Name: -Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer een reporter-gebaseerde groeiassay voor systematische analyse van eiwitafbraak in gist. Deze methode meet proteolyse via groeikinetiek en biedt een eenvoudig, modulair alternatief voor traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Yuval Reiss en Dr. William Breuer voor het kritisch beoordelen van het manuscript en Omri Alfassy voor de hulp bij de ontwikkeling van de Ura3-GFP screen assay. We danken ook Dr. M. Hochstrasser en Dr. R. Kulka voor plasmiden en stammen. Dit werk werd gefinancierd door de Israelische Academie van Wetenschappen (subsidie 786/08) en door de Verenigde Staten-Israëlische Binationale Wetenschappelijke Stichting (subsidie 2011253).

1. Celkweek <ol><li> Transformeer de geschikte auxotrofe gistcellen, zoals Try467 (tabel 2), met een plasmide dat (a) een URA3 -degron fusie en (b) een additionele metabole merker voor plasmideselectie en onderhoud. Opmerking: Een voorbeeld van een geschikte plasmide-YDpK MET25p-° 1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dit is een gist integratief plasmide dat een fusie-eiwit omvattende ° 1 - een degron afgeleid uit de gisttranscriptiefactor. factor Mat2 17, FLAG epitoop - voor detectie door immunoblotting, Vma12 - een stabiele ER eiwit, en Ura3 15,18 (Figuur 3A). (Zie Tabel 3 voor plasmiden die in deze studie en aanvullende voorbeelden van geschikte plasmiden.) </li><li> Voor plasmideselectie onderhoud houden cellen in agarplaten onder een geschikte synthetische Defined (SD) medium zonder aminozuur selectiemerkers <svan&gt; 19 (bijvoorbeeld ° 1 -UV geselecteerd onder SD-LYS selectief medium gehandhaafd). </li><li> Kweek cellen O / N bij 30 ° C in een geschikt selectief medium voor SD plasmide onderhoud tot een stationaire fase is bereikt. Groeien de cellen in reageerbuizen of in een 96-well plaat, afhankelijk van het aantal te onderzoeken monsters (deel 2). </li></ol> 2. Cel Voorbereiding voor Analyse <ol><li> Bij een klein aantal monsters (N≤15) moeten worden getest, verdun de cellen en het medium vervangen als volgt: <ol><li> Verdun 50 pi cellen van een O / N kweek met 150 pl SD medium per putje in een 96-well plaat (heldere bodem). Let op, het eerste monster wordt aangeduid als blanco bevat medium alleen. </li><li> Bepaal de OD 600-waarden van de monsters in de 96-well plaat met een microplaat lezer. </li><li> Bereken de werkelijke OD 600 in elk putje van de OD 600 lezing van de verdunningsfactor (x4) te vermenigvuldigen, uit which de waarde van de blanko afgetrokken. Normaliseren van de verkregen waarden te delen door 0,55 tot een berekende padlengte van 1 cm volgens de Beer-Lambert wet verkrijgen. Merk deze waarde constant bij het ​​meten van de OD 600 van 200 ul cellen in een standaard 96-putjesplaat. </li><li> Bereken de exacte benodigde volume voor het verkrijgen van gistcellen in bedrag ter OD600 van 0,25 en overgebracht naar een Eppendorf buis. </li><li> Spin down van de cellen met een hoge snelheid (12.000 xg) gedurende 1 min. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml van het geschikte selectieve medium (zie paragraaf 3.1) te verkrijgen OD 600 van 0,25. </li><li> Breng 200 pi van de verdunde stammen een nieuwe put in een 96-well plaat. </li></ol></li><li> Wanneer een groot aantal monsters (N&gt; 15) te testen, verdun de cellen en plaats het medium zonder voorafgaande OD600 metingen als volgt: <ol><li> Breng 10 pl stationaire cellengegroeid O / N in een 96-wells plaat in een nieuwe 96-well plaat met 190 pl (verdunning 1:20) van de geschikte selectieve media (zie paragraaf 3.1). </li></ol></li></ol> 3. Groei Kinetics in Liquid Culture onder Selectief Voorwaarden (Gils) <ol><li> Gebruik de volgende media voor groei metingen met behulp van de Ura3-degron reporter: <ol><li> Voor de positieve controles van groei gist onder niet-beperkende voorwaarden, gebruik plasmide selectieve SD media (zie paragraaf 1.2). Indien geen plasmideselectie vereist, bijvoorbeeld bij gebruik van een integratieve plasmide zoals ° 1 -UV, SD medium dat alle benodigde aminozuren (SD volledig) worden gebruikt. </li><li> Voor experimentele monsters meten groei onder beperkende voorwaarden, gebruik maken van SD-URA medium. </li></ol></li><li> Stel een multimode microplaat lezer. Een incubatietemperatuur van 30 ° C, OD 600 meetintervallen van 15 min, en een orbitaal schudden en lineaire cycli van 1 min zeven min &lt;br /&gt; OPMERKING: Deze dual-mode schudden werd geoptimaliseerd om een ​​homogene verdeling van de cellen te verkrijgen; kunnen evenwel ook andere schudden modes of zelfs geen schudden zo goed werkt. </li><li> Incubeer de cellen bij 30 ° C in een microplaat reader O / N of totdat de cellen de stationaire fase (12-24 uur) bereikt. </li><li> De ruwe data te exporteren naar een spreadsheet-bestand. </li><li> Bepaal gist groeikinetiek behulp MDTcalc, een aangepaste software-programma dat de minimale tijd berekent (in uur) voor de cellen om hun bevolkingsomvang verdubbelen (Minimal Verdubbeling Time (MDT), voor meer informatie zie hoofdstuk 4). </li></ol> 4. Berekening van de Minimal Verdubbeling Time (MDT): Principes van de MDTcalc Algorithm OPMERKING: Principes van het MDTcalc algoritme, met een representatief monster van Try467 gistcellen (tabel 2) gekweekt in SD compleet medium, worden weergegeven in tabel 1 en figuur 1, die een data spreadsheet en groei plots, respectief. <ol><li> Aftrekken OD 600 blanco waarden verkregen in de desbetreffende holte van elk van de verkregen in de monsterhouder metingen. Verdeel de resulterende verschillen met 0,55 (96-well platen) te corrigeren voor de lengte lichtweg. Zet de eindwaarden (tabel 1, Trans.) Tegen de tijd om de werkelijke gist groeicurve (OD 600 / hr) (Figuur 1A) produceren. </li><li> Bereken log 2 (OD 600) voor elk van de getransformeerde waarden van de logaritmische groeifase te zetten in een lineaire curve (Figuur 1B). </li><li> Bereken de helling van 10 tijdstippen interval (N = 10) begint op tijdstip 0 en één tijdpunt bewegen in tot N &lt;10 (tabel 1, Slope Figuur 1C). </li><li> Bereken de inverse waarde van elke helling naar de tijd die de celpopulatie verdubbelen verkrijgen (tabel 1, 1 / Slope Figuur 1C). Bereken de minimale1 / Helling waarde voor de MDT (Figuur 1C Tabel 1, zwarte rechthoek) te bepalen. Extraheer de berekende MDT van cellen in het monster (Tabel 1, 1 / Helling, zwarte rechthoek) vanaf het geselecteerde tijdsinterval (Tabel 1, door rode rechthoek geschetst, Figuren 1B, 1D). OPMERKING: De snelheid van celgroei op SD-URA medium is omgekeerd evenredig met de MDT. </li></ol> 5. Met behulp van MDTcalc <ol><li> Kopieer de aangevulde programma bestanden in een opgegeven map op de computer. </li><li> Zorg ervoor dat de spreadsheet-bestand met de groei van data wordt opgeslagen en gesloten. Open het MDTcalc applicatieprogramma aan de start verschijnt zien. <ol><li> Plaats de benodigde informatie, zoals getoond in Figuur 2: <ol><li> Onder &#39;Bestand pad&#39;, klikt u op de rechthoek aan de rechterkant om de spreadsheet bestand te zoeken. </li><li> Onder &#39;Vel naam&#39;, schrijf de naam spreadsheet waar thij ruwe data zich bevindt. </li><li> Onder &#39;Uitgangspositie&#39;, steekt u de spreadsheet-coördinaat van de tijd 0 van het eerste monster. </li><li> Onder &#39;Time column&#39;, plaatst de brief het definiëren van de locatie van het tijdstip kolom (tijd moet worden voorzien in seconden). </li><li> Onder &quot;lege kolom, plaatst de letter definieert de locatie van de lege kolom (meestal, maar niet noodzakelijk in goede A1 van de 96-well plaat). </li><li> Onder &#39;OD-waarde&#39;, kies de minimale getransformeerd OD 600 waarde die nodig is voor de start van de MDT-berekening (meestal 0,15-0,25). Stel deze waarde in voorkomt berekeningen van MDT voor culturen in lag-fase als gevolg van overmatige verdunning zodat MDT wordt alleen berekend voor monsters die de gedefinieerde OD 600 waarde of hoger bereiken. </li></ol></li><li> Zodra de laatste waarde is ingevoerd, drukt u op de &#39;berekenen&#39; knop aan de onderkant van het scherm. Zorg ervoor dat de voortgangsbalk op de rechter verandert geleidelijk te green. Gebruik de spreadsheet bestand niet openen tijdens het rekenproces. </li><li> De twee reeksen gegevens die automatisch op het scherm bij het voltooien van de MDT berekening in een spreadsheet exporteren. Zorg ervoor dat de gegevens bevat: (a) de MDT waarde voor elk goed dat de minimale OD-waarde test (zoals vermeld in paragraaf 5.2.1.6) en (b) de oorspronkelijke tijdstip van het interval waaruit de MDT werd berekend passeert (Start tijd). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
<li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+the+cell+cycle%3A+with+this+RING+I+do+thee+destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li>
<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li>
<li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica.%2C+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li>
<li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li>
<li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms%3A+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li>
<li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope%2Fendoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li>
<li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li>
<li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li>
<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
<li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li>
<li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuthrie%2C+C+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. 194, Academic Press. (1991).</li>
<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een test op basis van de celgroei voor het bepalen van de relatieve eiwitafbraak prijzen, genoemd &#39;Groeikinetiek in Liquid cultuur onder Selectief omstandigheden&#39; (Gils). De Gils assay heeft een aantal voordelen: Het is eenvoudig in te stellen, data-acquisitie en analyse is eenvoudig en het is uiterst modulair. Bijgevolg kan gils gelijktijdig uitgeoefend op meerdere monsters in een gebruiksvriendelijke multi-well plaat formaat dat kan worden aangepast aan automatisering voor high throughput t...

