%2C+KD+%22Bovine+Anatomy+An+Illustrated+Text%22">Bovine Anatomy An Illustrated Text</a>. , first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).</li>
<li>Klotz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+lateral+saphenous+vein+serotonin+receptors+from+steers+grazing+endophyte-free%2C+wild-type%2C+or+novel+endophyte-infected+tall+fescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).</li>
<li>Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+exposure+to+ergot+alkaloids+decreases+contractility+of+bovine+mesenteric+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+animal+science%22%5BJournal%5D)">Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature.</a> Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).</li>
</ol>

Vermelding van handelsnaam, eigen product, of bepaalde apparatuur niet een garantie of waarborg door de USDA niet vormt en de goedkeuring, met uitsluiting van andere producten die beschikbaar kunnen zijn op geen enkele wijze.

De eerste uitdaging bij de ontwikkeling van deze bio-assay was de oprichting van een herhaalbare inzamelpunt voor mesenteriale vaatstelsel. Sample ter consistentie kritisch, omdat sommige van de functies van de dunne darm veranderen tijdens de overgang van het jejunum tot het ileum en bijgevolg het mesenterium variëren in een vergelijkbaar patroon. De ileal takken van mesenterica en ader waren de meest gemakkelijk te herkennen door middel van anatomische oriëntatiepunten. Door het lokaliseren van de blindedarm en de vol...

Veranderingen in de bloedtoevoer naar een weefsel bed kan een grote impact hebben op orgaanfunctie hebben. Een primaire functie van de dunne darm opname van voedingsstoffen. Arteriële bloedtoevoer naar het absorberende oppervlak van de darm vereist voor voedingsopname en doorbloeding stijgt op steun voedingsstoffen absorptie digesta beweegt langs het oppervlak 1. Een afname in de bloedstroom kan een vermindering van voedselopname veroorzaken door een afname van de transepitheliale gradiënt 2. Naast nutriënten, kan de dunne darm worden blootgesteld aan secundaire metabolieten, drugs of toxines effect gelokaliseerde bloedstroom in het mesenterium uitoefenen. Bij de herkauwers kunnen verbindingen worden vrijgemaakt uit een voeder (bijvoorbeeld voedingsstoffen zoals aminozuren of toxinen zoals ergot alkaloïden) door fermentatieve processen van de voordarm. Als deze verbindingen overleven de microbiële metabolisme van de pens fermentatie, ze zijn nu beschikbaar voor absorptieof interactie ze door het maagdarmkanaal van het dier. Er zijn een aantal verschillende methoden om de bloedstroom in vivo meten (bijvoorbeeld Doppler inwonende bloed flowmeters, radioactief gemerkt microsferen en indicator-verdunningstechnieken) dat de evaluatie van verschillende experimentele scenario of behandelingen toe. Echter, om informatie met betrekking tot de mechanische of farmacologische eigenschappen van het vasculaire gladde spierweefsel te verkrijgen, methoden bleef beperkt tot grote schepen tot Mulvany en Halpern 3 publiceerde een artikel beschrijft een techniek met behulp van draad gemonteerd vaatbundelring preparaten in myograaf. Sinds de ontwikkeling van deze techniek, wijzigingen blijven worden aan de bijbehorende myograaf systemen die een verscheidenheid van verschillende toepassingen voor de evaluatie van buisvormige structuren voor. Het systeem is ook aangepast aan vaste hengels te gebruiken voor het monteren van grotere schepen 4 waar perfusietechnieken niet gewenst. Vanwege verschillen in vaten van verschillende anatomische oorsprong en onderscheidingen in dezelfde vaten van verschillende diersoorten, de gegevens van schip en het type dier kan niet gemakkelijk worden geëxtrapoleerd over verschillende schepen of hetzelfde schip in verschillende dier soorten 5. Bijgevolg moet apart bioassays worden ontwikkeld en gevalideerd wanneer deze aspecten worden veranderd. Onlangs hebben verschillende bioassays zijn ontwikkeld met deze technologieën voor gebruik bij vee lateraal saphena en rechter pens slagader en ader 6,7. Deze bioassay werd ontwikkeld om specifiek onderzoeken de effecten van ergot alkaloïden hebben voor vasculatuur ondersteunen van de dunne darm. Er werd gemeld dat 50-60% van de gevoede alkaloïden verschijnen in lebmaag inhoud, maar slechts 5% worden teruggevonden in de ontlasting 8. Strickland et al. 9 vermeld in een beoordeling van ergot alkaloïden, dat beschikbare gegevens suggest dat de dunne darm de belangrijkste plaats voor ergopeptine absorptie zijn. Eckert et al. 10 beoordeeld biofarmaceutische aspecten van ergot alkaloïden en verklaarde dat als ze eenmaal kruisen de epitheliale barrière, ergot alkaloïden worden vervoerd door het lymfestelsel naar de subclavia of via mesenterica en in portaal bloed. Rhodes et al. 11 rapporteerde een daling van de bloedtoevoer naar de twaalfvingerige darm en de dikke darm in stuurt nuttigen van een high-endofyt geïnfecteerd (hoog ergotalkaloïde) dieet. Met behulp van de juiste ruminale slagader en ader bioassay, Foote et al. 12 aangetoond dat ergot alkaloïden zijn vasoactieve in ruminale vaatstelsel. Foote et al. 13 vervolgens in vivo aangetoond dat ruminal blootstelling aan ergot alkaloïden leidt dus tot een pens epitheliale bloedstroom. Deze afname in de bloedtoevoer naar het absorberende oppervlak van de pens gelijktijdig een vermindering veroorzaakte nutriënt (vluchtige vetzuren) flux. Gegeven om de kwaliantity van ergot alkaloïden doorgeven van de dunne darm van de voordarm; De hypothese was dat een vergelijkbaar effect op de dunne darm vaatstelsel en de opname van voedingsstoffen zou optreden. Dit noodzakelijk voor de ontwikkeling van de runder proximale ileal mesenterica en ader bioassay.

```html
<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>Een myograph is essentieel voor deze bio-assay, maar er zijn andere beschikbare platforms die volstaan.&nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specifiek voor DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0,22 &#956;m poriegrootte; 45 mm halsmaat</td></tr><tr><td>#5 Jewler&rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Elk merk van pincet kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Elk merk schaar kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Elk merk van dissectielichtmicroscoop volstaat</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>Dit is niet essentieel voor de test, maar vermindert de variatie in lengte tussen secties aanzienlijk en versnelt het snijproces enorm</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>Het is niet nodig om Krebs te kopen, dit kan in huis worden gemaakt</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>
```

