Isoleren en het gebruik van de afdelingen van Bovine mesenterica en Vein als Bioassay om te testen voor vasoactiviteit in de dunne darm

Het algemene doel van deze procedure is om dwarsdoorsneden van bovine mesenteriale slagaders en aders in een multim-grafiek te isoleren om het screenen van experimentele verbindingen op hun vaso-activiteit mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een mesenteriaal weefselmonster van het dier te verzamelen. In de tweede stap wordt het monster schoongemaakt en worden de vaten in secties gesneden.

Vervolgens worden de secties gemonteerd en geëquilibreerd op de myo graft. In de laatste stap worden de geïsoleerde vaten blootgesteld aan de verbindingen van belang. Uiteindelijk kan deze arterie- en aderbio-assay worden gebruikt om de vaso-activiteit van de verbindingen en de effecten die ze hebben op de bloedstroom in bovine mesenteriale bloedvaten te evalueren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met bestaande methoden zoals het meten van bloedstroom in vivo, is dat met deze techniek weefsel van een enkel dier tegelijkertijd aan meerdere verbindingen kan worden blootgesteld. Hoewel deze methode inzicht kan geven in zeer specifieke dierlijke syndromen die vasoconstrictie kunnen veroorzaken, zoals fescue, toxicose of Ergotisme, kan het ook worden toegepast op andere scenario's die voor onderzoekers interessant kunnen zijn, zoals geneesmiddelen die worden ontwikkeld of natuurlijke producten. Bovendien kan het niet alleen worden toegepast op de vaat van runderen, maar ook op de vaat van vrijwel elke andere zoogdiersoort.

Na het verwijderen van de bloedvaten uit het mesenteriale weefsel, gebruikt u een paar pincetten om het weefselmonster op een snijoppervlak te plaatsen en gedeeltelijk onder te dompelen in ijskoud crebs henzel hens aite-buffer. Gebruik vervolgens een juwelierstang nummer vijf, pincetten en geluid, Iris-schaartjes om voorzichtig het vet en bindweefsel rond de vaten te verwijderen. Nadat u de ader en ader hebt gescheiden, identificeert u de vaatopening aan één uiteinde van de sectie en grijpt u voorzichtig de fascie rond het vat met de pincetten.

Schuif vervolgens de punt van de schaar onder de verhoogde fascia om een snede te maken met de schaar parallel aan het vat. Na de eerste snede, snijdt u aan beide zijden van het vat om het vet en bindweefsel verder los te maken en om het vat schoon te maken. Plaats de schoongemaakte bloedvaten in een verse buis met Krebs Henzel-lichtbuffer en bewaar de buis op vier graden Celsius gedurende maximaal 24 uur.

Wanneer u klaar bent, gebruikt u een weefselserp om consistente dwarsdoorsneden van het gewenste vat te verkrijgen in het gewenste aantal twee millimeter secties, en onderzoek vervolgens elke sectie met een 12,5 x vergroting om ervoor te zorgen dat elke monster geen afwijkingen, takken, kleppen of oppervlakkige schade heeft die tijdens het disseceren en schoonmaken is opgelopen. Bewaar de acceptabele gesneden vaatsecties ondergedompeld in Krebs Henzel-lichtbuffer bij vier graden Celsius gedurende maximaal 30 minuten. Plaats vervolgens voorzichtig de steunen door het lumen van elk monster en gebruik de micro-positioneerder op de myo graft om geleidelijk de spanning te verhogen om het vat op de myo graft te monteren.

Zorg ervoor dat u de vaten niet strekt boven een twee tot drie gram lezing. Zodra alle kamers bedekt zijn, vacuüm de buffer uit elke kamer en vul ze opnieuw met vijf milliliter verse buffer. Nadat alle vaatsecties 1,5 uur zijn geëquilibreerd om een stabiele rustspanning van één gram te bereiken bij 500 microliters van 1,32 molair kaliumchloride tot een 0,12 molaire eindconcentratie in de 5,5 milliliter oplossing, wordt het vat gedrenkt.

Pas de spanning niet handmatig aan, aangezien de maximale respons op het kaliumchloride zal worden gebruikt om de behandelingsgegevens te normaliseren, vervang de oplossing met verse Krebs Henzel-lichtbuffer in intervallen van 15 minuten totdat de spanning is teruggekeerd naar de basiswaarde van één gram. Zodra de spanning is teruggekeerd naar het basisniveau, voegt u de normen toe in 25 microliter aliquots aan elke kamer volgens het experimentele protocol. Wanneer de laatste standaard is toegevoegd, start u een negen minuten timer.

Aan het einde van de incubatie verwijdert u de buffer met behandeling uit de kamers en voegt u vijf milliliter verse buffer toe aan elke kamer. Start vervolgens een 2,5 minuten timer na voltooiing, herhaal deze 2,5 minuten spoeling. Een tweede keer aan het einde van de tweede spoeling, aspibeer de kamers.

Vervolgens, na het toevoegen van verse buffer nogmaals, start u een minuut timer om af te tellen tot het begin van de tweede standaarduitgave. Zoals waargenomen in de negen minuten incubatieperioden hier geïllustreerd, zijn er incrementele toenames in de respons op de normen die met de toenemende concentraties van de behandeling, de kaliumchloride-toevoeging aan het einde van het experiment essentieel is, omdat het de levensvatbaarheid van het weefsel bevestigt. Deze bio-assay kan worden gebruikt om de vaso-activiteit van de experimentele verbindingen op de bloedvaten die de voeding leveren aan de dunne darm, evenals op de bloedvaten die de geabsorbeerde voedingsstoffen wegvoeren, te evalueren.

Bijvoorbeeld, in dit experiment, was er geen verschil waargenomen in de arteriële of veneuze contractiele reacties na vijf hydroxy tryptamine-behandeling. Omgekeerd was de contractiele respons van de mesenteriale ader op de toenemende concentraties van norepinefrine groter dan die van de mesenteriale ader. Volgens deze procedure zou de methode verder kunnen worden aangepast om agonisten of antagonisten in de buffer op te nemen die van specifiek belang zijn voor de onderzoeker.

Dit zou de onderzoeker in staat stellen de betrokkenheid van zeer specifieke receptoren en de mechanismen achter de vasculaire reacties die tijdens het myo-experiment zijn waargenomen, beter te begrijpen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bloedvaten verzamelt, verwerkt en isoleert. Voor een myo-experiment.