De ubiquitine-proteasoom degradatie systeem is een belangrijke regulerende machine, die is betrokken bij het handhaven van homeostase eiwitten in alle eukaryoten. De UPS conjugaten eerst meerdere ubiquitine moleculen aan een doeleiwit waarna de poly-ubiquitine-gemerkt eiwit wordt afgebroken door het 26S proteasoom. In de meeste gevallen, de snelheidsbepalende stap voor ubiquitine gemedieerde afbraak beperkt is substraat ubiquitinering, gemedieerd door conjugeren van enzymen E2 en E3 ligeren enzymen (E3 ligasen) 1. Bijgevolg intracellulaire stabiliteit van eiwitten weerspiegelt hun gevoeligheid voor ubiquitine conjugatie en de activiteit van hun verwante ubiquitinering enzymen. E3 ligases zijn de belangrijkste componenten substraat erkenning van de UPS. Als zodanig zijn deze enzymen herkennen degrons in hun substraten die ofwel afwezig of niet blootgesteld in de stal 2 tegenhangers. Bijvoorbeeld, veel regulatoren van de celcyclus must worden gesynthetiseerd en afgebroken in een tijdelijk specifieke manier om voortgang van de celcyclus in orde te houden. De afbraak van deze eiwitten wordt vaak geregeld door fosforylering-gemedieerde signaaltransductie gereguleerde kinasen 3,4. Aan de andere kant, zijn afwijkend gevouwen eiwitten herkend door cryptische degrons. Dit zijn gebieden die normaal verborgen in de natieve structuur worden blootgesteld aan structuur verstoring. Dergelijke degrons omvatten hydrofobe domeinen 5-7 en intrinsiek ontvouwen segmenten 8. Aangezien de rudimentaire ontdekking van het ubiquitine-systeem eiwitafbraak en karakterisering van de fundamenten in reticulocyten-lysaten 9, gist genetica was instrumenteel ontdekken vele componenten van het ubiquitine systeem 10. Het succes van gist als modelorganisme voor systematische analyse van eiwitafbraak door de UPS is vooral te wijten aan het feit dat de UPS hoogly geconserveerd in alle eukaryoten 4, in combinatie met zeer geschikt zijn als een experimenteel systeem. Inderdaad, gist gebaseerde systemen algemeen gebruikt om de werkingsmechanismen van de ubiquitinering machine ontcijferen. Studeren eiwitafbraak door biochemische middel meestal vereist voorbereiding van cel extracten. Terwijl dierlijke cel eiwitten onder relatief milde omstandigheden dat eiwit interacties en functie behouden kunnen worden geëxtraheerd, de aanwezigheid van een stevige celwand van gist 11 zijn aanmerkelijk zwaardere verstoring voorwaarden eiwit herstel kunnen beïnvloeden. Sterker nog, verschillende procedures voor gistcel verstoring verschillen aanzienlijk in hun mogelijkheden om intacte eiwitten herstellen in hoeveelheden die hun relatieve cellulaire overvloed correct voor te stellen. Verder onnauwkeurigheid is inherent aan de verschillende methoden voor het bepalen afbraaksnelheden van specifieke eiwitten: Metabolisch labelen based &#39;pulse-chase experimenten van gevolgd door immunoprecipitation, specifieke eiwitten 12 isoleren, is vaak niet strikt kwantitatief. Dus, als afbraak van eiwitten wordt vergeleken met deze methode, extra voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van de resultaten. Om dit nadeel te omzeilen, kan een alternatief cycloheximide (CHX) chase assay worden gebruikt 12. In deze test wordt de vertaling inhibitor toegevoegd aan celculturen en temporele veranderingen in eiwit steady-state niveaus worden vervolgens gecontroleerd. Niettemin is het gebruik van CHX beperkt tot eiwitten met relatief korte halfwaardetijden (&lt;90 min), de