isoleren en het gebruik van de afdelingen van bovine mesenterica en vein als bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian maagdarmstelsel worden voortdurend blootgesteld aan verbindingen (gewenste en ongewenste) en die voor de bloedstroom naar en van dat systeem. Veranderingen in bloedstroom naar de dunne darm kan leiden tot effecten op de absorberende functie van het orgel. Bijzondere belangstelling voor gifstoffen bevrijd van voedingsmiddelen door fermentatie en spijsvertering is bij herkauwers als een gebied waar productieve efficiëntie verbeterd kan worden ontwikkeld. De video waaraan deze artikel beschrijft een in vitro bioassay ontwikkeld voor het screenen voor verbindingen vasoactiviteit in geïsoleerde doorsneden van runderen mesenteriale slagader en ader met een multimyograph. Zodra de bloedvaten zijn gemonteerd en geëquilibreerd in de myograaf, kan de bioassay zelf worden gebruikt: als screeningsmethode om de contractiele respons of vaso-activiteit van verbindingen van belang te evalueren; bepalen van de aanwezigheid van type receptor door farmacologisch richten receptoren specifieke agonists; bepalen van de rol van een receptor met de aanwezigheid van een of meer antagonisten; of bepaal mogelijke interacties van verbindingen van belang met antagonisten. Door dit alles worden gegevens verzameld real-time, kan weefsel vanuit een enkel dier blootgesteld aan een groot aantal verschillende experimentele behandelingen (een in vitro voordeel), en vertegenwoordigt vasculatuur aan weerszijden van het capillaire bed een accurate beeld van wat zou kunnen gebeuren in de afferente en efferente bloedtoevoer ondersteunen van de dunne darm.

De bloedvaten gebruikt om de opgenomen resultaten te genereren werden verzameld uit 6 Holstein ossen (425 ± 8 kg) binnen een interval van 3 weken. Een voorbeeld van een typische mesenterica contractiele respons op KCl en behandeling toevoegingen toenemende concentratie is weergegeven in figuur 2. De mate van respons zullen sommige van de grootte van het vaartuig (gecorreleerd met de omvang van het donordier) variëren, maar kan ook worden beïnvloed (negatief) van het onjuist hanteren (rekken) van de sche...

De dunne darm wordt vaak blootgesteld aan giftige stoffen die de bloedstroom kunnen beïnvloeden en een negatieve invloed op de opname van voedingsstoffen. Met een multimyograph en mesenteriale slagader en ader isolaten, verbindingen of toxinen plaats kunnen worden gescreend vasoactiviteit.