inhibitie van de eiwitsynthese langdurige cytotoxisch. Met name beide bovengenoemde assays vereisen het gebruik van eiwit-specifieke antilichamen, die niet altijd beschikbaar zijn. Om deze technische beperkingen te overwinnen, hebben de onderzoekers verschillende benaderingen die niet celextractie en directe eiwit behandeling nodig hebben ontwikkeld. Een benadering is gebaseerd op de vaststelling van auxotrofe yeast stammen, verkregen door deletie van genen die coderen voor essentiële metabole enzymen. Dergelijke genen omvatten HIS3, LEU2, LYS2 en TRP1, coderen voor enzymen die nodig zijn voor aminozuur biosynthese en URA3 dat OMP decarboxylase codeert (Ura3), een enzym van pyrimidine biosynthese ribonucleotide. Ura3 is op grote schaal gebruikt in de eiwitafbraak studies. In deze testen constitutieve expressie van Ura3 redt groei van ura3 cellen in uracil-deficiënt medium 13. Derhalve gedestabiliseerd Ura3 door de fusie van een degron kan celgroei verspilling van minimaal medium zonder uracil. Deze werkwijze is gebruikt in diverse eiwitafbraak onderzoeken, inclusief de identificatie van determinanten degradatie 5, E3 ligasen 14 en hulpstoffen ubiquitinering factoren 15 en de ontdekking van nieuwe UPS degrons 16. Al deze methoden celgroei op agarplaten als assay uitlezing. Echter, tHij groei criterium (positieve / negatieve groei), terwijl robuust en efficiënt is meestal kwalitatieve en niet kwantitatieve informatie die belangrijk is voor het evalueren potentie een degron of de relatieve bijdrage van de verschillende hulpstoffen afbraak factoren verschaffen. We hebben daarom en gebruikt gistvectoren en selectie mogelijk systematische en kwantitatieve analyse van eiwitafbraak door de URA3 -degron fusiesysteem. Het protocol is gebaseerd op een eenvoudig te hanteren assay die Groeikinetiek meet in vloeibare kweek onder selectieve omstandigheden (Gils) en het genereren van standaard groeicurves. Gist groei kinetiek worden gekenmerkt door drie fasen - de vertraging, de exponentiële (log) en de stationaire fase. Berekening van gist replicatie kinetiek gedurende de log-fase onder selectieve omstandigheden, die wordt bepaald door de niveaus van expressie van het Ura3-degron, geeft een onbevooroordeelde kwantitatieve meting of eiwitafbraak. Deze methode kan worden toegepast voor het meten en vergelijken van afbraaksnelheden van meerdere UPS substraten gelijktijdig meerdere stammen en onder verschillende omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>Difco yeast nitrogen base w/o amino acids en ammonium sulfate</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>Voor gistgroei op SD minimaal media.&nbsp; Aminozuren die geleverd moeten worden zijn: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Fenylalanine, Threonine, Tryptophan</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Aminozuren</td><td>Hoogste beschikbare zuiverheid&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-wells platen</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Elk ander compatibel merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Cyclohexamide&nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Werkconcentratie 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO-serie</td><td>Tecan</td><td></td><td>Voor gistincubatie en OD600 metingen. Elke andere compatibele temperatuur-gecontroleerde lezer kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>Experimentele software</td></tr></tbody></table>

-reporter gebaseerd growth assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Eiwitafbraak door de ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) is een belangrijk regulerend mechanisme voor proteïne homeostase in alle eukaryoten. De standaard aanpak voor het bepalen van intracellulaire eiwitafbraak vertrouwt op biochemische assays voor het volgen van de kinetiek van eiwit daling. Dergelijke methoden zijn vaak omslachtig en tijdrovend en derhalve niet vatbaar experimenten ter beoordeling van verschillende substraten en afbraakcondities. Als alternatief hebben celgroei gebaseerde testen ontwikkeld die, in hun conventionele formaat eindpunt assays die niet kwantitatief bepalen relatieve veranderingen in eiwitniveaus. Hier een methode die getrouw bepaalt veranderingen in eiwitafbraak tarieven koppelen ze gistcel-groeikinetiek beschrijven we. De methode is gebaseerd op een vast selectiesysteem waarbij uracil auxotrofie van URA3 -deleted gistcellen wordt gered door een exogeen reportergen expressie, Bestaande uit een fusie tussen de essentiële URA3-gen en een degradatie determinant (degron). De reporter proteïne is ontworpen zodat de synthese constant is terwijl de afbraak wordt bepaald door de degron. Zoals celgroei in uracil-deficiënt medium evenredig met de relatieve niveaus van Ura3, groeikinetiek zijn volledig afhankelijk van de reporter eiwitafbraak. Deze methode meet nauwkeurig veranderingen in intracellulaire eiwitafbraak kinetiek. Het wordt toegepast op: (a) Bepaling van de relatieve bijdrage van bekende ubiquitine conjugeren factoren proteolyse (b) E2 conjugeren enzym structuur-functie analyse (c) de identificatie en karakterisatie van nieuwe degrons. Toepassing van de degron- URA3 gebaseerde systeem overstijgt het veld eiwitafbraak, als het kan worden aangepast aan het volgen van veranderingen van eiwitten die samenhangen met functies van andere moleculaire processen.