Isoleren en het gebruik van de afdelingen van Bovine mesenterica en Vein als Bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Het algemene doel van deze procedure is om dwarsdoorsneden van bovine mesenteriale slagaders en aders in een multim-grafiek te isoleren om het screenen van experimentele verbindingen op hun vaso-activiteit mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een mesenteriaal weefselmonster van het dier te verzamelen. In de tweede stap wordt het monster schoongemaakt en worden de vaten in secties gesneden.Vervolgens worden de secties gemonteerd en geëquilibreerd op de myo graft. In de laatste stap worden de geïsoleerde vaten blootgesteld aan de verbindingen van belang. Uiteindelijk kan deze arterie- en aderbio-assay worden gebruikt om de vaso-activiteit van de verbindingen en de effecten die ze hebben op de bloedstroom in bovine mesenteriale bloedvaten te evalueren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met bestaande methoden zoals het meten van bloedstroom in vivo, is dat met deze techniek weefsel van een enkel dier tegelijkertijd aan meerdere verbindingen kan worden blootgesteld. Hoewel deze methode inzicht kan geven in zeer specifieke dierlijke syndromen die vasoconstrictie kunnen veroorzaken, zoals fescue, toxicose of Ergotisme, kan het ook worden toegepast op andere scenario's die voor onderzoekers interessant kunnen zijn, zoals geneesmiddelen die worden ontwikkeld of natuurlijke producten. Bovendien kan het niet alleen worden toegepast op de vaat van runderen, maar ook op de vaat van vrijwel elke andere zoogdiersoort.Na het verwijderen van de bloedvaten uit het mesenteriale weefsel, gebruikt u een paar pincetten om het weefselmonster op een snijoppervlak te plaatsen en gedeeltelijk onder te dompelen in ijskoud crebs henzel hens aite-buffer. Gebruik vervolgens een juwelierstang nummer vijf, pincetten en geluid, Iris-schaartjes om voorzichtig het vet en bindweefsel rond de vaten te verwijderen. Nadat u de ader en ader hebt gescheiden, identificeert u de vaatopening aan één uiteinde van de sectie en grijpt u voorzichtig de fascie rond het vat met de pincetten.Schuif vervolgens de punt van de schaar onder de verhoogde fascia om een snede te maken met de schaar parallel aan het vat. Na de eerste snede, snijdt u aan beide zijden van het vat om het vet en bindweefsel verder los te maken en om het vat schoon te maken. Plaats de schoongemaakte bloedvaten in een verse buis met Krebs Henzel-lichtbuffer en bewaar de buis op vier graden Celsius gedurende maximaal 24 uur.Wanneer u klaar bent, gebruikt u een weefselserp om consistente dwarsdoorsneden van het gewenste vat te verkrijgen in het gewenste aantal twee millimeter secties, en onderzoek vervolgens elke sectie met een 12,5 x vergroting om ervoor te zorgen dat elke monster geen afwijkingen, takken, kleppen of oppervlakkige schade heeft die tijdens het disseceren en schoonmaken is opgelopen. Bewaar de acceptabele gesneden vaatsecties ondergedompeld in Krebs Henzel-lichtbuffer bij vier graden Celsius gedurende maximaal 30 minuten. Plaats vervolgens voorzichtig de steunen door het lumen van elk monster en gebruik de micro-positioneerder op de myo graft om geleidelijk de spanning te verhogen om het vat op de myo graft te monteren.Zorg ervoor dat u de vaten niet strekt boven een twee tot drie gram lezing. Zodra alle kamers bedekt zijn, vacuüm de buffer uit elke kamer en vul ze opnieuw met vijf milliliter verse buffer. Nadat alle vaatsecties 1,5 uur zijn geëquilibreerd om een stabiele rustspanning van één gram te bereiken bij 500 microliters van 1,32 molair kaliumchloride tot een 0,12 molaire eindconcentratie in de 5,5 milliliter oplossing, wordt het vat gedrenkt.Pas de spanning niet handmatig aan, aangezien de maximale respons op het kaliumchloride zal worden gebruikt om de behandelingsgegevens te normaliseren, vervang de oplossing met verse Krebs Henzel-lichtbuffer in intervallen van 15 minuten totdat de spanning is teruggekeerd naar de basiswaarde van één gram. Zodra de spanning is teruggekeerd naar het basisniveau, voegt u de normen toe in 25 microliter aliquots aan elke kamer volgens het experimentele protocol. Wanneer de laatste standaard is toegevoegd, start u een negen minuten timer.Aan het einde van de incubatie verwijdert u de buffer met behandeling uit de kamers en voegt u vijf milliliter verse buffer toe aan elke kamer. Start vervolgens een 2,5 minuten timer na voltooiing, herhaal deze 2,5 minuten spoeling. Een tweede keer aan het einde van de tweede spoeling, aspibeer de kamers.Vervolgens, na het toevoegen van verse buffer nogmaals, start u een minuut timer om af te tellen tot het begin van de tweede standaarduitgave. Zoals waargenomen in de negen minuten incubatieperioden hier geïllustreerd, zijn er incrementele toenames in de respons op de normen die met de toenemende concentraties van de behandeling, de kaliumchloride-toevoeging aan het einde van het experiment essentieel is, omdat het de levensvatbaarheid van het weefsel bevestigt. Deze bio-assay kan worden gebruikt om de vaso-activiteit van de experimentele verbindingen op de bloedvaten die de voeding leveren aan de dunne darm, evenals op de bloedvaten die de geabsorbeerde voedingsstoffen wegvoeren, te evalueren.Bijvoorbeeld, in dit experiment, was er geen verschil waargenomen in de arteriële of veneuze contractiele reacties na vijf hydroxy tryptamine-behandeling. Omgekeerd was de contractiele respons van de mesenteriale ader op de toenemende concentraties van norepinefrine groter dan die van de mesenteriale ader. Volgens deze procedure zou de methode verder kunnen worden aangepast om agonisten of antagonisten in de buffer op te nemen die van specifiek belang zijn voor de onderzoeker.Dit zou de onderzoeker in staat stellen de betrokkenheid van zeer specifieke receptoren en de mechanismen achter de vasculaire reacties die tijdens het myo-experiment zijn waargenomen, beter te begrijpen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bloedvaten verzamelt, verwerkt en isoleert. Voor een myo-experiment.