Onderzoeken de rol van enzymen van de Doa10 route in de afbraak van een reporter substraat Om de geldigheid van de GILS werkwijze werd vergeleken met een traditionele degradatie assay te testen. Dit experiment evalueert de relatieve bijdrage van componenten van de ER-membraan gelokaliseerde Doa10 E3-ligase complex 20,21 de afbraak van het eiwit kwaliteitscontrole reporter substraat Deg1- VU (Figuur 3A). De Deg1- VU plasmide geïnt...

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Het algemene doel van deze procedure is om de variaties in eiwitafbraaksnelheden op een systematische manier te bepalen door ze te koppelen aan de kinetica van gistgroei in vloeibare cultuur. Dit wordt bereikt door eerst cellen te kweken die een reportereiwit uitdrukken, bestaande uit een afbraaksignaal gekoppeld aan een metabolisch marker, overnacht tot stationaire fase in een geschikt selectief medium. Vervolgens wordt de optische dichtheid van de cellen gemeten om de groeikinetiek van de cellen te bepalen, en vervolgens wordt de minimale verdubbelingstijd van de cellen tijdens de logfase berekend uit de groeikinetiek met behulp van een speciaal softwareprogramma.Uiteindelijk kan de berekende minimale verdubbelingstijd worden gebruikt om variaties in de eiwitafbraakkinetiek te definiëren. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals cyclamate of pulse chase afbraakassays is dat onze techniek eenvoudig is om op te zetten. De gegevensverwerving en -analyse zijn eenvoudig, en het ontwerp van het essay is uiterst modulair.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het eiwitafbraakveld, zoals welke elementen nodig zijn voor misvouwde eiwitherkenning door het ubiquitine-eiwitsysteem. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik een screening wilde doen om de eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij ubiquitineverwijdering uit hun subset. Dus ontwikkelde ik een eenvoudige manier om meerdere monsters te vergelijken Om de cellen voor te bereiden op de analyse.Begin door de geschikte ox atrofe gistcellen, zoals TRY 4 67, te transformeren met een plasmide dat een U drie Deron-fusie en een extra metabolisch marker bevat voor plasmideselectie en -onderhoud. Voor plasmideselectie en -onderhoud worden de cellen gekweekt op agarplaten onder een geschikt synthetisch gedefinieerd medium, zonder selectiemarkers voor aminozuren, overlevende kolonies worden in patches overgebracht, cellen uit patches worden overgebracht in vloeibaar medium en overnacht geïncubeerd bij 30 graden Celsius tot een stationaire fase is bereikt. Vervolgens worden voor 15 monsters of minder, 50 microliter van de cellen uit de overnachtcultuur verdund met 150 microliter van synthetisch gedefinieerd medium per put.In een 96-wellplaat met doorzichtige bodem, gebruikt u een microplaatlezer om de OD 600-waarden van de monsters te bepalen. Bereken vervolgens het exacte volume dat nodig is om gistcellen te verkrijgen in een hoeveelheid gelijk aan een OD 600 van 0,25, centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij 12.000 keer G en kamertemperatuur, suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter van het geschikte selectieve medium om een OD 600 van 0,25 te verkrijgen en breng 200 microliter van het verdunde stam over in één put van een nieuwe 96-wellplaat wanneer er meer dan 15 monsters moeten worden getest. Breng 10 microliter van de overnacht gekweekte stationaire cellen over in één put van een nieuwe 96-wellplaat die 190 microliter van het geschikte selectieve medium bevat om de groeikinetiek van de getransformeerde gistcellen onder selectieve omstandigheden te meten.Stel vervolgens een multi-modus microplaatlezer in op een incubatietemperatuur van 30 graden Celsius, OD 600-meetintervallen van 15 minuten en orbitale en lineaire schudcycli van één minuut om de zeven minuten. Vervolgens worden de cellen gedurende 12 tot 24 uur bij 30 graden Celsius in de Microplaatlezer geïncubeerd. Wanneer de cellen de stationaire fase hebben bereikt, worden de ruwe gegevens geëxporteerd naar een spreadsheetbestand om de gistgroeikinetiek te bepalen met behulp van MDT Calc.Zorg ervoor dat het spreadsheetbestand met de groeigegevens is opgeslagen en gesloten. Open vervolgens het MDT Calc-applicatieprogramma onder bestandspad. Klik op het rechthoekje om het spreadsheetbestand te lokaliseren onder bladnaam.Voer de naam van het spreadsheet in waar de ruwe gegevens zich bevinden onder startpositie. Voer de spreadsheetcoördinaat van tijd, nul van het eerste monster in onder tijdkolom. Voer de letter in die de locatie van de tijdpuntkolom in seconden definieert onder lege kolom, voer de letter in die de locatie van de lege kolom definieert.Bijvoorbeeld de A een put van de 96-wellplaat.Volgende. Kies onder OD-waarde de minimale getransformeerde OD 600-waarde die vereist is voor het starten van de MDT-berekening. Gewoonlijk 0,15 tot 0,25 om ervoor te zorgen dat de MDT alleen wordt berekend voor de monsters die de gedefinieerde D 600-waarde of hoger bereiken.Zodra de laatste waarde is ingevoerd, klikt u op de berekenen-knop en bevestigt u dat de voortgangsbalk aan de rechterkant geleidelijk groen wordt. Exporteer ten slotte de twee sets gegevens die automatisch op het scherm verschijnen na voltooiing van de MDT-berekening naar een nieuwe spreadsheet. Bevestig dat de gegevens de MDT-waarde voor elke put bevatten die de minimale OD-waardetest doorstaan en de starttijd van het interval waaruit de MDT is berekend in dit representatieve experiment.De relatieve verschillen in de kinetica van eiwitafbraak tussen het wild type en verschillende mutante stammen werden aanvankelijk vergeleken wild type U BBC zes, delta UBC zeven delta, of DOA 10 delta cellen die D een VMAU drie uitdrukken, werden gekweekt op synthetisch gedefinieerd compleet medium. Vervolgens om de gills te meten, werden de cellen gewassen en geïncubeerd in synthetisch gedefinieerd media. Min uracil vergelijkbare groeicurven en berekende MDT werden waargenomen voor alle stammen die in synthetisch gedefinieerd compleet medium werden gekweekt, wat de mogelijkheid uitsloot dat de deletie van een van de onderzochte genen de celgroei beïnvloedt.In tegenstelling daarmee resulteerde incubatie in synthetisch gedefinieerd media minus uracil in een slechte groei van wildtypecellen, terwijl slechts een kleine groeifout werd waargenomen in de mutante stammen. UBC zeven is absoluut vereist voor DEG een VMAU drie afbraak waardoor een nauwkeurige beoordeling mogelijk is van zelfs de gedeeltelijke effecten van verschillende E twee mutanten. Dienovereenkomstig worden snelle groeikinetiek waargenomen in cellen die UBC zeven uitdrukken met de actieve plaatsmutanten, C 89

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze voor ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen te volgen beschreven. Een degron-gedestabiliseerd GFP-(GFP-dgn) en een stabiele GFP-fusie-eiwit dgnFS gegenereerd en wordt getransduceerd in de cel met een lentivirale vector expressie. Deze techniek maakt het mogelijk om een ​​stabiel GFP-dgn/GFP-dgnFS expressie cellijn waarin ubiquitine-proteasoom activiteit gemakkelijk worden bepaald onder toepassing epifluorescentie of flowcytometrie.

Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein

In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire "labels" voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

De genetische reportertest is een goed gevestigd en krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de relatie tussen DNA-sequenties en hun gen-regulerende activiteiten. Het koppelen van kandidaat-regulerende elementen aan reportergenen die identificerende sequentietags dragen, maakt massale parallelisatie van deze tests mogelijk.

Massively Parallel Reporter Testen in gekweekte zoogdiercellen

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Dit protocol beschrijft de kwantitatieve luminescerende detectie van eiwitafbraakkinetiek in levende cellen die zijn ontworpen met CRISPR / Cas9 om antilichaamvrije endogene eiwitdetectietag tot expressie te brengen die is gefuseerd tot een doeleiwit. Gedetailleerde instructies voor het berekenen en verkrijgen van kwantitatieve afbraakparameters, snelheid, Dmax, DC50 en Dmax50 zijn inbegrepen.

High-Throughput cellulaire profilering van gerichte eiwitafbraakverbindingen met behulp van HiBiT CRISPR-cellijnen

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Leer een reporter-gebaseerde groeiassay voor systematische analyse van eiwitafbraak in gist. Deze methode meet proteolyse via groeikinetiek en biedt een eenvoudig, modulair alternatief voor traditionele technieken.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Meer video's verkennen