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Een geautomatiseerde myography methode voor kracht metingen in geïsoleerde mesenteriale bloedvaten wordt beschreven. Er werken een Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A om reacties te bepalen fenylefrine en extracellulair calcium. De methode zorgt voor consistente bepaling van de isometrische reacties op agonisten in kleine vaten van de diameters van 60 - 300 urn, onafhankelijk van elkaar.

A. mesenterica samentrekking en ontspanning Studies met behulp van geautomatiseerde Wire Myography

De Ex vivo Geïsoleerd Skeletal microvaatjes Voorbereiding Voor het onderzoek van vasculaire reactiviteit

Metingen van KV7 (KCNQ) kaliumkanaal activiteit in geïsoleerde bloedvaten myocyten (met behulp van patch-clamp elektrofysiologische technieken), parallel met metingen van constrictor / dilatator reacties (met behulp van druk myografie) kunnen belangrijke informatie over de rol van KV7 kanalen in het gladde spierweefsel fysiologie en farmacologie.

Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

We presenteren een voorbereiding voor het visualiseren en manipuleren van calcium signalering in de moedertaal, intact microvasculaire endotheel. Endotheliale buizen vers geïsoleerd uit muis weerstand slagaders die skeletspieren behouden in vivo morfologie en dynamische signalisatie binnen en tussen naburige cellen. Endotheliale buizen kunnen worden bereid uit microvaten van andere weefsels en organen.

Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

Pressure myography wordt gebruikt om vasoactiviteit van kleine slagaders die aanhoudende vernauwing ontwikkelen wanneer onder druk te beoordelen. Het manuscript geeft een gedetailleerd protocol te beoordelen geïsoleerde segmenten van kleine mesenterische arteriën van ratten vaatactiviteit en het effect van de intraluminale druk op de vasculaire diameter.

Het beoordelen Myogene Response en vasoactiviteit In Resistance Mesenteriale slagaders behulp Pressure myography

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

De draad myograph techniek wordt gebruikt om vasculaire vlotte spier functies en de scherm nieuwe drugs te onderzoeken. Wij rapporteren een gedetailleerd protocol voor het meten van de isometrische contractility van de muis mesenterische slagader en voor het screenen van de nieuwe skeletspierrelaxantia van vasculaire glad spierweefsel.

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

Het protocol beschrijft het gebruik van draad myography te evalueren van de Transmurale isometrische spanning van mesenterica slagaders geïsoleerd van muizen, met speciale aandacht voor de modulatie door factoren vrijkomen van endothelial cellen en perivasculaire vetweefsel.

Beoordeling van de vasculaire Toon responsiviteit met behulp van geïsoleerde mesenterica slagaders met een focus op modulatie door Perivasculaire vetweefsel

Leer het isoleren van rundermesenteriale arteriën en venen voor vasoactiviteitstests met een multimyograaf. Deze methode onderzoekt bloedstroom en voedingsopname in de dunne darm.

Isoleren en het gebruik van de afdelingen van Bovine mesenterica en Vein als Bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm (Video) | JoVE Journal

Isoleren en het gebruik van de afdelingen van Bovine mesenterica en Vein als Bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm

Meer video's verkennen